CN109554345A - 一种将人胰腺癌组织分散为单个活细胞的消化液及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种将人胰腺癌组织分散为单个活细胞的消化液及其方法，属单细胞分析和细胞培养领域，主要是通过Collagenase Type IV、Dispase、DNase I三种酶混合配制的消化液对胰腺癌组织进行处理后，进行离心去死细胞等操作，短时间内，获得高纯度高活性的单个胰腺癌细胞。本发明使用的试剂为常用分子细胞生物学试剂，所用耗材也是常见细胞培养耗材，价廉易得，有效降低了成本；整个操作过程简单，无需特殊仪器设备，普通实验室均可进行，具有很强的实用性。

Description

一种将人胰腺癌组织分散为单个活细胞的消化液及其方法
技术领域
本发明属单细胞分析和细胞培养领域，具体涉及将胰腺癌组织分散为单个活细胞的试剂和方法。
背景技术
胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其恶性程度很高，中位总生存率6-12个月，诊断和治疗很困难、预后也很差，5年生存率＜7％，是预后最差的恶性肿瘤之一。近年来，其发病率和死亡率明显上升，预估到2030年，胰腺癌可能上升为肿瘤死亡原因的第二位。为了研究胰腺癌的肿瘤生物学特性，科学家们常利用手术或活检组织为研究起始材料，一方面可直接利用新鲜组织进行相关研究，另一方面可通过将新鲜癌组织分散为单个活细胞再进行肿瘤细胞的培养和单细胞分析。尤其是近年来人们发现，原代细胞能够更好地模拟肿瘤的真实情况，且在单细胞层面进行DNA、RNA、蛋白质和形态学分析更能揭示肿瘤的生物学特性，从而为临床进行早期诊断、疗效评估、预后判断、药物研发和主动监测寻找新的生物标志物和方法。而要进行单细胞分析，首要的条件就是从胰腺癌组织中获得活的单细胞，因此如何快速高效的分散新鲜胰腺癌肿瘤组织并获得高活性的单细胞非常关键。
目前，已有一些用于胰腺癌组织分散为单细胞的方法和试剂，如Boj等(Cell，2015.160(1-2)：324-38)采用机械剪切联合II型胶原酶(Collagenase type II)，37℃孵育16hr后，再用胰酶(TrypLE)37℃消化15min进行分散人胰腺癌组织；Li等(Cancer Res，2007.67(3)：1030-7)采用机械剪切联合IV型胶原酶(Collagenasetype IV)，37℃孵育2.5-3hr，期间每15-20min，用10ml吸管吹打促进消化，进行分散人胰腺癌组织，孵育结束后用40μM滤器过滤细胞悬液；Kim等(Nat Protoc，2009.4(11)：1670-80)采用机械剪切联合IV型胶原酶(Collagenase type IV)，37℃孵育2-2.5hr，期间每20min，用10ml吸管吹打促进消化的方式，进行分散异种移植的人胰腺癌组织，70μM滤器过滤细胞悬液后用红细胞裂解液(RBC lysisbuffer)去除红细胞，1200rpm离心收集胰腺癌细胞，再用40μM滤器过滤细胞悬液；Rasheed等(J Vis Exp，2010.(43)：e2169)采用机械剪切联合IV型胶原酶和中性酶(dispase)，37℃孵育2hr，期间每20min间断涡旋1min促进消化的方式，进行分散异种移植的人胰腺癌组织，孵育结束后最大速度涡旋1min，70μM滤器过滤细胞悬液后用Ficoll-Paque Plus去除细胞碎片和死细胞，450xg离心收集细胞；美天旎公司则开发了一款适用于所有人类肿瘤的人肿瘤分散试剂盒，该试剂盒需使用美天旎自动或半自动组织处理器(gentleMACS Dissociator)及其耗材，总时长约3-5hr。
虽然现有技术中已经有将新鲜胰腺癌组织分散为单个活细胞的方法和相关仪器试剂，但现有的技术方法和仪器试剂用于人新鲜胰腺癌组织分散为单个活细胞的整个分散时间太长，一般需要2-16hr；所得到的单个细胞活性仅在32～61％，细胞的纯度在38～60％.，且目前使用的仪器设备和试剂耗材非常昂贵。
发明内容
针对目前用于人新鲜胰腺癌组织分散为单个活细胞的技术方法耗时长；所得到的单个细胞活性和纯度不高；个别方法需要昂贵的仪器设备和试剂耗材，无法在普通实验室完成的问题，本发明提供一种短时间内，获得高纯度高活性的单个癌细胞的方法，为进一步的单细胞分析和细胞培养提供材料。
主要是利用Collagenase Type IV、Dispase、DNase I三种酶混合配制的消化液对胰腺癌组织进行消化后，再利用相应滤器过滤和离心去除未消化组织块、细胞碎片和死细胞等操作。采用本发明在短时间内制备高活性高纯度的人胰腺癌单个细胞方法为：
(1)配制消化液：按照Collagenase Type IV、Dispase、DNase I三种酶的浓度配比为(300～440)：(1～2)：(20～40)配置消化液。
具体的按照50～300U/ml的Collagenase Type IV、0.1～5.0U/ml的Dispase、2～30U/ml的DNase I的终浓度混合配制。理想的酶浓度分别为：Collagenase TypeIV120～220U/ml、Dispase 0.5～1.0U/ml、DNase I 10～20U/ml。最佳条件是Collagenase Type IV120U/ml、Dispase 0.8U/ml、DNase I15U/ml。
(2)机械分离：取新鲜胰腺癌组织机械剪碎后加入消化液消化；
(3)酶消化：在36.0℃～37.0℃下震荡孵育15～60min，期间每5～15min用吸管吹打8～15次，并用2500～3000rpm间断涡旋1～1.5min；
(4)终止消化：孵育结束后，用吸管充分吹打，4℃，800～1500rpm离心，清洗过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上，进行观察。
(5)细胞活力和纯度测定：取10ul细胞悬液，台盼蓝染色后，用血球计数仪或细胞计数仪测定细胞活力并计算细胞纯度。
(6)去除死细胞和细胞碎片：添加Ficoll-Paque Plus去除细胞碎片和死细胞，300～450x g离心收集细胞。
进一步的，步骤(2)中新鲜胰腺癌组织机械剪碎的具体操作为将新鲜胰腺癌组织0.01～1g至无菌离心管中，置于冰水浴中，将组织彻底剪碎至0.1～2mm3大小；
进一步的，步骤(2)中加入消化酶消化的操作为：将剪碎的胰腺癌组织加入1ml消化液，转移至离心管，加入1～5ml消化液，用巴氏德吸管将肿瘤组织悬液反复研磨5～10次；
进一步的，步骤(3)用3000rpm间断涡旋1min。
进一步的，步骤(4)的具体步骤为孵育结束后，用吸管充分吹打，4℃，800～1500rpm离心5min，PBS洗2次，20～70um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
有益效果
(1)本发明使用的试剂为常用分子细胞生物学试剂，所用耗材也是常见细胞培养耗材，价廉易得，有效降低了成本；整个操作过程简单，无需特殊仪器设备，普通实验室均可进行，具有很强的实用性；
(2)缩短全过程的操作时间，整个过程不超过一个小时，所获得单细胞活性在87％～96％，细胞纯度可达85％～95％，既缩短了分离纯化时间又大大提高了细胞的活性和纯度。
附图说明
图1示出了实施例一的细胞计数仪测定结果；
图2示出了实施例二观察消化情况；
图3示出了实施例二的细胞计数仪测定结果；
图4示出了实施例三的细胞计数仪测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种人新鲜胰腺癌组织分散为单个活细胞的试剂和方法，该方法所用的试剂耗材及仪器为：
(1)试剂原料：
人新鲜胰腺癌组织来源于离体的病人胰腺癌组织；
联合IV型胶原酶(Collagenase Type IV)购自Sigma-Aldrich，商品号C5138；
中性酶(Dispase)购自Sigma-Aldrich公司，商品号D4693；
DNA酶(DNase I)购自Roche公司，商品号10104159001；
磷酸缓冲盐溶液(PBS)、台盼蓝染料；
(2)器械：眼科剪、眼科镊、有齿镊、平口镊、小中号手术剪；
(3)耗材：15ml离心管、1.5离心管、无菌滤器、巴氏德吸管；
(4)仪器：离心机、水浴锅、细胞计数仪。
实施例1
采用本发明在短时间内制备高活性的人胰腺癌单个细胞的方法为：
(1)配置消化液，按照120U/ml的Collagenase Type IV、0.8U/ml的Dispase、15U/ml的DNase I混合均匀，备用。
(2)机械分离：取新鲜胰腺癌组织100mg至1.5ml无菌离心管中，置于冰水浴中，用眼科剪将组织彻底剪碎至0.1～2mm3，加入已配制好的消化液1ml，转移至15ml离心管，用巴氏德吸管将肿瘤组织悬液反复研磨8次。
(3)酶消化：在37℃下震荡孵育15min进行消化，期间每5min用5ml吸管吹打10次，并最大速度间断涡旋1min。
(4)终止消化：孵育结束后，用5ml吸管充分吹打，4℃ 800rpm离心5min，弃上清，PBS洗2次，40um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
(5)显微镜观察结果：取少量细胞镜下观察消化情况，并测量单细胞大小。
(6)细胞活力测定：取10ul细胞悬液，台盼蓝染色后，细胞计数仪测定细胞活力并计算细胞纯度，如图3所示：细胞总数(Total count)为1.20×106cells/ml；活细胞数(Livecount)为1.15×106cells/ml。
测得本发明的消化时间为15min，细胞纯度为95％，细胞活力(Live cells)为96％(如图1所示)。
实施例2
(1)配置消化液，按照50U/ml的Collagenase Type IV、0.1U/ml的Dispase、2U/ml的DNase I混合均匀，备用。
(2)机械分离：取新鲜胰腺癌组织10mg至1.5ml无菌离心管中，置于冰水浴中，用眼科剪将组织彻底剪碎至0.1～2mm3，加入已配制好的消化液1ml，转移至15ml离心管，用巴氏德吸管将肿瘤组织悬液反复研磨10次。
(3)酶消化：在37℃下震荡孵育15min进行消化，期间每5min用5ml吸管吹打10次，并最大速度间断涡旋1min。
(4)终止消化：孵育结束后，用5ml吸管充分吹打，4℃800rpm离心5min，弃上清，PBS洗2次，40um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
(5)显微镜观察结果：取少量细胞镜下观察消化情况，并测量单细胞大小(如图2所示)。
(6)细胞活力测定：取10ul细胞悬液，台盼蓝染色后，细胞计数仪测定细胞活力，如图3所示：细胞总数(Total count)为2.27×106cells/ml；活细胞数(Live count)为2.02×106cells/ml。
测得本发明的消化时间为60min，细胞纯度为85％，细胞活力(Live cells)为89％。
实施例3
(1)配置消化液，按照300U/ml的Collagenase Type IV、5U/ml的Dispase、30U/ml的DNase I混合均匀，备用。
(2)机械分离：取新鲜胰腺癌组织1000mg至1.5ml无菌离心管中，置于冰水浴中，用眼科剪将组织彻底剪碎至0.1～2mm3，加入已配制好的消化液1ml，转移至15ml离心管，用巴氏德吸管将肿瘤组织悬液反复研磨10次。
(3)酶消化：在37℃下震荡孵育30min进行消化，期间每15min用5ml吸管吹打10次，并最大速度间断涡旋1min。
(4)终止消化：孵育结束后，用5ml吸管充分吹打，4℃800rpm离心5min，弃上清，PBS洗2次，70um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
(5)显微镜观察结果：取少量细胞镜下观察消化情况，并测量单细胞大小，测得细胞成团为26％。在次进行消化15min，30um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
(6)细胞活力和纯度测定：取10ul细胞悬液，台盼蓝染色后，用细胞计数仪测定细胞活力并计算细胞纯度，如图4所示：细胞总数(Total count)为7.54×106cells/ml；活细胞数(Live count)为6.57×106cells/ml。。
测得本发明的消化时间为45min，细胞纯度为88％，细胞活力(Live cells)为87％。
实施例4
(1)配置消化液，按照120U/ml的Collagenase Type IV、0.5U/ml的Dispase、10U/ml的DNase I混合均匀，备用。
(2)机械分离：取新鲜胰腺癌组织10mg至1.5ml无菌离心管中，置于冰水浴中，用眼科剪将组织彻底剪碎至，加入已配制好的消化液lml，转移至15ml离心管，用巴氏德吸管将肿瘤组织悬液反复研磨8次。
(3)酶消化：在37℃下震荡孵育30min进行消化，期间每15min用5ml吸管吹打10次，并最大速度间断涡旋1min。
(4)终止消化：孵育结束后，用5ml吸管充分吹打，4℃800rpm离心5min，弃上清，PBS洗2次，50um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
(5)显微镜观察结果：取少量细胞镜下观察消化情况，并测量单细胞大小。
(6)细胞活力测定：取10ul细胞悬液，台盼蓝染色后，细胞计数仪测定细胞活力。
测得本发明的消化时间为30min，细胞纯度为93％，细胞活力为95％。
实施例5
(1)配置消化液，按照220U/ml的Collagenase Type IV、1U/ml的Dispase、20U/ml的DNase I混合均匀，备用。
(2)机械分离：取新鲜胰腺癌组织1000mg至1.5ml无菌离心管中，置于冰水浴中，用眼科剪将组织彻底剪碎至，加入已配制好的消化液5ml，转移至15ml离心管，用巴氏德吸管将肿瘤组织悬液反复研磨8次。
(3)酶消化：在37℃下震荡孵育50min进行消化，期间每15min用5ml吸管吹打10次，并最大速度间断涡旋1min。
(4)终止消化：孵育结束后，用5ml吸管充分吹打，4℃800rpm离心5min，弃上清，PBS洗2次，50um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
(5)显微镜观察结果：取少量细胞镜下观察消化情况，并测量单细胞大小。
(6)细胞活力测定：取10ul细胞悬液，台盼蓝染色后，细胞计数仪测定细胞活力。
测得本发明的消化时间为50min，细胞纯度为91.5％，细胞活力为93％。

Claims (11)

1.一种将人胰腺癌组织分散为单个活细胞的消化液，包括Collagenase Type IV、Dispase、DNase I，其特征在于，Collagenase Type IV、Dispase、DNase I三种酶的浓度配比为300～440：1～2：20～40。
2.根据权利要求1所述的消化液，其特征在于，所述Collagenase Type IV为50～300U/ml、Dispase为0.1～5.0U/ml、DNase I为2～30U/ml。
3.根据权利要求2所述的消化液，其特征在于，所述Collagenase Type IV浓度为120～220U/ml；Dispase浓度为0.5～1.0U/ml；DNaseI浓度为10～20U/ml。
4.根据权利要求3所述的消化液，其特征在于，所述Collagenase Type IV浓度为120U/ml；Dispase浓度为0.8U/ml；DNase I浓度为15U/ml。
5.一种消化液的应用，其特征在于，包括权利要求1～4任一所述的消化液。
6.一种将人新鲜胰腺癌组织分散为单个活细胞的方法，其特征在于，包括权利要求1～5任一所述消化液，其特征在于，该方法的具体步骤为：
(1)机械分离：取新鲜胰腺癌组织机械剪碎后加入消化液消化；
(2)酶消化：在36.0℃～37.0℃下震荡孵育15～60min，期间每5～15min用吸管吹打8～15次，用2500～3000rpm间断涡旋1～1.5min；
(3)终止消化。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中新鲜胰腺癌组织机械剪碎的具体操作为将新鲜胰腺癌组织0.01～1g至无菌离心管中，置于冰水浴中，将组织彻底剪碎至0.1～2mm3大小。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入消化酶消化的操作为：将剪碎的胰腺癌组织加入1ml消化液，转移至离心管，加入1～5ml消化液，用巴氏德吸管将肿瘤组织悬液反复研磨5～10次。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤(2)用3000rpm间断涡旋1min。
10.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体步骤为孵育结束后，用吸管充分吹打，4℃，800～1500rpm离心5min，PBS洗2次，20～70um滤器过滤，收集单细胞悬液置于冰水浴上。
11.根据权利要求6～10任一所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(4)，步骤(4)在步骤(3)之后，具体操作为，加入Ficoll-Paque Plus去除细胞碎片和死细胞，300～450xg离心收集细胞。
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