CN113063778A - 一种应用于ai识别的胸水单体癌细胞制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，包括如下步骤：S1、配制肺癌单细胞分离液；S2、制备液基细胞片；S3、基于AI系统，检测出肺腺癌细胞液基制片的病理扫描图像中的细胞区域，利用VGG 16深度卷积神经网络模型，结合迁移学习技术，对检测出的细胞区域进行胸水单体癌细胞识别。本发明将大多数癌细胞分散成单体，再进行液基细胞制片，既保留其完整性和形态学特征，而且便于进一步检测，本发明应用于AI细胞病理诊断，相应地，在癌细胞生物学研究（如细胞培养、侵袭试验、单细胞分析等）、临床检测、药敏试验以及疗效分析等方面，亦具有良好的应用前景。

Description

一种应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法
技术领域
本发明属于临床医学领域，具体涉及一种应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法。
背景技术
病理诊断是现代医学的基石，决定了临床诊断和治疗的方向和预后，病理切片分析是癌症诊断中的金标准，但是即便对于经验丰富的病理医生来说，病理切片的阅片也是一个十分困难复杂的流程。
肺癌居十大恶性肿瘤之首，具有三高现象：发病率高、死亡率高、上升幅度高，是影响人类健康的主要疾病，是21世纪的主要医学问题之一。国内外人群中肺癌的5年生存率仅在5%-15%，晚期肺癌常常会出现胸水，其中含有癌细胞，可以通过细胞病理学来明确诊断。
液基薄层细胞学(liquid-based cytology test,LCT)作为一种改良的细胞病理学制片技术，被广泛应用于脱落细胞学检查，包括胸水脱落细胞学检查。与涂片相比优势：LCT具备统一程序化的标本前处理，去除了干扰诊断的血液，粘液等杂质，保证了薄片质量的一致性。统一程序化的每片单独染色技术，保证染色的一致性，同时杜绝了染色过程中不同样本间细胞的交叉污染。因此LCT技术有助于提高胸水中肺癌细胞检出的阳性率。
然而，临床上引起胸水的疾病很多，任何因素使胸膜腔内液体形成过多或吸收过少、出现胸膜腔内液体增多超出正常水平，都称之为胸腔积液(pleural effusions，简称胸水，PE)。其中良性疾病有心力衰竭、心包炎、肺结核、肺炎、免疫性疾病等；恶性疾病有转移癌、淋巴瘤、间皮瘤等。其中肺癌转移是最常见的原因。由于胸水富含蛋白质导致间皮细胞增生和各种疾病过程中往往伴有各种炎症细胞，导致细胞成分复杂，而且，没有组织形态结构来协助病理诊断，所以临床实践中，胸水细胞病理学诊断极为困难，有经验的胸科细胞病理医师极为稀少，因此，胸水中癌细胞的错漏是一个常见问题，不少病人因此延误治疗。
人工智能（Artificial Intelligence, AI）已成为信息领域最重要的技术革命，各行各业都将受益于它的飞速发展。医学是AI 进军的重要领域之一，我国政府已把医学AI的发展提高到国家战略高度。2017 年工信部印发《促进新一代人工智能产业发展三年行动计划》指出，“推广应用人工智能治疗新模式新手段，建立快速精准的智能医疗体系，实现智能影像识别、病理分型和智能多学科会诊，推动智能系统在医疗领域的集成应用”。2018年国务院办公厅印发《关于促进“互联网+医疗健康”发展的意见》，提出推进“互联网+”人工智能应用服务，研发基于AI 的临床诊疗决策支持系统，提高医疗服务效率，足见国家对AI 在医学领域发展的重视。
深度学习（Deep Learning，DL）是AI 技术的热门研究，它是一种基于人工神经网络对数据进行特征学习的AI 算法的泛称，其多层堆叠式结构能够组合数据低层特征得到数据的高层特征表达，对于大数据样本、复杂函数模型具有强大的处理能力。在DL 模型中，卷积神经网络（Convolutional Neural Network , CNN）由于在计算机视觉和图像分析方面的卓越表现受到广泛关注。CNN是建立在DL 基础上的自动特征提取方法，通过对输入数据进行多层线性或非线性变换，将数据映射到新空间里表达，通过学习整张图像，可稳定有效地提取图像固有特征。
开展基于深度学习的人工智能细胞病理学诊断模块并转化应用是解决目前国内病理医生数量、质量和经验存在巨大差异，有经验的专科病理医生稀缺，迅速优化临床诊断、明确治疗方向和改善预后的有效策略（注：国内的病理医生只有目标配置的1/10）。
胸水往往出现在肿瘤的后期，胸水中各种癌细胞是从实体肿瘤中通过侵袭、转移而来，大多数呈细胞簇（团块）而存在，是其生物和形态学特征，胸水中肺癌细胞诊断最大的问题和困难是通过目前的技术方法很难得到高比率的单细胞悬液，对诊断和基因检测有一定的影响，但可以通过一定的方法去解决，例如：液基细胞制片、细胞块包膜等方法。目前将胸水脱落细胞的液基薄层细胞制片应用于基于深度学习的人工智能细胞病理学诊断模块开发存在这一个明显的问题，就是液基制片中胸水细胞成团、成簇现象比较明显（如图1），显微镜下不容易对焦，对病理医师的诊断经验和水平要求较高，同时增加了机器学习难度和减慢了模块运算速度，不利于模块在日常高通量病理诊断工作中的推广应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，增加胸水中肺癌癌细胞单体率，提高机器学习和训练精准识别胸水肺癌细胞的效率，化繁为简，提升机器深度学习的泛化能力和鲁棒性，在肺癌细胞的人工智能识别方面具有一定的科学意义和应用价值。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，包括如下步骤：
S1、配制肺癌单细胞分离液；
S2、制备液基细胞片；
S3、基于AI系统，检测出肺腺癌细胞液基制片的病理扫描图像中的细胞区域，利用VGG 16深度卷积神经网络模型，结合迁移学习技术，对检测出的细胞区域进行胸水单体癌细胞识别。
其中，步骤S1包括如下步骤：
S1.1、配制0.01%PBS缓冲液，调节PH至7.2；
S1.2、向0.01%PBS缓冲液中加入试剂：胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DNase、EDTA和顺铂，于室温下搅拌均匀，配制成肺癌单细胞分离液；
S1.3、配制完成的肺癌单细胞分离液于-20℃保存备用。
进一步，步骤S1.2中，0.01%PBS缓冲液、胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DNase、EDTA和顺铂的质量比为：50: 2: 1: 0.005: 0.1: 1；
其中，胰蛋白酶的浓度为2.5mg/ml、胶原蛋白酶的浓度为5.0mg/ml、DNase的浓度为1ug/ul、EDTA的浓度为10.0mg/ml和顺铂的浓度为0.5mg/ml。
其中，步骤S1.1中，0.01%PBS缓冲液由0.1mol/L Na2HPO4与0.1mol/L KH2PO4混合而成，其中，Na2HPO4与KH2PO4的质量比为：4:1。
其中，步骤S2中，收集临床胸水标本，初步处理后，离心沉淀，加入步骤S1制备的肺癌单细胞分离液，然后完成液基细胞制片，具体步骤为：
S2.1、抽取胸水50ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；
S2.2、将底部10~20ml富含细胞的胸水用长吸管移入2个15ml离心管中，以1500rpm离心沉淀5min，然后用PBS缓冲液洗涤1次，最后以1500rpm 离心沉淀5min；
S2.3、弃上清，两个离心管中的细胞沉淀以5ml 的肺癌单细胞分离液重新悬浮，37℃消化15min，间隔5min摇匀1次；
S2.4、用巴氏吸管将所获细胞悬液转移至单细胞制备装置，加压通过100目筛网；
S2.5、1500 rpm离心5min，弃上清，保留沉淀细胞；
S2.6、加2ml PBS缓冲液，重悬细胞；
S2.7、利用液基细胞制片仪制备LCT单层细胞片。
其中，步骤S3包括如下步骤：
S3.1、采用40倍物镜完成LCT细胞片的数字扫描，建立肺腺癌细胞病理图像数据集，并完成数据标注；
S3.2、采用基于改进UNet深度卷积神经网络模型的语义分割方法，检测出肺腺癌细胞液基制片的病理扫描图像中的细胞区域；接着利用VGG 16深度卷积神经网络模型，结合迁移学习技术，对检测出的细胞区域进行胸水单体癌细胞识别。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1、本发明将大多数癌细胞分散成单体，再进行液基细胞制片，既保留其完整性和形态学特征，而且便于进一步检测，本发明应用的AI细胞病理诊断，相应地，在癌细胞生物学研究（如细胞培养、侵袭试验、单细胞分析等）、临床检测、药敏试验以及疗效分析等方面，亦具有良好的应用前景。
2、本发明明显增加胸水中肺癌癌细胞单体率，提高了机器学习和训练精准识别胸水肺癌细胞的效率，化繁为简，提升机器深度学习的泛化能力和鲁棒性，在肺癌细胞的人工智能识别方面具有一定的科学意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明背景技术中未经肺癌单细胞分离液处理的胸水液基制片HE染色图；
图2为本发明中经肺癌单细胞分离液处理的胸水液基制片HE染色图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明提供了一种应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，包括如下步骤：
S1、配制肺癌单细胞分离液，包括如下步骤：
S1.1、用8.0ml 0.1mol/L Na2HPO4 (14.2g/L)与2.0ml 0.1mol/L KH2PO4(13.6g/L)配制成10 ml的0.01%PBS缓冲液，10倍稀释后调节PH至7.2；
S1.2、向50ml PH7.2的0.01%PBS缓冲液中加入以下试剂，用搅拌器于室温下搅拌15min至混匀；
Figure 740109DEST_PATH_IMAGE001
S1.3、配制完成的肺癌单细胞分离液于-20℃保存备用。
S2、制备液基细胞片：收集临床胸水标本，初步处理后，离心沉淀，加入步骤S1制备的肺癌单细胞分离液，然后完成LCT制片，具体步骤为：
S2.1、抽取胸水50ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；
S2.2、将底部10~20ml富含细胞的胸水用长吸管移入2个15ml离心管中，以1500rpm离心沉淀5min，然后用PBS缓冲液洗涤1次，最后以1500 rpm离心沉淀5min；
S2.3、弃上清，两个离心管中的细胞沉淀以5ml 的肺癌单细胞分离液重新悬浮，37℃消化15min，间隔5min摇匀1次；
S2.4、用巴氏吸管将所获细胞悬液转移至单细胞制备装置，加压通过100目筛网；
S2.5、1500 rpm离心5min，弃上清，保留沉淀细胞；
S2.6、加2ml PBS缓冲液，重悬细胞；
S2.7、利用液基细胞制片仪制备LCT制片。液基细胞制片仪包括但不限于：美国新柏氏液基细胞制片仪（TCT-2000）。
制备LCT单层细胞片的技术原理为：通过应用多种蛋白酶和化学试剂，破坏癌细胞之间的纤维连接蛋白(FN)，解离多细胞团簇(MCA)，又能保持癌细胞的形态结构,保证细胞分散为单个细胞。本发明提供了标准化的胸水单细胞液基制备流程，可用于建立精准高效的细胞病理图像人工智能识别系统。
S3、基于AI系统，检测出肺腺癌细胞液基制片的病理扫描图像中的细胞区域，利用VGG 16深度卷积神经网络模型，结合迁移学习技术，对检测出的细胞区域进行胸水单体癌细胞识别；具体步骤为：
S3.1、采用40倍物镜完成LCT细胞片的数字扫描，建立肺腺癌细胞病理图像数据集，并由资深病理医生指导完成数据标注；
S3.2、采用基于改进UNet深度卷积神经网络模型的语义分割方法，检测出肺腺癌细胞液基制片的病理扫描图像中的细胞区域；接着利用VGG 16深度卷积神经网络模型，结合迁移学习技术，对检测出的细胞区域进行胸水单体癌细胞识别。为了提高深度卷积神经网络模型的性能，在进行细胞区域检测、识别的过程中，采用了数据增强技术。
实验表明，本方法能够较好地完成肺腺癌细胞病理涂片扫描图像中的细胞区域检测（正确率达到90%），并能对检测出的区域完成正常、疑似病变二分类识别（正确率达到90%，召回率为90%，ROC曲线线下面积为0.9）。
本发明采用的AI识别方案在液基细胞制片的基础上，进行细胞标注和机器学习，提高识别的效率和准确性。在初步的实验中，发现细胞成簇是影响AI高效迅速识别胸水肺癌细胞的最大问题。比如要识别约1000只羊的群体，最好的方法是将这1000只羊的单体进行三维成像，但如果不能做到这一点，羊是三三两两、三五成群还是五十扎推，对于成像的精度和组合的影响是非常巨大的，对于算法模型的建立的要求也是完全不一样的。对于胸水肺癌细胞AI诊断的样本量、标注难度和工作量则呈指数级增长，对计算机的处理性能提出挑战，而且算法模型的精确度大幅下降。
现有的细胞悬液制备方法主要分为：物理和化学的方法。通常采用机械联合酶消化法将实体瘤组织制备成肿瘤单细胞悬液；其优点是经济、快速，能满足一般实验和临床诊断的要求。然而此“单细胞悬液”在显微镜下观察，实际上仍是以细胞簇为主的液体，并不完全适合AI分析的需求。
关键性病理特征采集和标注方法的有效性决定了AI识别能力和未来诊断的精准度，因此，本发明从细胞之间相互连接的机制出发，在常规细胞裂解液的基础上，针对细胞间的连接进行分解、离散癌细胞，分离胸水中的肺癌细胞簇，形成肺癌单细胞，便于细胞标注和机器学习，提高识别的效率和准确性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、配制肺癌单细胞分离液；
S2、制备液基细胞片；
S3、基于AI系统，检测出肺腺癌细胞液基制片的病理扫描图像中的细胞区域，利用VGG16深度卷积神经网络模型，结合迁移学习技术，对检测出的细胞区域进行胸水单体癌细胞识别。
2.根据权利要求1所述的应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，其特征在于，步骤S1包括如下步骤：
S1.1、配制0.01%PBS缓冲液，调节PH至7.2；
S1.2、向0.01%PBS缓冲液中加入试剂：胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DNase、EDTA和顺铂，于室温下搅拌均匀，配制成肺癌单细胞分离液；
S1.3、配制完成的肺癌单细胞分离液于-20℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，其特征在于，步骤S1.2中，0.01%PBS缓冲液、胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DNase、EDTA和顺铂的质量比为：50：2：1：0.005：0.1：1；
其中，胰蛋白酶的浓度为2.5mg/ml、胶原蛋白酶的浓度为5.0mg/ml、DNase的浓度为1ug/ul、EDTA的浓度为10.0mg/ml和顺铂的浓度为0.5mg/ml。
4.根据权利要求2所述的应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，其特征在于，步骤S1.1中，0.01%PBS缓冲液由0.1mol/L Na2HPO4与0.1mol/L KH2PO4混合而成，其中，Na2HPO4与KH2PO4的质量比为：4:1。
5.根据权利要求1所述的应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，其特征在于，步骤S2中，收集临床胸水标本，初步处理后，离心沉淀，加入步骤S1制备的肺癌单细胞分离液，然后完成液基细胞制片，具体步骤为：
S2.1、抽取胸水50ml，加入1000U/ml肝素液1ml，放盐水瓶中置于4℃冰箱中静置6~12h，弃去上清；
S2.2、将底部10~20ml富含细胞的胸水用长吸管移入2个15ml离心管中，以1500 rpm离心沉淀5min，然后用PBS缓冲液洗涤1次，最后以1500 rpm离心沉淀5min；
S2.3、弃上清，两个离心管中的细胞沉淀以5ml 的肺癌单细胞分离液重新悬浮，37℃消化15min，间隔5min摇匀1次；
S2.4、用巴氏吸管将所获细胞悬液转移至单细胞制备装置，加压通过100目筛网；
S2.5、1500 rpm离心5min，弃上清，保留沉淀细胞；
S2.6、加2ml PBS缓冲液，重悬细胞；
S2.7、利用液基细胞制片仪制备LCT单层细胞片。
6.根据权利要求1所述的应用于AI识别的胸水单体癌细胞制备方法，其特征在于，步骤S3包括如下步骤：
S3.1、采用40倍物镜完成LCT细胞片的数字扫描，建立肺腺癌细胞病理图像数据集，并完成数据标注；
S3.2、采用基于改进UNet深度卷积神经网络模型的语义分割方法，检测出肺腺癌细胞液基制片的病理扫描图像中的细胞区域；接着利用VGG 16深度卷积神经网络模型，结合迁移学习技术，对检测出的细胞区域进行胸水单体癌细胞识别。
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