CN111411080B - 一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法 - Google Patents

一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，采用研磨法制备细胞悬液，配合无菌巴氏吸管吹打，实现了短时间内分散斑马鱼肠道细胞，减少消化酶对细胞的损伤，提高细胞悬液中细胞浓度，以制备高质量单细胞悬液，克服了斑马鱼细胞粒径小、存活率低、难分散等分离难题；利用鱼脏器组织单核细胞分离液有效缩小了细胞分离的范围，排除了悬液中的其他细胞和死细胞；利用巨噬细胞强贴壁能力，可在4h内贴壁的特性，与其他单核细胞区分，有效对肠巨噬细胞进行纯化。与现有分离方法相比，本发明所用研磨法能够大大缩短试验时间，可在10分钟内完成细胞悬液的制备，具有更高的肠巨噬细胞的纯度，操作简单，所得细胞密度更大，减少细胞团聚。

Description

一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞分离和培养领域，具体涉及一种分离斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法。
背景技术
细胞培养是指在体外模拟体内环境(无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等)，在维持主要结构和功能的前提下，使之正常生长繁殖的一种方法。动物细胞培养开始于19世纪初期，至中期规模不断扩大，至今已成为生物、医学领域中广泛采用的技术方法。该技术的出现极大地促进了对组织特异性细胞内发生的复杂生理过程的研究，从而获取完整动物模型无法得到的信息。
细胞培养的对象可分为细胞系和原代细胞两大类，从机体分离后立即培养的细胞为原代细胞，细胞系则指原代细胞培养物经传代成功后所繁殖的细胞群体。细胞系的缺点在于往往与其原始组织存在不一样的遗传和表型。相比之下，原代细胞与体内原始组织在形态结构和功能活性上保持了较大的相似性，能较真实地反映体内细胞的活性与功能，是检测药物很好的实验对象。虽然原代细胞培养系统具有可直接观察细胞类型的特定过程等诸多优点，但是获得高纯度的原代细胞是十分困难的。
巨噬细胞是先天免疫系统最重要的效应细胞之一，并且在适应性免疫应答的引发和激活中也起到重要作用。一种分离原代巨噬细胞的方法是直接从生物体组织中获取。Kerkhof等人1通过用含有2％淀粉的PBS悬浮液刺激小鼠腹腔，吸引巨噬细胞聚集到腹腔，从而收集腹膜渗出细胞视为巨噬细胞。Callol等人2将欧洲鳗鱼的免疫器官前肾组织置于培养基中，在100μm尼龙细胞筛网上研磨，回收细胞后进行培养。此类方法虽然简单易行，但不可避免混入其他类型细胞，导致细胞分离的精确性不足。另一种方法是将组织分散成细胞悬液，进一步筛选后获得巨噬细胞。Rogler等人3将人结肠样本用胶原酶消化分解后通过Ficoll密度梯度离心20分钟分离出单核细胞，进而与CD33孵育，特定标记后由抗CD33磁珠进行阳性分选得到巨噬细胞。此方法利用不同细胞密度的差异性，首先区分出单核细胞，缩小了分离范围，有效提高了精确度。
斑马鱼是广泛用于基础和生物医学研究领域的模式脊椎动物，其肠道既是消化吸收器官，也是黏膜免疫器官，其黏膜固有层肠巨噬细胞除具有吞噬、杀伤和清除肠道病原微生物的功能外，还扮演着抗原递呈细胞的角色，发挥着启动和调节肠黏膜免疫应答的作用。目前分离人和小鼠巨噬细胞的技术较为成熟，但对于斑马鱼巨噬细胞分离技术还有很大的发展空间。并且与人和小鼠相比，可用于斑马鱼进行免疫染色的抗体的数量极少，大大缩小了分离技术的选择空间。虽然Xie等人4和Mazzolini等人5采用荧光蛋白特异性标记巨噬细胞的转基因斑马鱼系，分别使用Liberase TL解离Tg(mpeg1.4:mCherry-F)胚胎，以及研磨(mpeg1:eGFP)斑马鱼幼鱼的大脑组织，通过流式细胞分选仪根据荧光信号分离制备原代巨噬细胞。但是有关表型特征的许多研究表明，肠道巨噬细胞与其他组织中发现的巨噬细胞或体外分化的巨噬细胞显着不同。其典型的巨噬细胞标记物表达量较低，使得基于流式细胞术的分离方法一直很困难应用于肠道巨噬细胞中。因此开发一种快速高效的分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法十分有必要。
参考文献：
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Figure BDA0002418111290000021
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(4)Xie,Y.；Tolmeijer,S.；Oskam,J.M.；Tonkens,T.；Meijer,A.H.；Schaaf,M.J.M.Glucocorticoids inhibit macrophage differentiation towards a pro-inflammatory phenotype upon wounding without affecting their migration.DisModel Mech 2019,12,(5).
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发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，以解决目前对于斑马鱼这一物种的原代肠巨噬细胞分离和培养技术的空缺。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，包括如下步骤：
(1)取健康斑马鱼置于消毒的培养水中暂养，然后转移至含有青霉素和硫酸链霉素的消毒培养水中继续暂养12～16h；
(2)处死斑马鱼后，在酒精中浸泡30s以上，转入无菌超净操作台，解剖斑马鱼，取出肠道在酒精中漂洗干净；
(3)纵向划开肠道，剪碎成1mm×1mm的组织小块，在含有10vt％胎牛血清(FBS)的PBS溶液中清洗2遍以上；
(4)取步骤(3)得到的组织小块在细胞筛网上进行研磨，研磨期间用含有10vt％FBS的RPMI 1640培养基冲洗，收集得到细胞浓度＞108个/ml的细胞悬液；
(5)取一支无菌硅化离心管，依次加入鱼脏器组织单核细胞分离液试剂盒中分离液Ⅰ和分离液Ⅱ，制成各液面分层清晰的具有梯度界面的双层分离液；
(6)吸取步骤(4)得到的细胞悬液加于步骤(5)制得的双层分离液液面上，用水平离心机离心，使得离心管中的溶液分层；
(7)吸取步骤(6)离心后分层溶液中环状乳白色单核细胞层到另一离心管中，加入含有10vt％胎牛血清的PBS溶液进行细胞清洗，清洗完成后，离心去除上清液；
(8)取含有10vt％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，然后接种于细胞培养瓶中，在28℃、5％CO2培养箱中培养4h，通过差异贴壁法对肠巨噬细胞进行纯化，培养4h后弃去全部陈旧培养基，加入含有10vt％胎牛血清的新鲜RPMI 1640培养基即得。
具体地，步骤(1)中，所述的消毒培养水中，青霉素的浓度为200～1000IU/mL，硫酸链霉素的浓度为200～1000μg/mL，以抑制细菌生长，避免细胞污染。
具体地，步骤(4)中，先将步骤(3)得到的组织小块在70μm细胞筛网上使用塑料研磨杵研磨，所得细胞悬液用无菌巴氏吸管吹打后转移至40μm细胞筛网上再使用塑料研磨杵研磨。斑马鱼细胞<5μ5，使用70μm细胞筛和40μm细胞筛网能够使组织充分分散为细胞，减少细胞团聚，避免对巨噬细胞的分离产生影响。
具体地，步骤(5)中，所述鱼脏器组织单核细胞分离液试剂盒中分离液含有效成分ficoll，其中细胞悬液体积小于双层分离液总体积的1/3，优选分离液Ⅰ和分离液Ⅱ与步骤(4)得到的细胞悬液的体积比为3:1:1。
优选地，步骤(6)中，所述水平离心机采用400-500g离心20-30min。
优选地，步骤(7)中，采用PBS溶液进行细胞清洗的次数为一次以上；每次清洗完成后，于1200-1500rpm离心6-10min，去除上清液。
优选地，步骤(8)中，重悬细胞时含有10vt％胎牛血清的RPMI 1640培养基的用量为6ml。
其中，含有10vt％FBS的PBS溶液的pH＝7.4。
斑马鱼肠巨噬细胞的鉴定：
通过MiniBEST通用RNA提取试剂盒(9767，Takara)提取细胞总RNA，并以PrimeScriptTM cDNA第一链合成试剂盒(RR036A，Takara)反转录合成cDNA。根据斑马鱼巨噬细胞的特异性标志分子Mpeg1.1序列设计一对特异性引物(5'-CATGTCGTGGCTGGAACAGA-3'；5'-ATGGTTACGGACTTGAACCCG-3')，用于扩增Mpeg1.1基因。根据制造商的说明，使用ChamQ
Figure BDA0002418111290000041
qPCR Master Mix(Q311-02，Vazyme)进行qRT-PCR实验。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后回收PCR产物，进行克隆测序鉴定。
目前在鱼类中肠巨噬细胞分离的受试生物只有草鱼，其细胞较大，容易分离和计数；但是斑马鱼的细胞较小，分离难度大，未见成功分离出斑马鱼肠巨噬细胞的报道；此外，现有技术一般将组织分离成细胞悬液的方法是酶消化法，目的为了获得更大的细胞浓度，而本发明采用研磨法制备细胞悬液，配合无菌巴氏吸管吹打，实现了短时间内分散斑马鱼肠道细胞，减少消化酶对细胞的损伤，提高细胞悬液中细胞浓度，以制备高质量单细胞悬液，克服了斑马鱼细胞粒径小、存活率低、难分散等分离难题。
现有方法中必须先测定细胞浓度再进行分离液分离，本申请能够省略这一步，制成细胞悬液后直接进行分离。且本发明利用鱼脏器组织单核细胞分离液有效缩小了细胞分离的范围，排除了悬液中的其他细胞和死细胞。
本发明利用巨噬细胞强贴壁能力，可在4h内贴壁的特性，与其他单核细胞区分，有效对肠巨噬细胞进行纯化。
本发明将单核细胞分离液与差异贴壁法相结合，高效、快速地实现了斑马鱼肠巨噬细胞的分离和培养，克服了斑马鱼细胞粒径小、肠巨噬细胞难以分离的难题。
有益效果：与现有分离方法相比，本发明所用研磨法能够大大缩短试验时间，可在10分钟内完成细胞悬液的制备，且较常用的酶消化法节约试剂，大幅度减少实验成本，所得细胞密度更大，减少细胞团聚。本发明较现有分离方法，具有更高的肠巨噬细胞的纯度，操作简单。由于分离难度大，细胞脆弱不易存活，现有的原代细胞分离鲜有以斑马鱼为受试生物，且通常以整体组织为目标分离为原代细胞，忽略了组织种细胞的异质性，本发明分离目标更为精准，解决了目前尚未有完善的斑马鱼原代肠巨噬细胞分离培养方法的问题。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为分离得到的斑马鱼肠巨噬细胞生长状态图。
图2为斑马鱼肠巨噬细胞的特异性标志基因Mpeg1.1表达结果(M.标准物质2000；1.培养的贴壁细胞)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的具体步骤为：
(1)取8条健康斑马鱼置于消毒的培养水中暂养4h，转移至含200IU/mL青霉素和200μg/mL硫酸链霉素的消毒培养水中继续暂养12～16h；
(2)处死斑马鱼后，在酒精中浸泡30s，转入无菌超净操作台，固定鱼身，用消毒后的剪刀、镊子开腹处死、解剖斑马鱼，取出肠道在酒精中漂洗数秒；
(3)用无菌针纵向划开肠道，用剪刀剪碎成1mm×1mm的组织小块，在含有10vt％FBS的PBS溶液中清洗2遍；
(4)取步骤(3)得到的组织小块70g在70μm细胞筛网上研磨，研磨期间不断用1.5mL含有10vt％FBS的RPMI 1640培养基冲洗，收集细胞悬液；
(5)将步骤(4)得到的细胞悬液用无菌巴氏吸管吹打后转移至40μm细胞筛网上研磨，期间用1mL含有10vt％FBS的RPMI 1640培养基冲洗，收集细胞悬液，测得细胞浓度＞108个/ml；
(6)取一支无菌硅化离心管，用无菌巴氏吸管依次小心加入鱼脏器组织单核细胞分离液试剂盒(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)中3mL分离液Ⅰ和1ml分离液Ⅱ，制成各液面分层清晰的具有梯度界面的双层分离液；
(7)用无菌巴氏吸管小心吸取步骤(5)得到的细胞悬液1ml加于双层分离液中，在水平离心机450g下，离心28min；
(8)离心后，离心管中溶液分层，用吸管小心吸取第二层(环状乳白色单核细胞层)到另一离心管中；
(9)向所得离心管中加入2mL PBS溶液混匀细胞后，1200rpm离心8min；
(10)重复步骤(9)再清洗一次；
(11)取RPMI 1640培养基[89％(V/V)RPMI 1640、10％(V/V)FBS、1％(V/V)青链霉素混合液]重悬细胞，接种于25cm2细胞培养瓶，28℃、5％CO2培养箱中培养4h，通过差异贴壁法对肠巨噬细胞进行纯化，培养4h后弃去全部陈旧培养基，加入新鲜RPMI 1640培养基。
研磨法能够大大缩短试验时间，可在10分钟内完成细胞悬液的制备。
图1为通过上述分离和培养步骤得到的斑马鱼肠巨噬细胞生长状态图。从图中可以看出：细胞贴壁生长，无明显团聚现象，且达到60％汇合度，可以继续传代培养或进行实验。
验证实验：细胞特异性标志分子的表达分析
通过MiniBEST通用RNA提取试剂盒(9767，Takara)提取细胞总RNA，并以PrimeScriptTM cDNA第一链合成试剂盒(RR036A，Takara)反转录合成cDNA。根据斑马鱼巨噬细胞的特异性标志分子Mpeg1.1序列设计一对特异性引物(5'-CATGTCGTGGCTGGAACAGA-3'；5'-ATGGTTACGGACTTGAACCCG-3')，用于扩增Mpeg1.1基因。根据制造商的说明，使用ChamQ
Figure BDA0002418111290000061
qPCR Master Mix(Q311-02，Vazyme)进行qRT-PCR实验。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后回收PCR产物，进行克隆测序鉴定。
实验结果：
Mpeg1.1是斑马鱼巨噬细胞特有的标志分子。通过RT-PCR检测Mpeg1.1在原代培养贴壁细胞中的表达，从贴壁细胞中扩增出大小约为1 607bp的目的基因条带(图2)。测序序列与GenBank收录中的Mpeg1.1基因同源性达99.39％。结果显示，贴壁细胞转录表达了斑马鱼巨噬细胞的特异性标志分子。
本发明提供了一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）取健康斑马鱼置于消毒的培养水中暂养，然后转移至含有青霉素和硫酸链霉素的消毒培养水中继续暂养12~16 h；
（2）处死斑马鱼后，在酒精中浸泡30s以上，转入无菌超净操作台，解剖斑马鱼，取出肠道在酒精中漂洗干净；
（3）纵向划开肠道，剪碎成1mm×1mm的组织小块，在含有10vt% 胎牛血清的PBS溶液中清洗2遍以上；
（4）取步骤（3）得到的组织小块在细胞筛网上进行研磨，研磨期间用含有10 vt %胎牛血清的RPMI 1640培养基冲洗，收集得到细胞浓度＞108个/ml的细胞悬液；
（5）取一支无菌硅化离心管，依次加入鱼脏器组织单核细胞分离液试剂盒中分离液Ⅰ和分离液Ⅱ，制成各液面分层清晰的具有梯度界面的双层分离液；
（6）吸取步骤（4）得到的细胞悬液加于步骤（5）制得的双层分离液液面上，用水平离心机离心，使得离心管中的溶液分层；
（7）吸取步骤（6）离心后分层溶液中环状乳白色单核细胞层到另一离心管中，加入含有10 vt %胎牛血清的PBS溶液进行细胞清洗，清洗完成后，离心去除上清液；
（8）取含有10 vt %胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，然后接种于25 cm2细胞培养瓶中，在28℃、5%CO2培养箱中培养4h，通过差异贴壁法对肠巨噬细胞进行纯化，培养4 h后弃去全部陈旧培养基，加入含有10 vt %胎牛血清的新鲜RPMI 1640培养基即得；
步骤（4）中，先将步骤（3）得到的组织小块在70μm细胞筛网上使用塑料研磨杵研磨，所得细胞悬液用无菌巴氏吸管吹打后转移至40μm细胞筛网上再使用塑料研磨杵研磨。
2.根据权利要求1所述的分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的消毒培养水中，青霉素的浓度为200~1000 IU/mL，硫酸链霉素的浓度为200~1000 μg /mL。
3.根据权利要求1所述的分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤（5）中，细胞悬液体积小于双层分离液总体积的1/3。
4.根据权利要求1所述的分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述水平离心机采用400-500g离心20-30min。
5.根据权利要求1所述的分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤（7）中，采用PBS溶液进行细胞清洗的次数为一次以上；每次清洗完成后，于1200-1500rpm离心6-10min，去除上清液。
6.根据权利要求1所述的分离和培养斑马鱼原代肠巨噬细胞的方法，其特征在于，步骤（8）中，重悬细胞时含有10 vt %胎牛血清的RPMI 1640培养基的用量为6ml。
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