CN111548997A - 一种肺癌组织体外培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肺癌组织体外培养的方法，包括以下步骤：获取肺癌组织；利用蛋白酶溶解液将肺癌组织裂解为单细胞；将单细胞进行三维培养并建立肺癌组织类器官模型；扩大培养所述单细胞并建立肺癌信息数据库；冻存肺癌细胞类器官并建立肺癌细胞类器官库；复苏肺癌细胞类器官并重新培养；本发明能够为肺癌发病机理、临床药物筛选提供思路，能够成功的培养出大量与来源器官遗传角度高度一致的体外培养细胞，并进行长期保存，对肺组织器官和肺癌发展的研究提供有利工具。

Description

一种肺癌组织体外培养的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，主要涉及一种肺癌组织体外培养的方法。
背景技术
肺癌作为世界范围内第一大常见恶性肿瘤，其5年生存率仅约为15％，男女死亡率均为第一，成为威胁全人类健康的头号杀手。肺癌患者中，85％左右为非小细胞肺癌，15％左右为小细胞肺癌，针对不同类型应采取不同治疗和预后方案。目前肺癌的治疗手段从早起循证治疗到个体化精准医疗迈进，从临床角度为患者定制治疗方案。
常用的临床上获取病灶组织细胞的方法包括手术切除、超声或CT引导下经皮穿吸活检、纤维支气管镜、胸水脱落细胞、纵膈镜、胸腔镜等。体外培养组织类器官对于样本细胞数量和活力均存在一定要求，为提高培养成功率，首选手术获取的新鲜肺部组织，穿吸活检来源其次。但是晚期肺癌患者难以通过手术进行治疗，这就意味如果能够使用穿刺活检术获取的少量新鲜肺部组织成功培养出肺部组织类器官，对于肺癌患者、尤其是晚期肺癌患者的临床治疗方案具有重要指导意义。
传统二维细胞培养方法使培养细胞处于同一平面，长时间培养后，其形态特性、生理功能、遗传物质等均与原细胞产生较大差异，对临床研究的参考意义有限。类器官是体外生成的三维结构，包含多种细胞类型，这些细胞类型组织与来源器官具有类似的遗传物质和结构特征，并具备了一些特定的器官功能。更值得关注的是，类器官同样会随培养时间延长产生遗传变化，这种变化是肿瘤发展和产生耐药性的关键因素。
目前还未有完全的关于利用穿刺活检术获取的肺组织及肺癌组织体外培养、传代、冻存和复苏的方法，成功诱导个体肺组织及肺癌组织在体外构建类器官，能够使我们更好的理解肺部组织器官发育过程，帮助治愈肺部疾病的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺癌组织体外培养的方法，旨在解决目前还未有完全的关于利用穿刺活检术获取的肺组织及肺癌组织体外培养、传代、冻存和复苏的方法的问题；
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种肺癌组织体外培养的方法,包括以下步骤：
步骤1；获取肺癌组织；
步骤2；利用蛋白酶溶解液将所述肺癌组织裂解为单细胞；
步骤3；所述单细胞进行三维培养并建立肺癌组织类器官模型；
步骤4；扩大培养所述单细胞并建立肺癌信息数据库；
步骤5；冻存所述肺癌细胞并建立肺癌细胞类器官库；
步骤6；复苏所述肺癌细胞类器官并重新培养。
优选地，所述步骤1具体包括：所述肺癌组织通过穿刺活检术获取，其中，所述肺癌组织从生长旺盛、活跃的肺部病变组织获取；所述肺癌组织低温进行运输。
优选地，在步骤2中，所述蛋白酶将所述肺癌组织裂解为单细胞具体包括:利用磷酸缓冲液清洗所述肺癌组织；通过手术刀将所述肺癌组织切碎；将切碎的所述肺癌组织与所述蛋白酶溶解液混合并置于37℃培养箱中培养1小时，其中，每隔10分钟将培养管颠倒5次；通过70um细胞过滤器过滤得到单细胞悬液；在1500PM的压强下离心五分钟去上清液后收集所述单细胞混合液，其中，所述单细胞包括：正常肺细胞、肺癌细胞。
优选地，在步骤3中，将所述单细胞进行三维培养并建立肺癌组织类器官模型具体包括：将所述单细胞混合液与基质胶均匀混合后倒入培养板孔中并置于温度为37％、湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化1小时得到三维结构；所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于温度为37％、湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养。
进一步，在步骤3中，对所述单细胞进行三维培养进行扩大培养具体包括：去除所述肺组织器官培养基并用Accutase/EDTA溶液冲洗所述单细胞；将所述单细胞的细胞量按1:4的稀释度稀释；将所述单细胞与所述基质胶均匀混合后重新倒入所述培养板孔中并置于温度为37％、湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化1小时得到三维结构；所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于温度为37％、湿度为5％的二氧化碳培养箱中进行扩大培养。
进一步，所述肺组织器官条件培养基中包含肺癌组织体外生成所必需的营养成分；所述肺组织器官条件培养基需要每天更换。
优选地，其特征在于，在步骤5中，冻存所述肺癌细胞并建立肺癌细胞类器官库具体包括：去除所述肺组织器官培养基并用Accutase/EDTA溶液冲洗所述单细胞；在1500PM的压强下离心五分钟去上清液后收集细胞冻存液；所述细胞冻存液中加入CCF溶液进行重悬后倒入2ml冻存管中；将所述冻存管放入程序降温盒并在-80℃保存24h之后将所述冻存管转移至液氮中长期存储。
进一步，所述细胞冻存液冻存需按1min/℃的速度降温至-80℃。
优选地，在步骤6中，复苏所述肺癌细胞类器官并重新培养具体包括：将所述冻存管置于37℃水浴箱迅速回温；在1500PM的压强下离心五分钟去上清液后收集所述单细胞混合液；所述单细胞混合液与所述基质胶均匀混合倒入所述培养板孔中并置于温度为37％、湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化1小时得到三维结构；所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于温度为37％、湿度为5％的二氧化碳培养箱中进行培养。
进一步，所述冻存管中的单细胞复苏需在1-2分钟内完成。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明能够为肺癌发病机理、临床药物筛选提供思路，本发明能够成功的培养出大量与来源器官遗传角度高度一致的体外培养细胞，并进行长期保存，对肺组织器官和肺癌发展的研究提供有利工具，能够有助于更深入地了解人类发展，以及为制定疾病建模、药物发现和再生医学提供新的视角。
附图说明
图1为本发明一种肺癌组织体外培养的方法的流程图；
图2为本发明一种肺癌组织体外培养的方法肺癌样本图；
图3为本发明一种肺癌组织体外培养的方法肺癌类器官模型观察图；
图4为本发明一种肺癌组织体外培养的方法肺癌类器官模型应用图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特征细节仅仅是为了帮助全面理解本发明的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本发明的范围和精神。另外，为了清楚和简洁，省略了对已知功能和构造的描述。
应理解，说明书通篇中提到的“一个实施例”或“一实施例”意味着与实施例有关的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个说明书各处出现的“在一个实施例中”或“在一实施例中”未必一定指相同的实施例。此外，这些特定的特征、结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。
在本发明的各种实施例中，应理解，下述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本发明实施例的实施过程构成任何限定。
应理解，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本申请所提供的实施例中，应理解，“与A相应的B”表示B与A相关联，根据A可以确定B。但还应理解，根据A确定B并不意味着仅仅根据A确定B，还可以根据A和/或其它信息确定B。
实施例一：
参考图1一种肺癌组织体外培养的方法的流程图，本发明包括以下6个步骤：通过穿吸活检获取肺癌组织；利用蛋白酶溶解液将肺癌组织裂解为单细胞；将单细胞进行三维培养并建立肺癌组织类器官模型；扩大培养所述单细胞并建立肺癌信息数据库；冻存肺癌细胞类器官并建立肺癌细胞类器官库；复苏肺癌细胞类器官并重新培养。
在一个实施例中，肺癌组织样本通过穿刺活检术从生长旺盛、活跃的肺部病变组织获取，具体的说：根据影像学资料拟定穿刺部位后使用金属标志物固定，使用定位灯指示确定穿刺点，穿刺点半径5cm范围内消毒，盖洞巾，使用局部麻醉药物普鲁卡因(浓度2％)进行局麻，18G穿刺针按拟定路线和深度快速进针，到达指定位置后，将穿刺针卡至活检枪上，扣动扳机使穿刺针快速抽出；将提取的肺癌组织置于运转培养基中，然后放置冰上快速转移至无菌环境的实验室。
在一个实施例中，将提取的肺癌组织从运转培养基中取出置于无菌培养皿上，用磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Saline)清洗后，用小的手术刀将肺癌组织切碎。将肺癌组织样本加入蛋白酶溶解液中，置于温度为37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养1h。培养过程中，每隔10min将培养管轻轻颠倒5次使细胞与溶液充分接触。进一步，将肺癌组织和蛋白酶溶解液的混合溶液通过70um细胞过滤器过滤，得到解离下的单细胞，在压强为1500PM条件下离心5分钟后去上清收集单细胞。
在一个实施例中，将单细胞与基质胶均匀混合后种上24孔板，置于温度为37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中1h固化。每孔加入肺组织器官条件培养基且界面需超过细胞三维结构体，保持营养充分，每天更换培养基，培养4-5天。单细胞培养条件为：置于温度为37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养。
进一步，对单细胞进行扩大培养，去掉肺组织器官培养基，用Accutase/EDTA溶液冲洗细胞，然后以1:4的稀释度稀释细胞量，细胞与基质胶混匀后重新进行种板。细胞培养条件为：置于温度为37℃、湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养。
在一个实施例中，去掉肺组织条件器官培养基，用Accutase/EDTA溶液冲洗细胞，在压强为1500PM条件下离心5分钟后去上清收集细胞，加入CCF(RecoveryTM Cell CultureFreezing Medium)溶液重悬，细胞冻存液放入2ml冻存管中，将冻存管放入程序降温盒，细胞冻存需按1min/℃的速度降温至-80℃，，在-80℃条件保存24h，之后冻存管转移至液氮中长期存储，存储时间可长达3年。
在一个实施例中，取出冻存管，置于37℃水浴箱迅速回温。在压强为1500PM条件下离心5分钟后去上清收集细胞，与基质胶混匀后种到24孔板，37℃孵育1h，待细胞层稳定固化后加入肺组织器官条件培养基，重新放大培养，进一步说明冻存管中的单细胞复苏需在1-2分钟内完成。
实施例二：
临床获取100例肺癌穿吸活检组织样本，运转培养基中迅速转移至实验室无菌环境，酶解消化成单细胞，建立三维类器官模型。保存部分样本，建立肺癌数据库。
标本来源：
1.年龄18-75岁，且性别不限。
2.若曾接受辅助化疗，则化疗结束时间≥6个月。
3.根据美国东部肿瘤协作组(ECOG)身体状况评分(PS)0-1。
4.预计生存期超过3个月。
5.筛选前7天内(包括7天)，通过实验室检测数据要求：中性粒细胞计数≥1.5×109/L、血小板计数≥90×109/L、血红蛋白≥90g/L(14天内未输血)、血清总胆红素≤1.25倍正常上限(ULN)；ALT和AST≤2.5×ULN(有肝转移患者≤5×ULN)；血清肌酐≤1.5×ULN。
6.至少有一个可检测的病灶(RECIST 1.1标准)。
标本来源患者排除标准：
1.既往5年内有其他肿瘤病史，已治愈的宫颈癌或皮肤基底细胞癌除外。
2.目标病灶曾接受过放疗。
3.妊娠或哺乳期妇女。
4.药物成瘾者。
5.重要脏器功能衰竭或其他严重疾病，包括临床相关的冠脉疾病、心血管疾病。
6.严重精神病史。
7.严重传染性疾病患者。
试剂准备：
表1运转培养基成分
Figure BDA0002522841030000061
优选地，
Advantage DMEMF-12：由包含各种氨基酸和葡萄糖的DMEM培养基和包含多种微量元素的F-12培养基按1:1比例组成。
Rock inhibitor Y-27632：选择性ROCK抑制剂，减少分离诱导的凋亡。
Penicillin Streptomycin：青霉素-链霉素溶液，抑制细菌活性。
表2蛋白酶溶解液成分
成分 配制量
HBSS 3490ul
Collagen IV 10ul
Calcium Chloride 1500ul
优选地，
HBSS：Hank's平衡盐溶液。
Collagen IV：使肺部组织分解成单个细胞。
Calcium Chloride：氯化钙。
表3肺组织器官条件培养基成分
Figure BDA0002522841030000062
Figure BDA0002522841030000071
优选地，
B-27TM Supplement：培养添加剂。
N-acetylcysteine：能够拮抗多种蛋白酶体抑制剂的活性。
NACE(N-Acetyl-L-cysteine)：N-乙酰基-L-半胱氨酸，组织培养基的营养成分。
EGF：一种表皮生长因子。
Noggin：一种人重组蛋白。
R-spondin 1：一种人重组蛋白。
A-83-01：选择性小分子抑制剂。
FGF 7：一种成纤维细胞生成因子。
FGF 10：一种成纤维细胞生成因子。
Nicotinamide：烟胺酸，组织培养基的营养成分。
Rock inhibitor Y-27632：。选择性ROCK抑制剂，减少分离诱导的凋亡。
WNT3a：。WNT激动剂。
Glutamax：L-谷氨酰胺有效替代。
N2：N2补充剂。
Gastrin：。胃泌激素，调节细胞代谢，保护细胞。
Primocin：原代细胞抗生素。
Advantage DMEMF-12：由包含各种氨基酸和葡萄糖的DMEM培养基和包含多种微量元素的F-12培养基按1:1比例组成。
样本采集：
肺部组织样本采集：利用穿刺活检术获取新鲜肺癌组织。
肺部组织样本运转：将组织放入运转培养基中，记录患者信息，封紧管盖，培养基置于冰上，运输至实验室，参考图2为本发明肺癌样本图
类器官培养：
肺癌组织酶解消化分离成单个细胞
将提取的组织从运转培养基中取出置于无菌培养皿，用磷酸缓冲液清洗后，用小的手术刀切碎。将肺癌组织样本加入蛋白酶酶解消化溶液中，置于温度为37℃、湿度为5％的CO2培养箱中培养1h。培养过程中，每隔10min将培养管轻轻颠倒5次使细胞与溶液充分接触。将混合溶液通过70UM细胞过滤器过滤，得到解离下的单细胞，1500PM 5min离心后去上清收集细胞。
类器官放大培养：参考图3为本发明肺癌类器官模型观察图，
单个肿瘤细胞与基质胶混匀后种到24孔板，37℃孵育1h，待细胞层稳定固化后加入肺组织器官条件培养基，培养基的量需超过细胞层，培养基能够为肺癌细胞生成提供必须的营养成分和生长环境。
类器官冻存建库：
收集放大培养的肺癌单个细胞类器官，加入CCF细胞冻存液重悬，放入2ml冻存管中，放入程序降温盒，-80℃条件保存24h。之后冻存管转移至液氮中长期存储，确认类器官模型建立，证明类器官模型所携带的基因突变和肿瘤组织相同
类器官复苏：
取出冻存管，置于37℃水浴箱迅速回温。1500PM 5min离心后去上清收集细胞，与基质胶混匀后种到24孔板，37℃孵育1h，待细胞层稳定固化后加入肺组织器官条件培养基，重新放大培养。
本发明为肺癌发病机理、临床药物筛选提供思路。该方法能够成功的培养出大量与来源器官遗传角度高度一致的体外培养细胞，并进行长期保存，对肺组织器官和肺癌发展的研究提供有利工具。
最后应该说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前叙述实施对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神与范围。

Claims (9)

1.一种肺癌组织体外培养的方法,其特征在于，包括以下步骤：
步骤1；获取肺癌组织；
步骤2；利用蛋白酶溶解液将所述肺癌组织裂解为单细胞；
步骤3；将所述单细胞进行三维培养并建立肺癌组织类器官模型；
步骤4；扩大培养所述单细胞并建立肺癌信息数据库；
步骤5；冻存所述肺癌细胞类器官并建立肺癌细胞类器官库；
步骤6；复苏所述肺癌细胞类器官并重新培养。
2.根据权利要求1所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，所述肺癌组织低温进行运输。
3.根据权利要求1所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，步骤2具体包括:清洗所述肺癌组织；将所述肺癌组织切碎并与所述蛋白酶溶解液混合并置培养箱中培养；通过70um细胞过滤器过滤得到单细胞悬液；将所述单细胞悬液离心去上清液后收集单细胞混合液，其中，所述单细胞包括：正常肺细胞、肺癌细胞。
4.根据权利要求1所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，步骤3具体包括：将所述单细胞混合液与基质胶均匀混合后倒入培养板孔中并置于培养箱中固化得到三维结构后将所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于所述二氧化碳培养箱中培养。
5.根据权利要求4所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，步骤4中，对所述单细胞进行扩大培养具体包括：去除所述肺组织器官培养基并冲洗所述单细胞；将所述单细胞的细胞量进行稀释；将所述单细胞与所述基质胶均匀混合后重新倒入所述二氧化碳培养箱中固化得到三维结构后将所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于二氧化碳培养箱中进行扩大培养。
6.根据权利要求5所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，所述肺组织器官条件培养基中包含肺癌组织体外生成所必需的营养成分。
7.根据权利要求1所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，步骤5具体包括：去除所述肺组织器官培养基并冲洗所述单细胞后进行离心去上清液收集细胞冻存液；将所述细胞冻存液重悬后倒入冻存管中；将所述冻存管放入程序降温盒并在-80℃保存24h之后将所述冻存管转移至液氮中长期存储。
8.根据权利要求1所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，步骤6具体包括：将所述冻存管迅速回温并离心去上清液后收集所述单细胞混合液；所述单细胞混合液与所述基质胶均匀混合倒入所述培养板孔中并置于所述二氧化碳培养箱中固化得到三维结构后将所述培养板孔加入肺组织器官条件培养基并重新置于所述二氧化碳培养箱中进行培养。
9.根据权利要求8所述的一种肺癌组织体外培养的方法，其特征在于，所述冻存管中的单细胞复苏需在1-2分钟内完成。
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