CN107523542B - 一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。分离方法为：无菌操作取出肠道中后段，除去肠道外脂肪与肠系膜，纵向剖开肠管清除粪便，使用无菌弯头镊子刮除草鱼肠黏液与上皮细胞层，刮除时间15min；将除去黏液和上皮细胞层的肠段处理成碎块置于胶原酶IV消化液中消化，获得固有层单细胞悬液；再用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞。纯化方法为：采用差异贴壁法纯化肠巨噬细胞。原代培养方法为：用含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液培养肠巨噬细胞，待细胞贴壁后用含脂多糖的RPMI 1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，细胞至少可存活20天。本发明建立了一种可操作性强、重复性好的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法。
Description
技术领域
本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。
背景技术
肠道既是硬骨鱼类的消化吸收器官，也是其黏膜免疫器官。研究表明鱼类肠道不具有哺乳动物的组织化淋巴器官(如，Peyer氏淋巴集结及滤泡淋巴结),但在肠道中后段黏膜层分布着大量巨噬细胞(Macrophages)、淋巴细胞和粒细胞等免疫细胞，其中黏膜固有层富含的肠巨噬细胞除具有吞噬、杀伤和清除肠道病原微生物的功能外，还扮演着抗原递呈细胞的角色，发挥启动和调节肠黏膜免疫应答的作用。
草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是中国四大家鱼之一，年产量超过400万吨，在所有淡水养殖鱼类中居首位。但随着草鱼养殖业的快速发展，疾病已成为制约其健康可持续发展的重要因素。疫苗接种是控制草鱼疫病的有效手段，而口服疫苗是水产养殖生产中最适用的疫苗类型。草鱼肠巨噬细胞的活性与功能是评价口服疫苗诱导的免疫应答水平，尤其是肠黏膜免疫水平的重要指标。由于巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养，并且原代培养细胞与体内细胞的特性接近，能较真实地反映体内细胞的活性与功能。因此，很有必要建立规范的、可复制的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法，为检测草鱼肠道黏膜免疫水平，评价口服疫苗的免疫效果提供试验平台。
现有的鱼类巨噬细胞分离培养技术中，从外周血、腹腔和头肾中分离巨噬细胞的方法已经比较成熟，且文献报道较多。然而，有关鱼类肠巨噬细胞的分离、纯化和原代培养方法尚未见有报道。首先，草鱼肠道细长弯曲、肠壁构成复杂，肠黏膜表面覆盖着大量黏液，巨噬细胞所在的固有层又含有致密的结缔组织，导致了草鱼肠巨噬细胞的分离存在困难。陆生恒温动物(小鼠、大鼠等)肠巨噬细胞的分离多采用DTT(硫苏糖醇)-EDTA(乙二胺四乙酸)分离法，并取得很好的分离效果。但我们的前期研究发现这种方法不适合生活在水环境中的变温动物草鱼，DTT-EDTA对草鱼巨噬细胞有损伤，细胞活力大大下降，培养12h后细胞就发生死亡。其次，草鱼肠巨噬细胞表面标记分子还知之甚少，也无标记分子特异性单克隆抗体，这给草鱼肠巨噬细胞的纯化带来难度。最后，适合于草鱼肠巨噬细胞原代培养的条件也不清楚。因此，如何有效分离、纯化和原代培养草鱼肠巨噬细胞成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。
为了实现本发明的第一个目的，本发明采用了以下技术方案：
一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法，包括以下步骤：
S1、在无菌环境下，获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理，所述预处理的操作为：将所述肠道外脂肪与肠系膜除去，纵向剖开肠管并清除粪便，之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层，最后用PBS缓冲液振荡清洗，得到肠壁明显变薄且颜色变为淡黄色至白色的肠段；
S2、将所述肠段充分处理成碎块，并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化，消化结束后过滤得到滤液，将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物，将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液；
S3、按照鱼类脏器单核细胞分离试剂盒的说明从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞。
进一步，所述步骤S1中健康草鱼中后段肠道的获取操作为：用自来水冲洗健康草鱼的体表后敲打草鱼头部致死，立即放入75％乙醇中浸泡20s，取出肠道中后段；所述预处理在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中进行，肠段用PBS缓冲液振荡清洗3次，所述PBS缓冲液的浓度0.01mol/L，pH7.4；
所述步骤S1中，采用无菌弯头镊子刮除肠黏液与上皮细胞层；
所述步骤S2中碎块的体积<1mm3，所述碎块置于胶原酶IV消化液中放入28℃振荡培养箱振荡消化2h，所述振荡培养箱的转速为250转/分钟；消化结束将所述胶原酶IV消化液过400目筛网获得滤液，之后将所述滤液以1800rpm离心8min并收集细胞沉淀物，使用Hank's平衡液洗涤所述细胞沉淀物并使用所述Hank's平衡液将所述细胞沉淀物配成浓度为1×108个/mL的肠黏膜固有层单细胞悬液。
进一步，所述的胶原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及胶原酶IV组成，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的质量浓度为1.7mg/mL，所述Hank’s平衡液在胶原酶IV消化液中的体积百分数为95％，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的体积百分数为5％。
为了实现本发明的第二个目的，本发明采用了以下技术方案：
一种所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，用RPMI 1640基础培养液将上述肠巨噬细胞悬液稀释后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，培养4h后进行第一次换液，继续培养至12h后进行第二次换液，最终获得纯化后的草鱼肠巨噬细胞；换液时弃去全部陈旧培养液并加入新鲜的含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液。
进一步，所述肠巨噬细胞悬液稀释后浓度为3×106个/mL；所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞培养板接种量为100μL/孔；所述培养箱内温度28℃、CO2体积含量5％。
进一步，所述RPMI 1640基础培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液组成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液在RPMI1640基础培养液中的体积百分数分别为94％、5％、1％。
进一步，所述的含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液构成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液在RPMI 1640完全培养液中的体积百分数分别为84％、10％、5％、1％。
为了实现本发明的第三个目的，本发明采用了以下技术方案：
一种所述草鱼肠巨噬细胞的原代培养方法，用含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液将纯化后的草鱼肠巨噬细胞液浓度进行调整后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，待细胞开始贴壁生长后，用含脂多糖的RPMI 1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，换液时吸出一半旧培养液，再补加新鲜的含脂多糖的RPMI 1640完全培养液。
进一步，所述肠巨噬细胞悬液调整后浓度为3×106个/mL；所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞培养板接种量为100μL/孔；所述培养箱内温度28℃、CO2体积含量5％。
进一步，所述含脂多糖的RPMI 1640完全培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清、脂多糖以及抗微生物液组成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液在含脂多糖的RPMI 1640完全培养液的体积百分数分别为84％、10％、5％、1％；所述脂多糖在含脂多糖的RPMI 1640完全培养液中的浓度为20μg/mL。
本发明的有益效果在于：
1)本发明首次建立了一种简单、可操作性强、重复性好的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法。
2)本发明中除去肠黏液和肠上皮细胞层是分离肠巨噬细胞的关键起始步骤。除去陆生恒温动物(如小鼠和大鼠)肠黏液和肠上皮细胞层的方法是将肠段与含DTT和EDTA的缓冲液在37℃孵育30min以上，DTT可打断黏蛋白分子之间的二硫键而快速除去肠黏液，EDTA螯合剂能与肠上皮细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，使肠上皮细胞分散、脱落，从而为后续胶原酶消化提供良好环境。但是草鱼是生活在水环境中的变温动物，其肠道细长且弯曲，肠壁较薄，肠组织细胞的结构及组成也与陆生恒温动物有一定差异。研究发现即使将DTT和EDTA浓度降低，它们对草鱼肠细胞仍有较大损伤，由此分离获得的肠巨噬细胞活力明显下降，培养12h后就发生死亡。对此，本发明使用无菌弯头镊子刮除草鱼肠黏液与上皮细胞层，只需15min即可获得除去肠黏液和肠上皮细胞层的肠道，这比陆生恒温动物的方法至少节省一半时间，而且分离获得的肠巨噬细胞的活力较高。
3)选择适宜的酶类消化草鱼肠黏膜固有层获得固有层单细胞悬液是分离肠巨噬细胞的第二步。胶原酶是从溶组织梭状芽孢杆菌中提取的水解酶，具有水解结缔组织中胶原蛋白的作用，是消化结缔组织的理想酶类。胶原酶有多种类型，其中胶原酶I和III主要用于哺乳动物组织的消化，胶原酶II主要用于肝脏、甲状腺、骨、心脏和唾液腺的消化；胶原酶IV至少包含7种蛋白酶成分，血清、Ca2+、Mg2+离子等物质对它没有影响，能消化除哺乳动物以外的其他多种动物组织；胶原酶V主要用于胰腺小岛的消化。因此，本发明选择胶原酶IV来消化草鱼肠黏膜固有层结缔组织，同时考虑到胶原酶的消化时间较长(需要2h)，本发明在消化液中添加了5％胎牛血清，可以有效提高消化后细胞的存活率，所得细胞存活率大于99％。
4)肠黏膜固有层单细胞悬液经脏器单核细胞分离试剂盒分离后虽然可获得较多量巨噬细胞，但仍存在淋巴细胞和粒细胞等杂细胞。陆生恒温动物(如小鼠和大鼠)的肠巨噬细胞表面标记分子已被探明，可使用吸附了标记分子单克隆抗体的免疫磁珠产品来纯化细胞分离液，获得高纯度的肠巨噬细胞。针对尚无鱼类巨噬细胞表面标记分子特异性单克隆抗体的现状，本发明根据淋巴细胞不具有贴壁能力；粒细胞10-24小时内贴壁，且为短寿细胞，培养24h后逐渐死亡；巨噬细胞在2-4小时内贴壁，且贴壁牢固的特性，采用差异贴壁法对分离后的草鱼肠巨噬细胞悬液进一步纯化，经过短时间内2次(4h,12h)更换培养液后，获得了纯度达到95％的贴壁肠巨噬细胞。
5)本发明使用的巨噬细胞RPMI 1640完全培养液中添加5％草鱼自体血清的作用：由于草鱼自体血清具有促进草鱼肠巨噬细胞自增殖、提高活力的作用，使得细胞快速伸展生长，培养5天后细胞汇合度即可达到95％或以上，细胞存活率为99.4％，细胞至少可存活20天，这时细胞存活率仍超过90％。
6)本发明所获得的草鱼肠巨噬细胞生长良好、纯度和活性较高，为开展口服疫苗免疫草鱼后诱导的肠道黏膜免疫应答研究提供了良好的细胞模型。
附图说明
图1为本发明草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法流程图。
图2倒置显微镜下观察的纯化前后的草鱼肠巨噬细胞形态图(400×)，其中A为分离后纯化前的肠巨噬细胞(箭头所示)，视野中仍可见少量杂细胞；B为纯化后的肠巨噬细胞。
图3为倒置显微镜下观察的培养不同时间的草鱼肠巨噬细胞形态图(400×)，其中A-F分别代表培养1、2、3、4、5和20天后细胞形态图。
图4为染色后的草鱼肠巨噬细胞形态与结构图，其中A为光镜下经瑞氏染色的巨噬细胞形态与结构，放大倍数为1000倍；B为透射电镜下经醋酸铀-柠檬酸染色的巨噬细胞的形态与结构，放大倍数为3000倍。Nu、Ly、Mt分别代表细胞核、溶酶体和线粒体。
图5为草鱼肠巨噬细胞特异性标记分子gcMCSFR基因扩增电泳图，其中M为DNAMarker，1为RPMI 1640完全培养液阴性对照，未扩增到特异性DNA条带，2为培养的贴壁细胞，扩增出特异性DNA条带。
图6为吞噬了拟态弧菌的草鱼肠巨噬细胞的电镜照片(3000×)，其中Nu为细胞核，A为吞噬的拟态弧菌，B为吞噬泡中已开始降解变形的拟态弧菌。
具体实施方式
现结合以下实施例和附图对本发明进行详细地描述。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为对本发明的范围和实质的限制。
本发明还提供了草鱼肠巨噬细胞的鉴定方法，包括细胞形态学检查、细胞特异性标志分子检测、细胞吞噬功能检测和细胞氧呼吸爆发活性检测：
其中，细胞形态学检查是将一部分培养24h的贴壁细胞进行瑞氏吉姆萨染色，光学显微镜油镜(1000×)下观察细胞形态结构并拍照，另一部分细胞制作超薄切片，经磷钨酸染色后在透射电镜(3000×)下观察细胞超微结构；
细胞特异性标志分子检测，采用如下步骤：使用RNA提取试剂盒提取培养24h后的细胞总RNA，并反转录成cDNA。根据草鱼巨噬细胞特异性标志分子序列(集落刺激因子受体，gcMCSFR)设计并合成一对特异性引物(5’-ACCGATGTGATTCTCAGCTC-3’；5’-TCGGGTCTATGAAGGGTAG-3’)，以cDNA为模板，RT-PCR检测gcMCSFR基因并进行测序鉴定；
吞噬功能检测，采用如下步骤：用含20μg/mL LPS的RPMI 1640完全培养液将巨噬细胞浓度调整至2×106个/mL，接种12孔细胞培养板，1mL/孔，28℃、5％CO2培养箱中培养24h，吸去细胞培养液，Hank's平衡液洗3次，加入浓度为1.5×107CFU/mL的拟态弧菌菌株04-14福尔马林灭活菌液，1mL/孔，28℃孵育30min，3％戊二醛固定后制作超薄切片，透射电镜(3000×)下观察细胞吞噬细菌情况并拍照；
氧呼吸爆发活性检测，采用如下步骤：分别用RPMI 1640完全培养液(未刺激组)和含20μg/mL LPS的RPMI 1640完全培养液(刺激组)将巨噬细胞浓度调整至3×106个/mL，接种96孔细胞培养板，100μL/孔，每组每一培养时间点重复3孔，28℃、5％CO2培养箱中培养。分别于培养后12h、24h和36h采用常规NBT法检测细胞的氧呼吸爆发活性。
需要说明的是，在上述NBT法检测氧呼吸爆发活性实施方案中，所用的PMA(佛波豆寇乙酸脂)溶液和NBT(硝基蓝四氮唑)溶液配制方法如下：
PMA溶液：取1mg PMA溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，配成1mg/mL的母液，经0.22μm滤器过滤除菌，分装于PCR管中，每管10μL，-20℃避光保存。
NBT溶液：称取1mg NBT溶于1mL不含抗生素的RPMI 1640基础培养液中，加1μLPMA溶液，经0.22μm滤器过滤，现配现用。
以下为本发明中有关术语的解释：
胶原酶(Collagenase)，是从溶组织梭状芽孢杆菌中提取的水解酶，具有水解结缔组织中胶原蛋白的作用。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，其中胶原酶IV至少包含7种蛋白酶成分，血清、Ca2+、Mg2+离子等物质对它无影响且对分离细胞没有毒性，可用于多种动物多种组织细胞的消化。
肠黏膜固有层单细胞悬液：即肠黏膜固有层经胶原酶消化后获得的分散细胞悬液，其中含有巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞。
脂多糖(LPS)：是革兰阴性菌细胞壁外膜中的重要组成成分,微量LPS能够活化单核巨噬细胞系统，促进细胞因子释放，促进补体的活化和抗体的产生，对特异性免疫反应具有调节作用。
密度梯度离心分离细胞法：是将处理后的组织单细胞悬液加在细胞分离液梯度介质中进行离心沉降，由于各种细胞的密度不同，在一定离心力作用下将细胞分配到梯度中某个特定位置中，形成不同细胞层，从而达到分离细胞的目的。
氧呼吸爆发活性：是指巨噬细胞的氧依赖性杀菌途径之一，巨噬细胞吞噬微生物后，活化胞内膜结合氧化酶，使还原型辅酶氧化，继而催化氧分子还原为系列反应性氧中间物，从而发挥杀菌作用。活性氧产生的水平在一定范围内直接反映巨噬细胞的活化水平和杀菌能力。
实施例1草鱼肠巨噬细胞的分离
1.1草鱼肠黏液和肠上皮细胞层的去除
选取250g左右健康草鱼，用自来水冲洗体表，敲打头部致死，迅速放入75％乙醇中浸泡20s。超净工作台上无菌取出肠道中后段，放于含有预冷的无菌PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)的培养皿中，用无菌弯头镊子去除肠道外脂肪与肠系膜，纵向剖开肠管并清洗粪便。尔后，用无菌弯头镊子反复刮肠壁内侧肠黏液与上皮细胞层，直至无黏液刮下(需要15min)，随后用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)轻微振荡清洗3次，此时，肉眼可见肠黏液与上皮细胞脱落进入PBS缓冲液，PBS缓冲液变混浊，得到肠壁明显变薄、颜色变为淡黄色至白色的肠段。
1.2草鱼肠黏膜固有层单细胞悬液制备
将上述处理后的肠段充分剪碎(体积<1mm3)，称取5g肠组织块置于50mL离心管中，加入10mL胶原酶IV消化液(用Hank’s平衡液配制的1.7mg/mL胶原酶IV，并添加5％(V/V)FBS(胎牛血清))，放入28℃振荡培养箱振荡(250转/分钟)消化2h。将消化后细胞液过400目筛网，滤液转入15mL离心管，1800rpm离心8min，收集细胞沉淀，Hank's平衡液洗1次并配成浓度为1×108个/mL的单细胞悬液，其中含有巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞。
1.3草鱼肠黏膜固有层巨噬细胞分离
使用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒(天津灏洋华科生物科技有限公司产品)通过不连续密度梯度离心从上述单细胞悬液中分离肠巨噬细胞。即在15mL离心管中依次缓慢加入3mL分离液1，2mL分离液2，制成梯度界面。吸取5mL上述制好的单细胞悬液加在分离液液面上(各界面分层一定要清晰)，1800rpm/min离心30min，此时离心管内容物被分为五层，由上而下依次是稀释液层、环状乳白色上层(富含巨噬细胞)、环状乳白色下层(富含淋巴细胞)、分离液层和红细胞层。用巴氏吸管小心吸取环状乳白色上层至另一15mL离心管中，用Hank's平衡液洗3次，1800rpm/min离心8min，弃上清，用1mL RPMI 1640基础培养液(94％RPMI 1640培养液(Gibco产品)，5％FBS，1％抗微生物液)重悬细胞沉淀。将0.4％台盼蓝染液与等体积悬浮细胞混合，染色2～3min，取1滴悬液加入细胞计数器内，显微镜下进行细胞计数和细胞存活率计算﹝细胞存活率＝未染色细胞/(蓝染细胞+未染色细胞)×100％﹞。结果显示每尾鱼(250g左右)可分离得到1mL浓度约为3×107个/mL的肠巨噬细胞悬液，细胞存活率大于99％，细胞纯度大约为89％，但仍存在少量的淋巴细胞和粒细胞等杂细胞(图2A)。
实例2草鱼肠巨噬细胞的纯化
采用差异贴壁法对分离获得的肠巨噬细胞悬液进一步纯化。即用RPMI1640基础培养液重悬上述分离的肠巨噬细胞，调整细胞密度至3×106个/mL并铺于96孔细胞培养板中，100μL/孔，28℃、5％CO2培养箱中培养，于培养后4h进行第一次换液，换液时弃去陈旧培养液，加入新鲜的含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液(84％RPMI 1640培养液(Gibco产品)，10％FBS，5％草鱼自体血清，1％抗微生物液)继续培养至12h，再次换液，弃去陈旧培养液，加入含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液继续培养。结果发现培养2h后巨噬细胞就开始贴壁，经过短时间内2次换液(第4h和12h)后，倒置显微镜观察发现贴壁巨噬细胞单层的纯度可达到95％以上(图2B)。
实例3草鱼肠巨噬细胞的原代培养
用含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液(84％RPMI 1640培养液，10％FBS，5％草鱼血清，1％抗微生物液)将纯化后的巨噬细胞浓度调整至3×106个/mL，接种96孔细胞培养板，100μL/孔，28℃、5％CO2培养箱中培养，待细胞开始贴壁生长后，用含20μg/mL LPS的RPMI 1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，换液时吸出500μL旧培养液，再补加500μL含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液，继续在培养箱中培养。结果显示，培养1d后多数巨噬细胞开始伸展生长,并有少数细胞团块出现(图2A)；培养后2-3d时间段细胞继续伸展生长呈各种形状，体积逐渐增大(图2B-C)；培养后4-5d时间段细胞多呈圆形或多边形，体积明显增大，细胞汇合度逐渐增加，至第5天细胞汇合度达到95％,细胞存活率为99.4％(图2D-E)；培养后20天细胞存活率仍超过90％(图2F)，随后细胞逐渐出现萎缩、凋零，悬浮于培养液中，培养后25天细胞完全死亡。
实例4培养的草鱼肠巨噬细胞鉴定
4.1细胞形态学检查
在直径为35mm培养皿中放入细胞爬片，将草鱼肠巨噬细胞悬液加入培养皿进行培养。培养24h后，取出细胞爬片，Hank's平衡液漂洗，瑞氏吉姆萨染色后光学显微镜下观察细胞形态结构并拍照。同时，用巴氏吸管吹散培养皿中的贴壁细胞，收集于离心管中，3000rpm/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用1mL预冷的3％戊二醛4℃避光固定10min，6000rpm/min，4℃离心5min，弃固定液，按照透射电镜用超薄切片制作方法进行系列脱水，包埋，制作超薄切片，经醋酸铀-柠檬酸染色后在透射电镜(日立，HT7700)下观察细胞超微结构。结果如图4A所示，油镜下可见细胞呈圆形或肾形，大小在6-12μm之间，胞浆丰富，含有空泡和染成淡蓝色颗粒；胞核较大、深蓝色，偏居于细胞一端。透射电镜下可见细胞周围有伪足形态不规则的突起，胞内有线粒体、溶酶体等细胞器，胞核呈马蹄形(图4B)。这些结果符合巨噬细胞的形态结构特征。
4.2细胞特异性标志分子检测
草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体(gcMCSFR)是草鱼肠巨噬细胞的特异性标志分子。本发明中，将浓度为3×106个/mL的草鱼肠巨噬细胞悬液接种12孔细胞培养板，1mL/孔，共5孔，用RPMI 1640完全培养液培养，待细胞密度达到80％时，弃培养液，每孔加入1mLTrizol裂解液吹打，直至细胞全部脱落。按试剂盒说明书(美国Omega公司)提取细胞总RNA，并反转录成cDNA作为模板。根据草鱼巨噬细胞的特异性标志分子gcMCSFR(草鱼巨噬细胞集落刺激因子受体)序列(GenBank登录号KF444352)设计并合成一对特异性引物(5’-ACCGATGTGATTCTCAGCTC-3’；5’-TCGGGTCTATGAAGGGTAG-3’)，用于扩增gcMCSFR基因。25μLPCR扩增体系为：ddH2O 9.5μL，cDNA模板2.0μL(同时做RPMI 1640完全培养液阴性对照)，20μmol/L上下游引物各0.5μL，高保真Mix 12.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃再延伸10min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，并与pMD18-T Simple载体连接成pMD18-T-gcMCSFR，送通用生物公司进行测序鉴定。结果如图5所示，从巨噬细胞中扩增出大小约为1607bp的目的基因条带，而RPMI 1640完全培养液中未检测到目的基因。测序序列与GenBank收录中的gcMCSFR基因同源性达99.8％，仅在第284(G→A)、443(T→C)和821位(T→C)碱基处发生了无意突变。结果表明培养的细胞为巨噬细胞。
4.3肠巨噬细胞的功能验证
(1)吞噬功能检测
用含20μg/mL LPS的RPMI 1640完全培养液将巨噬细胞浓度调整至2×106个/mL，接种12孔细胞培养板，1mL/孔，28℃、5％CO2培养箱中培养24h，用巴氏吸管轻轻吸去细胞培养液，Hank's平衡液洗3次，加入浓度为1.5×107CFU/mL拟态弧菌菌株04-14的福尔马林灭活菌液，1mL/孔，28℃孵育30min，3％戊二醛固定后，制作超薄切片，透射电镜(日立，HT7700)下观察并拍照。电镜下可观察到细胞内出现较多拟态弧菌，有些吞噬泡内的细菌已开始变形降解(图6)，说明经LPS刺激培养24h的肠巨噬细胞具有较强的吞噬功能。
(2)氧呼吸爆发活性检测
分别用RPMI 1640完全培养液(未刺激组)和含20μg/mL LPS的RPMI 1640完全培养液(刺激组)将巨噬细胞浓度调整至3×106个/mL，接种96孔细胞培养板，100μL/孔，每组每一培养时间点孔，28℃、5％CO2培养箱中培养。分别于培养后12h、24h和36h，每孔加入100μL、1mg/mL NBT(含1μg/mL PMA)，28℃避光作用1h。尔后，每孔加入120μL无水甲醇作用15min，于96孔板水平式离心机1280rpm离心10min，弃上清，用70％甲醇洗3次，每孔再加入120μL DMSO(二甲基亚砜，Sigma公司产品)和140μL、2mol/L KOH，漩涡震荡5min，生成蓝色沉淀，酶标仪测定OD620nm值，以140μL KOH/120μL DMSO混合液调零。结果如表1所示，在各培养时间点LPS均能促进巨噬细胞产生活性氧，LPS组的氧呼吸爆发活性显著高于未刺激对照组(P<0.05)。结果表明经LPS刺激后的肠巨噬细胞具有较好的生物学活性。
表1不同组细胞在不同培养时间点的氧呼吸爆发活性
结论：本发明首次建立了草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化和原代培养方法，利用该方法可获得生长良好、纯度和活性高的草鱼肠巨噬细胞。另外经上述鉴定发现本发明所培养的细胞具有典型巨噬细胞形态结构特征，能转录表达巨噬细胞的特异性标志分子，说明它们是草鱼肠巨噬细胞。功能验证实验证实，经20μg/mL LPS刺激后该草鱼肠巨噬细胞具有较强的吞噬功能和氧呼吸爆发活性。
Claims (7)
1.一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：
S1、在无菌环境下，获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理，所述预处理的操作为：将所述肠道外脂肪与肠系膜除去，纵向剖开肠管并清除粪便，之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层，最后用PBS缓冲液振荡清洗，得到肠壁明显变薄且肠壁颜色变为淡黄色至白色的肠段；
S2、将所述肠段充分处理成碎块，并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化，消化结束后过滤得到滤液，将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物，将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液；
S3、从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞；
所述步骤S1中健康草鱼中后段肠道的获取操作为：用自来水冲洗健康草鱼的体表后敲打草鱼头部致死，立即放入75％乙醇中浸泡20s，取出肠道中后段；所述预处理在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中进行，肠段用PBS缓冲液振荡清洗3次，所述PBS缓冲液的浓度0.01mol/L，pH7.4；
所述步骤S1中，采用无菌弯头镊子刮除肠黏液与上皮细胞层；
所述步骤S2中碎块的体积＜1mm3，所述碎块置于胶原酶IV消化液中放入28℃振荡培养箱振荡消化2h，所述振荡培养箱的转速为250转/分钟；消化结束将所述胶原酶IV消化液过400目筛网获得滤液，之后将所述滤液以1800rpm离心8min并收集细胞沉淀物，使用Hank's平衡液洗涤所述细胞沉淀物，并使用所述Hank's平衡液将所述细胞沉淀物配成浓度为1×108个/mL的肠黏膜固有层单细胞悬液；
所述的胶原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及胶原酶IV组成，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的质量浓度为1.7mg/mL，所述Hank’s平衡液在胶原酶IV消化液中的体积百分数为95％，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的体积百分数为5％；
步骤S3具体为：
在15mL离心管中依次缓慢加入3mL分离液1，2mL分离液2，制成梯度界面；吸取5mL上述制好的单细胞悬液加在分离液液面上，1800rpm/min离心30min，此时离心管内容物被分为五层，由上而下依次是稀释液层、环状乳白色上层、环状乳白色下层、分离液层和红细胞层；用巴氏吸管小心吸取环状乳白色上层至另一15mL离心管中，用Hank's平衡液洗3次，1800rpm/min离心8min，弃上清，用1mL RPMI 1640基础培养液培养液重悬细胞沉淀；
所述RPMI 1640基础培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液组成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液在RPMI 1640基础培养液中的体积百分数分别为94％、5％、1％。
2.一种如权利要求1所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，其特征在于：用RPMI 1640基础培养液将所述肠巨噬细胞稀释后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，培养4h后进行第一次换液，继续培养至12h后进行第二次换液，最终获得纯化后的草鱼肠巨噬细胞；换液时弃去全部陈旧培养液并加入新鲜的含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液。
3.如权利要求2所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，其特征在于：所述肠巨噬细胞稀释后浓度为3×106个/mL；所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞培养板接种量为100μL/孔；所述培养箱内温度28℃、CO2体积含量5％。
4.如权利要求1所述草鱼肠巨噬细胞的纯化方法，其特征在于：所述的含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液构成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液在RPMI 1640完全培养液中的体积百分数分别为84％、10％、5％、1％。
5.一种如权利要求2所述草鱼肠巨噬细胞的原代培养方法，其特征在于：用含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液将纯化后的草鱼肠巨噬细胞液浓度进行调整后接种于细胞培养板并在培养箱中培养，待细胞开始贴壁生长后，用含脂多糖的RPMI 1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，换液时吸出一半旧培养液，再补加新鲜的含脂多糖的RPMI1640完全培养液。
6.如权利要求5所述草鱼肠巨噬细胞的原代培养方法，其特征在于：所述肠巨噬细胞悬液调整后浓度为3×106个/mL；所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞培养板接种量为100μL/孔；所述培养箱内温度28℃、CO2体积含量5％。
7.如权利要求5所述草鱼肠巨噬细胞的原代培养方法，其特征在于：所述含脂多糖的RPMI 1640完全培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清、脂多糖以及抗微生物液组成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清、草鱼自体血清以及抗微生物液在含脂多糖的RPMI 1640完全培养液的体积百分数分别为84％、10％、5％、1％；所述脂多糖在含脂多糖的RPMI 1640完全培养液中的浓度为20μg/mL。
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