CN111925988B - 基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法 - Google Patents

基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111925988B
CN111925988B CN202010890745.5A CN202010890745A CN111925988B CN 111925988 B CN111925988 B CN 111925988B CN 202010890745 A CN202010890745 A CN 202010890745A CN 111925988 B CN111925988 B CN 111925988B
Authority
CN
China
Prior art keywords
retinal
retina
single cell
eyeball
cell suspension
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010890745.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111925988A (zh
Inventor
彭广华
王少军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN202010890745.5A priority Critical patent/CN111925988B/zh
Publication of CN111925988A publication Critical patent/CN111925988A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111925988B publication Critical patent/CN111925988B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于视网膜组织/类器官‑视网膜组织制备单细胞悬液的方法。本发明选用视网膜组织或类器官‑视网膜组织，并筛选出高效两种消化酶及其使用剂量和浓度、使用比例和酶的作用时间等，确保视网膜单细胞悬液内各类细胞的高活性率（存活率≥90%以上，符合细胞建库要求）、低结团率和低死细胞率；本发明方法操作简便、耗时短，可为视网膜单细胞RNA‑Sequence测序和ATCT‑Sequence测序等提供高效的活细胞；进而对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，揭示视网膜发育过程中不同细胞群体的转录因子变化规律，揭示细胞命运转变过程中各类细胞转录组的变化规律。

Description

基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法
技术领域
本发明涉及眼科试验技术领域，具体涉及一种基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法。
背景技术
世界卫生组织三个大样本的流行病学调查显示，致盲性眼病已成为继肿瘤、 心血管疾病之后的第三位影响人们生存质量的疾病。由于遗传缺陷、衰老或代谢等因素，导致以视网膜感光细胞变性为特征的视网膜变性疾病，是造成不可逆性失明的最主要原因。视网膜变性疾病是一类严重的致盲性疾病,最主要分为视网膜色素变性 (retinitispigmentosa, RP)和年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)。遗传性RP多发于少年和青壮年，患者在青壮年时期双眼失明，国内发病率为0.3%；AMD常见于中老年人，且随年龄增加，发病率逐年升高，成为老年致盲的主要疾病。我国每年因视网膜遗传缺陷、衰老或代谢疾病导致以视网膜 感光细胞变性为特征的视网膜变性疾病，引起失明的患者高达200万，不仅严重影响患者生存质量，而且增加社会负担，开展视网膜变性致盲性眼病研究是我国经济和社会的重大需求。目前，视网膜疾病的基础与临床研究是国际科技前沿的热点和难点。
视网膜组织含有复杂的十类细胞类型，各类细胞之间相互连接，相互依存，组织结构精细；尤其是视网膜感光细胞发育、成熟过程漫长，需要经历视网膜干细胞增殖、视网膜感光祖细胞谱系发育、视网膜感光细胞亚型形成、突触连接和感光细胞外节生长等一系列阶段。目前已发现七种转录调控因子在哺乳动物视网膜感光细胞的发育过程中发挥重要的调控作用，这些因子包括OTX2、CRX、NRL、NR2E3、PIAS3、RORβ 和TRβ2。视网膜感光祖细胞向视锥或视杆细胞分化的命运，取决于在特定时期这些转录因子的活跃或者沉默。这些转录因子网络的协同及精准控制，在视网膜感光祖细胞向视网膜感光细胞亚型视锥和视杆细胞分化中发挥重要作用。但是目前对于上述这些因子动态变化的调控机制尚未阐明。常规的基于群体的转录组分析方法无法揭示单个细胞之间基因表达的异质性，也难以对极少量稀有细胞进行分析，单细胞转录组分析技术为此供了有效的研究工具。单细胞转录组测序是作为推动干细胞生物学研究强大技术手段之一，它能呈现单个细胞转录组图谱，对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，从而揭示发育过程中不同细胞群体的转录因子变化规律，尤其适合揭示细胞命运转变过程中各类细胞转录组的变化规律。制备视网膜组织单细胞悬液，并使其符合细胞建库标准，对于阐述视网膜发育和视网膜疾病的发生发展至关重要。
目前，国内外视觉科学研究领域中，体外获得视网膜的常用方法是用酶消化和显微解剖分离方法。然而，现有的这两种方法均耗时较长，一般需要 15-25 分钟。而实践证明，当视网膜离开活体 15-25分钟后，视网膜神经细胞的死亡率可达 40-60%；这显然对后续进行的视网膜基础与临床研究能否成功将产生较大影响，极有可能因为视网膜离体时间过长，造成研究结果失真的严重后果。
因此，急需改进现有的视网膜取出技术，以便能快速、高效地取出视网膜，提高视网膜各类细胞的存活率，以便获得真实的研究结果，为防盲致盲的基础与临床研究提供技术支撑。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种视网膜组织/类器官-视网膜制备单细胞悬液的方法，以期能够解决现有技术耗时长、视网膜神经细胞的死亡率高的问题。本发明采用如下技术方案：
设计一种基于视网膜组织制备单细胞悬液的方法，包括如下步骤：
（1）充分冲洗眼球：首先用预冷的1×磷酸盐缓冲液（pH7.4）充分冲洗离体眼球，再用每毫升含有20IU庆大霉素的预冷生理盐水充分冲洗眼球1～3次，然后将眼球放在已预冷的眼球固定器上，剪除眼球表面的附属组织，保留四条直肌，然后将四条直肌固定在预冷的眼球固定器上；
（2）获取视网膜神经层和后段眼球壁：在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的尖刀片，沿眼球赤道部切开全周眼球壁，去除眼前段，先用视网膜取出勺把晶状体和玻璃体取出，再用视网膜取出勺沿视网膜下腔取出完整的视网膜神经层，将视网膜神经层放入在冰上预冷的10毫升的离心管里，已取出视网膜神经层的半圆形后段眼球壁，继续放置在预冷的眼球固定架上；
（3）消化视网膜组织：在装有视网膜神经层的离心管里，加入组织消化酶papain（使用浓度5mg/ml）和Collagenase（使用浓度5mg/ml）各1.5ml；在眼球固定器上的半圆形眼球壁内，按照1:1的比例加满上述两种组织消化酶，把这两部分组织放置在37℃保温箱内消化10-12分钟，每隔3min用塑料吸管轻柔吹打1次，直至显微镜下观察到单个圆形细胞一旦形成，马上将半圆形眼球内的细胞消化悬液吸出移到装有视网膜神经层组织的离心管里，根据离心管内两部分细胞消化悬液合并的体积，按1:1的比例加入含10%胎牛血清培养基终止消化；细胞悬液离心后去上清；
（4）制备单细胞悬液：在含有细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液（pH7.4）10ml,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的视网膜单细胞悬液离心后，去上清，加10%胎牛血清培养基3ml，混匀后即获得视网膜的单细胞悬浮液。
另一种基于类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法，包括如下步骤：
（1）收集类器官-视网膜组织：轻轻悬浮每个培养孔内类器官-视网膜的培养液，三个培养孔的类器官-视网膜悬液合并一起，移至预冷的10ml离心管，离心后去除上清液，用预冷的1X磷酸盐缓冲液(pH7.4)充分悬浮后，离心沉淀2次。
（2）消化类器官-视网膜组织：在装有类器官-视网膜的离心管里，加入组织消化酶papain（使用浓度2.5mg/ml）和Collagenase（使用浓度2.5mg/ml）各1.5ml；放置在37°C保温箱内消化6-8分钟（消化时间可根据眼球的发育时间和视网膜消化为圆形单个细胞而定），每隔2分钟用软塑料吸管轻柔吹打1次（注意切勿不能用暴力吹打，以免细胞破碎），显微镜下观察类器官-视网膜组织被消化的情况，直至镜下观察到单个圆形单细胞形成，立即加入含10%胎牛血清培养基3ml终止消化；300g(1200rpm)，离心5分钟，去上清；
（3）制备单细胞悬液：在含有细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液（pH7.4）10ml,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的视网膜单细胞悬液离心后，去上清，加10%胎牛血清培养基3ml，混匀后即获得视网膜的单细胞悬浮液。
所述视网膜取出器包括手柄，该手柄一端连接具有活动性视网膜取出勺，另一端连接具有活动性刀片夹，所述视网膜取出勺所在平面与手柄所在轴线呈一定倾角，所述刀片夹的前端装有一次性刀尖片。
所述离心条件为：300g、1200rpm、离心5分钟。
可按如下步骤检测所述单细胞悬液质量：
取1微升细胞悬液加到CountatarRRigel S2型智能一体化荧光分析仪的进样孔内进行检测，每1微升细胞悬液内含有细胞存活率、总细胞浓度、细胞结团率、活细胞个数和死细胞个数等，细胞存活率大于90%以上，才能符合细胞建库的标准。
与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
1. 本发明方法操作简便、耗时短，获得视网膜组织/类器官-视网膜组织中单细胞悬液内视网膜的各类细胞具有高存活率。
2. 本发明确定了有效的视网膜组织/类器官-视网膜组织的两种消化酶的使用剂量和浓度、使用比例和酶的作用时间，确保视网膜单细胞悬液内各类细胞的高活性率、低结团率和低死细胞率。
3. 本发明确保视网膜组织/类器官-视网膜组织单细胞的存活率均大于90%以上，符合细胞建库要求，为视网膜单细胞RNA-Sequence测序和ATCT-Sequence测序等提供高效的活细胞；进而对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，揭示视网膜发育过程中不同细胞群体的转录因子变化规律，揭示细胞命运转变过程中各类细胞转录组的变化规律。
4. 本发明方法获得的视网膜/类器官-视网膜组织各种单细胞具有高存活率，为单细胞各种测序提供有效性和准确性，为防盲致盲的基础与临床研究提供技术支撑，为阐述视网膜发育和视网膜疾病的发生发展提供至关重要的物质基础。
附图说明
图1为基于人胚胎干细胞来源3D培养第96天的类器官-视网膜组织制备的单细胞悬液上机检测结果界面图。
图2为基于胎龄8周人工引产获取的正常胚眼的视网膜组织制备的单细胞悬液上机检测结果界面图。
图3为基于胎龄20周人工引产获取的正常胚眼的视网膜组织制备的单细胞悬液上机检测结果界面图。
图4为视网膜取出器的分解结构示意图，图中1为视网膜取出勺，2为手柄，3为一次性尖刀片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：基于人工流产/引产获得的离体正常胚眼视网膜组织制备单细胞悬液的方法，具体包括如下步骤：
（1）充分冲洗眼球：首先用湿冰预冷的1X磷酸盐缓冲液(pH7.4)充分冲洗眼球，再用每毫升含有20IU的庆大霉素的预冷生理盐水充分冲洗眼球2次，将眼球放在已预冷的眼球固定器上，剪除眼球表面的附属组织，保留四条直肌，然后用大头针把四条直肌固定在眼球固定器上。
（2）获取视网膜神经层和后段眼球壁：在解剖显微镜下，用视网膜取出器（参见发明专利CN201310162184.7）一端的一次性尖刀片沿眼球赤道部切开全周眼球壁，去除眼前段 ，用视网膜取出勺把晶状体和玻璃体取出，再用视网膜取出勺沿视网膜下腔取出完整的视网膜神经层，将视网膜神经层放入事先在冰上预冷的10毫升的离心管里，已取出视网膜神经层的半圆形后段眼球壁（该半球形眼球壁含有视网膜色素上皮层），放置在已预冷的眼球固定器上，该操作过程可在5-8秒钟内完成。
（3）消化视网膜组织：在装有视网膜神经层的离心管里，加入组织消化酶papain（Sigma产品，货号p4762，使用浓度5mg/ml）和Collagenase（Sigma产品，货号c6805，使用浓度5mg/ml）各1.5ml；在眼球固定器上的半圆形眼球壁内，按照1:1的比例加满上述两种组织消化酶，放置在37℃保温箱内消化10-12分钟（消化时间根据眼球的发育时间和视网膜消化为圆形单个细胞而定），每隔3分钟用软塑料吸管轻柔吹打1次（注意切勿不能用暴力吹打，以免细胞破碎），显微镜下观察视网膜组织被消化的情况，直至镜下观察到单个圆形细胞形成，把半圆形眼球内的细胞消化悬液吸出移到装有视网膜神经层组织的离心管里，根据离心管内两部分细胞消化悬液合并的体积，1:1加入含10%胎牛血清培养基终止消化；300g(1200rpm)，离心5分钟，去上清。
（5）制备单细胞悬液：在含有细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液（pH7.4）10ml,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液移到10ml离心管内，使用300g，离心5分钟，去上清，加10%胎牛血清培养基3ml，混匀即获得视网膜单细胞悬液。
分别基于胎龄8周、12周、16周及20周人工引产获取的离体的正常胚眼按上述步骤制备出视网膜单细胞悬液，并分别取1微升细胞悬液加到CountatarRRigel S2型智能一体化荧光分析仪的进样孔内进行质量检测，获得每1微升细胞悬液内含有细胞存活率、总细胞浓度、细胞结团率、活细胞个数和死细胞个数等指标，参见图2、图3及表1。从中可以看出，细胞存活率均大于90%以上，符合细胞建库的标准。
实施例2：基于人胚胎干细胞3D培养（第96天）的类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法，具体包括如下步骤：
（1）收集类器官-视网膜组织：轻轻悬浮每个培养孔内类视网膜的培养液，三个培养孔的类视网膜悬液合并一起，移至预冷的10ml离心管，离心后去除上清液，用预冷的1X磷酸盐缓冲液(pH7.4)充分悬浮，离心沉淀2次。
（2）消化类器官-视网膜组织：在装有类器官-视网膜的离心管里，加入组织消化酶papain（Sigma产品，货号p4762，使用浓度2.5mg/ml）和Collagenase（Sigma产品，货号c6805，使用浓度2.5mg/ml）各1.5ml；放置在37°C保温箱内消化6-8分钟（消化时间根据眼球的发育时间和视网膜消化为圆形单个细胞而定），每隔2分钟用软塑料吸管轻柔吹打1次（注意切勿不能用暴力吹打，以免细胞破碎），显微镜下观察类视网膜组织被消化的情况，直至镜下观察到单个圆形单细胞形成，加入含10%胎牛血清培养基终止消化3ml；300g(1200rpm)，离心5分钟，去上清。
（3）制备单细胞悬液：在含有细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液（pH7.4）5ml,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液移到10ml离心管内，使用300g，离心5分钟，去上清，加10%胎牛血清培养基3ml，混匀即获得视网膜单细胞悬浮液。
分别基于人胚胎干细胞3D培养类器官-视网膜第36天、66天、96天、126天、156天后，按上述步骤制备出视网膜单细胞悬液，并分别取1微升类器官-视网膜细胞悬液加到CountatarRRigel S2型智能一体化荧光分析仪的进样孔内进行检测，获得每1微升细胞悬液内含有细胞存活率、总细胞浓度、细胞结团率、活细胞个数和死细胞个数等指标，参见图1及表1。从中可以看出细胞存活率大于90%以上，符合细胞建库的标准。
表1为类器官-视网膜组织培养的不同时间点和不同胎龄的正常胚眼视网膜
组织单细胞消化的结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关技术手段进行等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再逐一详述。

Claims (5)

1.一种基于视网膜组织制备单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）冲洗眼球
首先用预冷的1X磷酸盐缓冲液冲洗离体眼球，再以含庆大霉素20IU/ml的预冷生理盐水充分冲洗眼球1～3次，然后将眼球放在已预冷的眼球固定器上，剪除其表面除四条直肌外的附属组织，最后将四条直肌固定在眼球固定器上；
（2）获取视网膜神经层和后段眼球壁
在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的尖刀片沿眼球赤道部切开全周眼球壁，去除眼前段，先用视网膜取出勺把晶状体和玻璃体取出，再用视网膜取出勺沿视网膜下腔取出完整的视网膜神经层，将视网膜神经层放入已预冷的离心管里，剩余的半圆形后段眼球壁则继续放置在预冷的眼球固定器上；
（3）消化视网膜组织
在装有视网膜神经层的离心管里，加入浓度均为5mg/ml组织消化酶papain和Collagenase各1.5ml；再向眼球固定器上的半圆形眼球壁内等比例加满上述两种组织消化酶，再将两部分组织均放在37℃保温箱内消化10-12分钟，每隔3min用软管吹打1次，直至显微镜下观察到单个圆形单细胞形成后立即将半圆形眼球壁内的细胞消化悬液转移至装有视网膜神经层组织的离心管里，再根据离心管内两部分视网膜细胞消化悬液合并后的体积，等体积加入含10%FBS细胞培养基，以终止消化；离心后去上清；
（4）制备视网膜单细胞悬液
在含有视网膜细胞沉淀物的离心管内加入预冷1X磷酸盐缓冲液10ml，并悬浮细胞,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液离心后，去上清，加含有10%胎牛血清的培养基3ml，混匀后即得视网膜单细胞悬液。
2.一种基于类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）收集类器官-视网膜组织
悬浮每个培养孔内类器官-视网膜的培养液，合并各培养孔的类器官-视网膜悬液，移至预冷的离心管，离心后去除上清液，用预冷的pH7.4磷酸盐缓冲液充分悬浮后离心沉淀2次；
（2）消化类器官-视网膜组织
向装有类器官-视网膜的离心管中加入使用浓度均为2.5mg/ml的组织消化酶papai和Collagenase各1.5ml；放置在37℃保温箱内消化6～8分钟，每隔2分钟用软管吹打1次，直至镜下观察到单个圆形细胞形成，立即加入含10%胎牛血清的培养基终止消化，离心分离后去上清；
（3）制备单细胞悬液
在含有类器官-视网膜细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液(pH7.4)10ml，并悬浮细胞,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液离心后，去上清，加10%胎牛血清的培养基3ml，混匀后即得视网膜单细胞悬液。
3.根据权利要求1或2所述制备单细胞悬液的方法，其特征在于，所述视网膜取出器包括手柄，该手柄一端连接具有活动性的视网膜取出勺，另一端连接具有活动性的刀片夹，所述视网膜取出勺所在平面与手柄所在轴线呈一定倾角，所述刀片夹的前端安装有一次性刀尖片。
4.根据权利要求1或2所述制备单细胞悬液的方法，其特征在于，所述离心分离条件为：300g、1200rpm、离心5分钟。
5.根据权利要求1或2所述制备单细胞悬液的方法，其特征在于，检测所述视网膜单细胞悬液质量的方法包括如下步骤：
取1微升视网膜细胞悬液加到CountatarRRigel S2型智能一体化荧光分析仪的加样孔内进行检测，得到每1微升视网膜细胞悬液内含有细胞存活率、总细胞浓度、细胞结团率、活细胞个数和死细胞个数。
CN202010890745.5A 2020-08-29 2020-08-29 基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法 Active CN111925988B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010890745.5A CN111925988B (zh) 2020-08-29 2020-08-29 基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010890745.5A CN111925988B (zh) 2020-08-29 2020-08-29 基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111925988A CN111925988A (zh) 2020-11-13
CN111925988B true CN111925988B (zh) 2022-09-23

Family

ID=73309512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010890745.5A Active CN111925988B (zh) 2020-08-29 2020-08-29 基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111925988B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103211677A (zh) * 2013-05-06 2013-07-24 郑州大学第一附属医院 视网膜取出器
CN103234774A (zh) * 2013-05-06 2013-08-07 郑州大学第一附属医院 视网膜神经细胞层体外分离制备的方法
WO2017176810A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 Biotime, Inc. Pluripotent stem cell-derived 3d retinal tissue and uses thereof
CN110387351A (zh) * 2018-04-18 2019-10-29 江苏齐氏生物科技有限公司 一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9777255B2 (en) * 2010-12-14 2017-10-03 Morehouse School Of Medicine Methods and storage and retrieval of functional mature retinal cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103211677A (zh) * 2013-05-06 2013-07-24 郑州大学第一附属医院 视网膜取出器
CN103234774A (zh) * 2013-05-06 2013-08-07 郑州大学第一附属医院 视网膜神经细胞层体外分离制备的方法
WO2017176810A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 Biotime, Inc. Pluripotent stem cell-derived 3d retinal tissue and uses thereof
CN110387351A (zh) * 2018-04-18 2019-10-29 江苏齐氏生物科技有限公司 一种人视网膜Muller细胞的分离及培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Protective effect of nilvadipine against glutamate neurotoxicity in purified retinal ganglion cells;Yasumasa Otori et al.;《Brain Research》;20031231;第961卷;第214页2.2 *
Tissue culture studies of retinal development;Samuel Shao-Min Zhang et al.;《Methods》;20021231;第28卷;第439-447页 *
Yasumasa Otori et al..Protective effect of nilvadipine against glutamate neurotoxicity in purified retinal ganglion cells.《Brain Research》.2003,第961卷第213-219页. *
白海青.视网膜神经元营养和保护的体外实验研究.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 医药卫生科技辑》.2004,(第1期),第E073-2页. *
视网膜神经元营养和保护的体外实验研究;白海青;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 医药卫生科技辑》;20040315(第1期);第70页第3段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111925988A (zh) 2020-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103627673B (zh) 一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用
CN104087550B (zh) 一种大鼠心肌细胞的培养方法
CN109294974B (zh) 一种异育银鲫脊髓组织细胞系及其构建方法与其应用
CN106609263A (zh) 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法
CN110100788A (zh) 基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用
CN107921182A (zh) 用于分离基质血管部分的机械仪器和方法
CN109652366A (zh) 用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂
CN107287242A (zh) 一种促进牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的方法
CN111411080B (zh) 一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法
CN108774629A (zh) 一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法
CN102994452A (zh) 一种高效分离和培养神经元的方法
CN102994451A (zh) 一种神经元分离和培养的改进型方法
CN111925988B (zh) 基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法
CN107318719B (zh) 锦鲤精子诱导草鱼雌核发育的方法及雌核发育草鱼的应用
CN102978162A (zh) 一种神经元分离和培养方法及试剂
CN109030131A (zh) 一种雅龙鱼染色体制备方法
CN116875553A (zh) 小鼠结直肠癌类器官及其制备方法和应用
CN111549019A (zh) 一种显著提升斑块消化制备高质量单细胞悬液的方法
CN107058225B (zh) 一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法
CN108774630A (zh) 一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
CN115094022A (zh) 肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法
Lodin et al. Long-term cultivation of dissociated neurons from embryonic chick dorsal root ganglia in the Rose chamber
CN107034192A (zh) 一种敲除猪dj-1基因的细胞的构建方法及其应用
CN112574943A (zh) 一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用
Ham et al. Clonal growth of cells taken directly from adult rabbits

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant