CN117448274B - 一种口腔鳞癌类器官库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种口腔鳞癌类器官库的构建方法，包括以下步骤：取同一患者的口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织标本，进行类器官原代培养；根据类器官的成长速度及类器官数量定期更换培养基，进行传代培养，传代时一半类器官用于冻存，一半用于正常传代，以保存每一代类器官的原始信息；将每一代类器官依次进行编号，分别为P0代、P1代、P2代、P3代、P4代、P5代、P6代；当类器官传代至P3代或P4代时进入冻存程序；取冻存的P3代或P4代类器官进行复苏，继续传代至P5代或P6代时，所有类器官全部冻存，以确保冻存的类器官可以复苏、传代后才能入库。本发明成功构建了口腔鳞癌类器官库，利于后续口腔鳞癌的全方位研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种口腔鳞癌类器官库的构建方法。
背景技术
口腔鳞癌是口腔-头颈颌面部最常见的恶性肿瘤之一，且近年来在年轻人中发病率呈上升趋势。虽然以手术、放化疗为主的综合治疗策略不断改进，但患者五年的总生存率仍不满意，约为50-60％。颈部淋巴结转移发生率高，局部及远处复发风险高、化疗特异性差、放疗抵抗、靶向免疫治疗应答率低是目前口腔鳞癌临床诊治的难点。
目前，口腔鳞癌的个体化精准治疗缺乏合适的临床前评价模型，二维肿瘤细胞系和小鼠移植瘤模型由于存在较多的内在缺陷及应用限制，不是临床研究及疗效评价的最佳选择。肿瘤类器官是在体外用3D培养技术对肿瘤组织进行培养，形成在结构和功能上都类似目标器官或组织的三维细胞球体，其不仅能呈现原有肿瘤的生物学特征，保持基因表达的稳定性，还能精确的预测肿瘤患者对肿瘤药物的治疗效果。
国内外现已成功建立起直肠癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌等肿瘤类器官模型。患者来源的肿瘤类器官模型被认为是疾病研究的重大突破，为个性化疾病的治疗及疾病机制研究提供了新的思路。但许多肿瘤类器官在原代构建后难以传代、冻存和复苏，限制样本来源数量，同时也使得基础研究缺乏可重复性，若能发明一种可以长期稳定传代、冻存及复苏的肿瘤类器官库的构建方法，必将促进肿瘤的基础和临床研究，同时通过肿瘤类器官的冻存可以长期保存肿瘤患者的遗传信息，通过复苏肿瘤类器官可以随时获取患者的肿瘤标本，并根据需要进行测序及药物筛选，有利于患者的个性化精准治疗。
令人遗憾的是，由于口腔鳞癌来源于外胚层，有着特殊的发育机制，冻存后难以复苏，迄今暂无口腔鳞癌类器官库构建的报道，直接导致了口腔鳞癌个性化研究的样本不足，且研究结果不可重复。因此，开发一种简单高效的口腔鳞癌类器官库的构建方法，长期保存口腔鳞癌患者的个性化的肿瘤组织、淋巴结组织、正常黏膜组织类器官，对于建立起口腔鳞癌的发病机制、转移机制、药物筛查、指导患者的个性化治疗具有重要的科学价值及临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种口腔鳞癌类器官库的构建方法，该方法可以成功稳定地培养出与亲本肿瘤病理生理学特征高度一致，组织形态高度相似的口腔鳞癌类器官，且该口腔鳞癌类器官可以稳定传代、冻存且复苏后仍可以稳定传代培养，用于后续研究。
本发明可用于手术标本构建类器官并通过形态学检测、测序对类器官进行验证、分类、建库。通过构建口腔鳞癌类器官库，使得口腔鳞癌基础研究具有可重复性，增加同一位口腔鳞癌患者样本的可获得性。建库成功后，研究者可以根据需要随时复苏库中的类器官，从而进行更多基础和临床研究，包括患者发病机制探索、个性化药物筛选以及精准治疗等。
本发明构建的口腔鳞癌类器官库，源于较难构建的外胚层组织，它不仅包含了同一患者的口腔鳞癌组织、淋巴结组织及正常黏膜组织(癌旁)，还可以稳定传代、冻存且复苏后仍能可以稳定传代培养。
本发明提供一种口腔鳞癌类器官库的构建方法，包括以下步骤：
S1、取口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织(癌旁)标本，进行类器官原代培养；
S2、根据类器官的成长速度及类器官数量定期更换培养基，进行传代培养，传代时一半类器官用于冻存，一半用于正常传代，以保存每一代类器官的原始信息；
其中，当类器官长至直径为100μm-200μm时，进行传代培养；当类器官直径长至200μm以上时，将类器官进行消化，消化至类器官直径低于100μm后再进行传代培养；
其中，冻存标准为类器官的直径不超过200μm；当类器官直径长至200μm以上时，将类器官进行消化，消化至类器官直径低于100μm后再进行冻存；
S3、将每一代类器官依次进行编号，分别为P0代、P1代、P2代、P3代、P4代、P5代和P6代；
其中，当类器官传代至P3代或P4代时进入冻存程序；
取冻存的P3代或P4代类器官进行复苏，继续传代至P5代或P6代时，所有类器官全部冻存，以确保冻存的类器官可以复苏、传代后才能入库。
本发明一方面降低了建库成本，另一方面证明了健康的类器官在冻存后可以复苏传代，使得建库类器官更有可重复性和易获取性。
优选的，步骤S1包括以下步骤：
S11、在口腔鳞癌干细胞集中和丰富区域，获得口腔鳞癌组织标本；在癌旁组织获取正常黏膜组织标本；在颈部淋巴结清扫术标本中获取淋巴结组织标本；
S12、室温下，修剪组织标本，使用含有双抗的PBS冲洗组织标本；
S13、室温下，剪碎组织标本，转入离心管，加入消化液进行消化；
S14、室温下，采用过滤器进行过滤，离心，去上清；
S15、观察沉淀是否有红色，若有红色加入红细胞裂解液，裂解后加入基础培养基终止裂解，离心，去上清；
S16、加入基础培养基重悬沉淀，离心，去上清；
S17、加入基质胶重悬沉淀，混匀后将含有细胞的混悬基质胶加入孔板中；
S18、将孔板倒置放入37℃的孵箱中，待基质胶凝固后加入完全培养基进行培养。
优选的，步骤S13中，消化时采用37℃摇床振荡消化，消化至原有组织标本量减少1/4。
优选的，步骤S2中，当类器官长至直径为100μm时，进行传代培养。
优选的，步骤S2中，传代培养时，每4-10天传代一次。
优选的，步骤S2中传代培养包括以下步骤：
S21、吸去原代培养基，加入基础培养基，刮下类器官，转移至离心管中；在4℃冰箱里静置，使基质胶软化，室温下，离心，去上清；
S22、加入预冷的基础培养基重悬类器官，离心，去上清；加入类器官消化液重悬沉淀，37℃水浴锅中消化；
S23、加入基础培养基稀释消化液，混匀后室温下离心，再加入基础培养基重悬细胞，转移至EP管中；将细胞悬液混匀，一半用于传代，一半用于冻存，置于4℃冰盒上备用。
优选的，步骤S3中的冻存程序包括：
S31、当类器官直径长至冻存标准时，弃原培养基，加入基础培养基，溶解基质胶；
S32、将PBS、基质胶和类器官吸入离心管中，反复吹打后置入4℃冰箱至基质胶完全溶解，离心，去上清；
S33、加入基础培养基重悬，离心，去上清；
S34、加入冻存液于离心管中，重悬类器官；
S35、将冻存液分装至冻存管，编号，放入程序降温盒中，转入-80℃保存，24小时后转入液氮长期保存。
优选的，步骤S31中，冻存标准为类器官的直径为100μm。
优选的，步骤S3中的复苏包括以下步骤：
S36、将冻存管取出，待液氮挥发完全后转入37℃的水浴锅中，溶解冻存液；
S37、将冻存液转入离心管中，加入提前预热的基础培养基，吹打细胞悬液，使其混匀，室温下，离心，去上清；
S38、加入基础培养基重悬类器官并转移至EP管，室温下，离心，去上清；
S39、将4℃融化的基质胶加入EP管中，重悬类器官，将含有类器官基质胶混悬液加入孔板中，将孔板置入37℃孵箱中，待基质胶固化后加入完全培养基。
优选的，步骤S1之前还包括如下步骤：
获取口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织标本，将口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织标本分别分为三部分：组织病理部分、测序部分及培养部分；
将组织病理部分放入4％的多聚甲醛保存固定，进行石蜡包埋、HE染色；
将测序部分放入RNA保存液中保存，提取RNA后液氮保存，后续根据需要进行全基因组测序，并根据目标进行分子学分型；
将培养部分的标本，用于类器官原代培养。
本发明的有益效果：
1、本发明最大程度上保证了组织取材、传代、冻存和复苏时的细胞活性，此项对后续类器官成功率具有决定性的影响。
2、本发明中使用的组织器官消化条件和口腔鳞癌类器官完全培养基相对温和，有利于活细胞培养和传代。
3、本发明中原代类器官的构建过程中，大部分操作在室温下完成，不仅避免了操作反复切换温度，造成组织细胞损伤，还方便快捷，提高了实验效率。
4、本发明通过稳定传代，可以获得大量口腔鳞癌类器官，部分用于冻存，部分用于传代和实验研究，从而使得每一代都有样本存在，为实验的可重复性验证提供保障。
5、本发明通过冻存和复苏口腔鳞癌类器官，可以获得不同代数的类器官模型，进而可以探索药效及疾病演进规律。
6、本发明中口腔鳞癌培养成功率高达96％，明显高于现有关于口腔鳞癌类器官原代培养的成功率。
7.本发明中首次将同一患者的肿瘤组织、淋巴结组织、正常黏膜组织一并培养类器官，完整保存患者不同部位的信息，明显有利于口腔鳞癌颈部转移、复发机制的研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的口腔鳞癌类器官原代培养前修剪清洗肿瘤组织图；
图2为本发明提供的口腔鳞癌类器官原代培养结果(P0代)图；
图3为本发明提供的口腔鳞癌类器官传代结果(P1代)图；
图4为本发明提供的口腔鳞癌类器官传代结果(P2代)图；
图5为本发明提供的口腔鳞癌类器官传代结果(P3代)图；
图6为本发明提供的口腔鳞癌类器官传代至P4代时程序性冻存图；
图7为本发明提供的口腔鳞癌类器官P4代冻存后复苏结果图；
图8为本发明提供的口腔鳞癌类器官P4代复苏后传代(P5代)结果图；
图9为本发明提供的口腔鳞癌类器官P4代复苏后P5代再传代至P6代结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
获取口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织(癌旁)标本，将口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织标本分别分为三部分：组织病理部分、测序部分及培养部分；将组织病理部分放入4％的多聚甲醛保存固定，进行石蜡包埋、HE染色；将测序部分放入RNA保存液中保存，提取RNA后液氮保存，后续根据需要进行全基因组测序，并根据目标进行分子学分型；将培养部分的标本，用于类器官原代培养。
本实施例提供一种口腔鳞癌类器官库的构建方法，包括以下步骤：
S1、取同一患者的口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织标本，进行类器官原代培养。
本实施例中，S1包括如下步骤：
S11、在口腔鳞癌干细胞相对集中和丰富区域获得口腔鳞癌组织标本，在肿瘤边缘外2cm获取正常黏膜组织标本，在颈部淋巴结清扫标本中获取淋巴结组织标本，并分别用生理盐水清洗3遍后转入4℃的组织保存液保存，转运至生物安全柜待实验；优选的，取肿瘤浸润前区的肿瘤组织，避免取到表面坏死组织或深处正常组织；
S12、室温下，修剪组织标本，去除残存的坏死组织及正常脂肪、肌肉组织，使用含有双抗(庆大霉素-两性霉素B混合溶液)的PBS冲洗组织标本3遍，优选每次2-3min；
S13、室温下，剪碎组织，转入离心管，加入消化液进行消化；优选使用预热37℃的消化液消化45-75分钟；更优选采用37℃摇床振荡消化，消化至原有组织量减少1/4；
S14、室温下，过滤消化液及残余肿瘤组织，室温下离心过滤液；优选300g离心3min；
S15、弃上清液，观察沉淀是否有红色；若有红色加入红细胞裂解液，裂解3分钟后加入基础培养基终止裂解；
S16、室温下离心，去上清；
S17、加入基础培养基混悬沉淀，细胞计数；
S18、室温下再离心，加入基质胶，加入量根据接种孔数量确定，每孔30μL基质胶；4℃重悬组织细胞，按照每孔30μL加入24孔板中；
S19、倒置孔板，避免组织细胞贴壁，待基质胶凝固后加入完全培养基500μL/孔，于37℃培养箱中培养。
S2、根据类器官的成长速度及类器官数量定期更换培养基，进行传代培养，传代时一半类器官用于冻存，一半用于正常传代，以保存每一代类器官的原始信息。
本实施例中，每4-10天传代一次，步骤S2中传代培养包括以下步骤：
S21、在类器官直径长至约100μm-200μm时(本实施例中优选100μm)进行传代，吸去类器官培养基，每孔加入1ml基础培养基，刮下类器官，转移至离心管中；在4℃冰箱里静置5-20min，使基质胶软化，吹打10次，室温下300g离心3min，去除上清；
实验验证表明，当在类器官直径长至约100μm-200μm时进行传代，传代成功率更高。
在具体实施过程中，类器官传代时不宜过大，往往由于类器官直径长至200μm以上，传代成功率低，导致建库失败。经大量实验验证，当类器官直径长至200μm以上时，为保证传代成功率，可以将类器官进行消化，消化至类器官直径低于100μm后再进行传代，结果表明类器官消化后的传代成功率更高，大大提升了类器官建库的成功率。
S22、加入预冷的基础培养基重悬类器官，室温下300g离心3min；去上清，加入类器官消化液重悬沉淀，37℃水浴锅中消化10min，加入胎牛血清200μL，混匀；
S23、加入基础培养基稀释消化液，混匀后室温下300g离心3min，再加入1ml基础培养基重悬细胞，转移至1.5mlEP管中；将该细胞悬液混匀，一半用于传代，一半用于冻存，置于4℃冰盒上备用。优选的，步骤S23中将用于传代的细胞悬液离心去上清，保留沉淀，按每孔约10000个细胞对应30μL基质胶的比例计算加入基质胶；混匀后置于4℃冰盒上待接种。优选的，步骤S23中将用于冻存的细胞及类器官悬液混匀计数后，室温下300g离心3min，去上清保留沉淀；冰盒上，加入预冷的类器官冻存液稀释至约4000个细胞或类器官/ml，重悬类器官；将冻存液分装至冻存管，做好标记，转移至程序降温盒，-80℃过夜，转移至液氮长期保存。
传代的接种及培养同步骤S18和S19。
S3、将每一代类器官依次进行编号，分别为P0代、P1代、P2代、P3代、P4代、P5代、P6代；其中，当类器官传代至P3代或P4代时进入冻存程序；取冻存的P3代或P4代类器官进行复苏，继续传代至P5代或P6代时，所有类器官全部冻存，以确保冻存的类器官可以复苏、传代后才能入库。
本实施例中，步骤S3中的冻存程序包括：
S31、当类器官直径长至冻存标准时，优选冻存标准为类器官的直径不超过200μm，本实施例中，当类器官直径约100μm时，弃原培养基，加入基础培养基，溶解基质胶；
经实验验证，类器官冻存时不宜过大，当类器官直径超过200μm时易大量死亡，传代成功率低。
在具体实施过程中，类器官冻存时，往往由于类器官直径长至200μm以上冻存后再复苏、传代成功率低，导致建库失败。经大量实验验证，当类器官直径长至200μm以上时，为保证复苏、传代成功率，可以将类器官进行消化，消化至类器官直径低于100μm后再进行冻存，结果表明类器官消化后冻存再复苏、传代成功率更高，大大提升了类器官建库的成功率。
S32、将PBS、基质胶和类器官吸入离心管中，反复吹打后置入4℃冰箱至基质胶完全溶解，离心，去上清；
S33、加入基础培养基重悬，离心，去上清；
S34、加入冻存液于离心管中，重悬类器官；
S35、将冻存液分装至冻存管，编号，放入程序降温盒中，转入-80℃保存，24小时后转入液氮长期保存。
本实施例中，步骤S3中的复苏包括以下步骤：
S36、将冻存管取出，待液氮挥发完全后转入37℃的水浴锅中，溶解冻存液；
S37、将冻存液转入离心管中，加入提前预热的基础培养基，缓慢吹打细胞悬液，使其混匀，室温下，离心，去上清；
S38、加入基础培养基重悬类器官并转移至EP管；室温下，离心，去上清；
S39、将4℃融化的基质胶加入EP管中，重悬类器官，将含有类器官基质胶混悬液加入孔板中，将孔板置入37℃孵箱中，待基质胶固化后加入完全培养基。
本实施例可用于手术标本构建类器官并通过形态学检测、测序对类器官进行验证、分类、建库。通过构建口腔鳞癌类器官库，使得口腔鳞癌基础研究具有可重复性，增加同一位口腔鳞癌患者样本的可获得性。建库成功后，研究者可以根据需要随时复苏库中的类器官，从而进行更多基础和临床研究，包括患者发病机制探索、个性化药物筛选以及精准治疗等。
实施例2
本实施例对口腔鳞癌组织、淋巴结组织及正常黏膜组织的原代消化及培养步骤以具体案例进行详细描述：
1.分别取口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织黄豆粒大小，在4℃的保存液中保存；
2.至实验室后，消毒包装袋转移至生物安全柜，弃保存液，使用4℃预冷的双抗-PBS清洗3次，每次2-3min；再用基础培养基清洗组织2次，每次2min，原代培养前修剪清洗肿瘤组织见图1；
3.分别取口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织转移至EP管中剪碎，转入离心管中，加入消化液至10ml，37℃摇床振荡消化45-75min，当组织块总量减少约1/4时可终止消化；经实验验证，采用更为柔和的消化方式，延长了消化时间，可以更大限度地保留细胞活性，有利于活细胞培养和传代；
4.100μm滤器过滤至50ml离心管中，过滤消化液及残余组织，300g离心3min；经实验验证，采用100μm滤器过滤，不以把所有组织细胞消化为单细胞为目的，少量细胞聚集成团更利于建库成功；
5.弃上清，若可见红色则加入1-2ml红细胞裂解液，重悬组织，用以裂解红细胞，约2min，红色消退后在离心管里加入基础培养基，300g离心3min，弃上清；
6.室温下，预冷的基础培养基重悬沉淀，300g离心3min；
7.弃上清，4℃上溶解的基质胶重悬沉淀，混匀，加入24孔板中，每孔加入30μL含有细胞的混悬基质胶，倒置放入37℃的孵箱中15-25min，避免组织细胞贴壁，基质胶固化后每孔加入500μL的完全培养基；周围空白孔加入500μL/孔PBS；经实验验证，采用相对温和的口腔鳞癌类器官完全培养基，有利于活细胞培养；
8.每2-3天更换完全培养基一次；
9.本实施案例培养得到的口腔鳞癌原代类器官(P0代)如图2所示。
实施例3
本实施例对口腔鳞癌类器官的传代步骤以具体案例进行详细描述：
1.弃原代培养基，加入500μL 4℃预冷的基础培养基，溶解基质胶；
2.将基础培养基、基质胶、类器官转移至离心管中，置入4℃冰箱里2-15min，溶解基质胶，每2-3min间断摇晃5-10次；
3.室温下，300g离心3min，弃上清，加入基础培养基重悬类器官，300g离心3min；
4.弃上清，加入4℃溶解的基质胶重悬类器官，30μL/孔混悬类器官接种至24孔板，置入37℃孵箱15-25min，待基质胶凝固后每孔加入500μL完全培养基，孔板周围加入500μLPBS；2-3天更换完全培养基一次；经实验验证，采用相对温和的口腔鳞癌类器官完全培养基，有利于活细胞传代；
5.传代至第三代进入冻存程序；
6.本实施案例培养方法得到的口腔鳞癌传代类器官(P1-P3代)如图3-5所示。
实施例4
本实施例对口腔鳞癌类器官的冻存步骤以具体案例进行详细描述：
1.当类器官直径约100μm时，弃原培养基，加入500μL 4℃的基础培养基，溶解基质胶；
2.将PBS、基质胶和类器官吸入离心管中，反复吹打后置入4℃冰箱至基质胶完全溶解；
3.300g离心3min，弃上清；加入基础培养基重悬，300g离心3min；
4.弃上清，加入冻存液于离心管中，重悬类器官；
5.转入冻存管中，编号，放入程序降温盒中，转入-80℃保存，24小时后转入液氮长期保存(如图6所示)。
实施例5
本实施例对口腔鳞癌类器官的复苏以具体案例进行详细描述：
1.将冻存管取出，待表面的液氮挥发完全后转入37℃的水浴锅中，溶解冻存液，水浴浸没冻存管约1/3，且边溶解边摇晃；
2.将冻存液转入15ml离心管中，加入9ml已经预热的基础培养基，缓慢吹打细胞悬液，使其混匀；
3.室温下，300g离心3min，去掉上清液加入1ml基础培养基重悬类器官并转移至1.5ml EP管；室温下300g离心3min；
4.弃上清，将4℃融化的基质胶加入EP管中，重悬类器官，每孔加入30μL含有类器官基质胶混悬液；置入37℃孵箱中，待基质胶固化后加入500μL/孔完全培养基，复苏及传代结果如图7-9所示。
结果表明，上述实施例成功稳定地培养出与亲本肿瘤病理生理学特征高度一致、组织形态高度相似的口腔鳞癌类器官，且该口腔鳞癌类器官可以稳定传代、冻存且复苏后仍可以稳定传代培养，对于长期保存口腔鳞癌患者的个性化类器官，对于建立起口腔鳞癌的发病机制、转移机制、药物筛查，指导患者的个性化治疗具有重要的科学价值及临床意义。
基于本发明的方法构建口腔鳞癌类器官库时，共执行25例，成功24例，成功率96％，具体结果信息见下表1。
表1
综上，通过本发明的方法可以获得大量口腔鳞癌患者的肿瘤组织，将不同时间的肿瘤类器官用于肿瘤机制研究，也可以用于药物筛选，为患者的个性化治疗提供帮助。
本实施例使用的主要仪器，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例所使用的试剂均可以从市场上购得或可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本实施例中所用到试剂、设备及其来源见下表2。
表2
| 试剂(厂家、编号) | 体积 | 最终浓度 |
| 原代组织保存液(BioGenousTM，Catalog#K601005) | 100ml | 1x |
| 癌症类器官基础培养基(BioGenousTM，Catalog#B213152) | 500ml | 1x |
| 肿瘤组织消化液(BioGenousTM，Catalog#K601003) | 100ml | 1x |
| 红细胞裂解液(BioGenousTM，Catalog#E238010) | 100ml | 1x |
| Fetal Bovine Serum(FBS)Superb(NoninBio，Catalog#NBS0998) | 500ml | 1x |
| 庆大霉素-两性霉素B混合溶液(酶联生物，货号：ml093553) | 100ml | 100x |
| 类器官冻存液(BioGenousTM，Catalog#E238023) | 100ml | 1x |
| 类器官消化液(BioGenousTM，Catalog#E238001) | 100ml | 1x |
| 类器官培养基质胶(BioGenousTM，Catalog#M315066) | 10ml | 1x |
| 口腔鳞癌类器官试剂盒(BioGenousTM，Catalog#K2152-OSC) | 500ml | 1x |
| 4％多聚甲醛固定液(Beyotime，Catalog#P0099) | 500ml | 1x |
| DPBS缓冲液(gibco，Catalog#C14190500BT) | 500ml | 1x |
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取同一患者的口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织标本，分别进行类器官原代培养；
S2、根据类器官的成长速度及类器官数量定期更换培养基，进行传代培养，传代时一半类器官用于冻存，一半用于正常传代，以保存每一代类器官的原始信息；
其中，当类器官长至直径为100μm-200μm时，进行传代培养；当类器官直径长至200μm以上时，将类器官进行消化，消化至类器官直径低于100μm后再进行传代培养；
其中，冻存标准为类器官的直径不超过200μm；当类器官直径长至200μm以上时，将类器官进行消化，消化至类器官直径低于100μm后再进行冻存；
S3、将每一代类器官依次进行编号，分别为P0代、P1代、P2代、P3代、P4代、P5代和P6代；
其中，当类器官传代至P3代或P4代时进入冻存程序；
取冻存的P3代或P4代类器官进行复苏，继续传代至P5代或P6代时，所有类器官全部冻存，以确保冻存的类器官可以复苏、传代后才能入库。
2.根据权利要求1所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：
S11、在口腔鳞癌干细胞集中和丰富区域，获得口腔鳞癌组织标本；在癌旁组织获取正常黏膜组织标本；在颈部淋巴结清扫术标本中获取淋巴结组织标本；
S12、室温下，修剪组织标本，使用含有双抗的PBS冲洗组织标本；
S13、室温下，剪碎组织标本，转入离心管，加入消化液进行消化；
S14、室温下，采用过滤器进行过滤，离心，去上清；
S15、观察沉淀是否有红色，若有红色加入红细胞裂解液，裂解后加入基础培养基终止裂解，离心，去上清；
S16、加入基础培养基重悬沉淀，离心，去上清；
S17、加入基质胶重悬沉淀，混匀后将含有细胞的混悬基质胶加入孔板中；
S18、将孔板倒置放入37℃的孵箱中，待基质胶凝固后加入完全培养基进行培养。
3.根据权利要求2所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S13中，消化时采用37℃摇床振荡消化，消化至原有组织标本量减少1/4。
4.根据权利要求1所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S2中，当类器官长至直径为100μm时，进行传代培养。
5.根据权利要求1所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S2中，传代培养时，每4-10天传代一次。
6.根据权利要求4或5所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S2中传代培养包括以下步骤：
S21、吸去原代培养基，加入基础培养基，刮下类器官，转移至离心管中；在4℃冰箱里静置，使基质胶软化，室温下，离心，去上清；
S22、加入预冷的基础培养基重悬类器官，离心，去上清；加入类器官消化液重悬沉淀，37℃水浴锅中消化；
S23、加入基础培养基稀释消化液，混匀后室温下离心，再加入基础培养基重悬细胞，转移至EP管中；将细胞悬液混匀，一半用于传代，一半用于冻存，置于4℃冰盒上备用。
7.根据权利要求1所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S3中的冻存程序包括：
S31、当类器官直径长至冻存标准时，弃原培养基，加入基础培养基，溶解基质胶；
S32、将PBS、基质胶和类器官吸入离心管中，反复吹打后置入4℃冰箱至基质胶完全溶解，离心，去上清；
S33、加入基础培养基重悬，离心，去上清；
S34、加入冻存液于离心管中，重悬类器官；
S35、将冻存液分装至冻存管，编号，放入程序降温盒中，转入-80℃保存，24小时后转入液氮长期保存。
8.根据权利要求7所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S31中，冻存标准为类器官的直径为100μm。
9.根据权利要求7所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S3中的复苏包括以下步骤：
S36、将冻存管取出，待液氮挥发完全后转入37℃的水浴锅中，溶解冻存液；
S37、将冻存液转入离心管中，加入提前预热的基础培养基，吹打细胞悬液，使其混匀，室温下，离心，去上清；
S38、加入基础培养基重悬类器官并转移至EP管，室温下，离心，去上清；
S39、将4℃融化的基质胶加入EP管中，重悬类器官，将含有类器官基质胶混悬液加入孔板中，将孔板置入37℃孵箱中，待基质胶固化后加入完全培养基。
10.根据权利要求1所述的口腔鳞癌类器官库的构建方法，其特征在于，步骤S1之前还包括如下步骤：
获取口腔鳞癌组织、淋巴结组织、正常黏膜组织标本，将口腔鳞癌组织淋巴结组织、正常黏膜组织标本分别分为三部分：组织病理部分、测序部分及培养部分；
将组织病理部分放入4％的多聚甲醛保存固定，进行石蜡包埋、HE染色；
将测序部分放入RNA保存液中保存，提取RNA后液氮保存，后续根据需要进行全基因组测序，并根据目标进行分子学分型；
将培养部分的标本，用于类器官原代培养。
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| CN117448274A (zh) | 2024-01-26 |
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