CN111304131A - 强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用。所述菌株对鱼类、小鼠等动物具有极强的致病力，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.19467。用1.1×108cfu/ml本发明的活菌液注射许氏平鲉、大菱鲆、小鼠，会造成实验动物在极短的时间内发病死亡，对动物具有强致病力。

Description

强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用。
背景技术：
美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)广泛分布于全球海洋环境中，是弧菌科(Vibrionaceae)发光杆菌属(Photobacterium)的一种重要致病菌，包括美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(P.damselae subsp.damselae,PDD)和美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(P.damselae subsp.piscicida,PDP)两个亚种，其中PDP只感染鱼类，而PDD不仅可以感染多种海洋动物，还可以感染人类发病。PDD由美国科学家Love等人首次报道于1981年的Science杂志，分离自患皮肤溃疡病的雀鲷科鱼类Chromis punctipinnis的皮肤病灶处。在该文献中，Love等也提到了PDD感染人类发病的案例。随后，世界各地陆续有PDD感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟等不同海洋动物发病的案例，该菌甚至可以感染鲸豚类等海洋哺乳动物而发病。1982年，Morris等人在The Lancet杂志社首次对PDD感染人类发病的症状进行了描述，证实该菌可以导致伤口感染、流脓和难以愈合等症状。1985年，美国科学家首次报道了PDD感染人类9天后导致死亡的病例。1993年，香港和美国科学家各自报道了1例PDD感染人类导致急性死亡的病例，死亡时间缩短至感染后3天左右。随后，在2004年日本和美国科学家又报道了3例PDD感染人类导致严重的筋膜炎而致死的病例。这些已报道的病例证实了PDD对人类具有极强的致病力，也说明PDD是一种少见的对人类具有致死能力的人鱼共患病原，其在海水养殖环境中广泛分布，不仅会对养殖生产造成经济损失，可能还会对养殖生产从业者造成一些潜在的公共卫生风险，应引起足够的重视。
在前期的研究中，本专利申请人在我国主要的海水养殖区针对PDD开展了系统性的流行病学调查，陆续从我国的山东、河北、江苏、海南等不同地区分离、保存了30余株PDD菌株。后续的病原学研究发现，这些菌株PDD不仅生理生化指标、抗生素药物敏感性等常规表型指标存在较明显的差异外，对鱼类和小鼠的致病力也表现了非常明显的差异，同为108cfu/mL的活菌液注射感染，致病力强的菌株可以导致实验鱼和小鼠在极短的时间内全部死亡，而无致病力的菌株注射的受试鱼和小鼠在整个实验期间却无死亡现象发生。此外，以鱼、鸡和小鼠为免疫对象，无致病力和强致病力的PDD菌株也表现了显著的抗原差异性。
因此，针对无致病力和强致病力的PDD菌株开展研究，有助于开发更加精准的检测技术和免疫防控产品，指导养殖生产高效、全面、有效的防控该菌传播和流行。
发明内容：
本发明要解决的技术问题，是提供一株对鱼类、小鼠等实验动物具有强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium.damselae subsp.damselae)菌株Pdd1605。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium.damselae subsp.damselae)菌株Pdd1605，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日，保藏编号为：CGMCC No.19467。
本发明的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd1605，分离自患病的养殖许氏平鲉的皮肤溃疡病灶处，用1.1×108cfu/ml的活菌液注射许氏平鲉、大菱鲆、小鼠等多种动物，会造成实验动物在极短的时间内发病死亡，证实该菌对动物具有强致病力。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的用途。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：一种强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的用途，用于制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种疫苗。
本发明的有益效果在于：提供了一种具有强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd1605，对动物具有强致病力。因其携带有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的全部毒力因子，因此用于制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种疫苗时，有助于提高疫苗的效价，获得更好的免疫保护保护效果。
附图说明
图1美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd1605的形态；
其中，a：在TSB琼脂培养基上的菌落形态；b：在TCBS琼脂培养基上的菌落形态；c:电镜下的菌株形态。
图2美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd1605在羊血培养基上的溶血表型特征。
图3注射美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd1605与其他3株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株后许氏平鲉的死亡曲线。
图4注射菌株Pdd1605后实验小鼠体表出现溃疡症状。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，拉丁名称为Photobacterium.damselaesubsp.damselae，实验室编号为Pdd1605，分离自患有皮肤溃疡病的许氏平鲉皮肤病灶处，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日，保藏编号为：CGMCC NO.19467。
1.菌株的分离过程
该菌株是从患皮肤溃疡病的许氏平鲉溃疡病灶的组织中分离获得的。具体分离过程为：无菌操作剪取少量许氏平鲉皮肤溃疡病灶处组织，补充适量无菌1.5％NaCl溶液，进行组织匀浆。用接种环挑取均匀的组织，在TSB琼脂培养基上进行划线培养24h后，挑取培养基上优势菌的一个单菌落，转接至另一个新的TSB琼脂培养基上进行再次划线培养24h，挑取一个新的单菌落再次转接至一个新的TSB琼脂培养基上进行划线培养24h，培养温度均为28℃。连续进行单菌落纯化培养3次后，获得的纯培养物即是本发明所述的菌株。
2.菌株的鉴定过程
初步鉴定：
菌落形态：将菌株Pdd1605在TSB琼脂培养基上培养24h后(培养温度为28℃)，结果显示菌落呈白色圆形，不透明，表面光滑，中部稍微隆起，直径约1-2mm(图1a)。在TCBS培养基上同样可以生长，且菌落呈绿色(图1b)。利用透射电镜观察发现，菌株为杆状、单根极生鞭毛，菌体大小约为(1.8～2.2)×(0.5～0.8)μm(图1c)。即可初步断定菌株Pdd1605为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株。
进一步鉴定：将上述获得纯培养物菌株提取细菌总体DNA，分别用引物对A：5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'，5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'；以及引物对B：5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'，5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'进行同步的PCR检测。PCR反应体系为：2×TSINKE Master Mix 12.5μL，正、反向引物(10μM)各0.5μL，细菌DNA模板1μL，无菌双蒸水10.5μL，共计25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃1min，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，最后4℃保存。检测结果只有A、B两对引物同时出现PCR反应阳性，则证实分离获得的纯培养物是强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株。
3.致病力检测：
(1)挑取该菌株纯培养物，用TSB培养基在28℃条件下进行增菌培养，刮取培养的单菌落于无菌的无菌1.5％NaCl溶液中，制备1.0×108cfu/ml的活菌液。用牛津杯法制作绵羊血琼脂平板，吸取40μL上述制备好的活菌液加入到牛津杯孔中，置于28℃条件下培养48h，测定溶血圈的大小。如图2所示，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株Pdd1605在羊血培养基上表现为β溶血，具有很强的溶血能力。
(2)选用4株不同的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种对许氏平鲉进行人工感染实验。实验共设9组，其中8个实验组和1个对照组，每组有体重48.6±3.1g的许氏平鲉30尾。感染方式采用背部肌肉注射的方式，实验组注射剂量为0.1mL 1.1×108cfu/ml或1.1×105cfu/ml的活菌液，对照组注射0.1mL 1.5％的无菌NaCl溶液。实验结果如图3所示，表明菌株Pdd1605对许氏平鲉具有极强的致病力，108cfu/ml的菌液浓度下，30尾实验鱼全部死亡的时间不足1天。而其余3株菌株14天内30尾实验鱼的死亡率均低于10％，甚至无死亡。
(3)采用注射的方式用菌株Pdd1605对小鼠进行人工感染实验，注射剂量为0.1mL/10g体重的1×108cfu/ml的活菌液，注射部位为腹腔注射。感染实验结果如图4所示，表明注射菌株Pdd1605的10只实验小鼠在3天内全部死亡，部分小鼠还出现了体表溃疡症状，而注射生理盐水的对照组小鼠一切正常，证实Pdd1605对小鼠也具有极强的致病力。

Claims (3)

1.一种强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株(Photobacterium.damselaesubsp.damselae)，其特征在于：所述菌株对鱼类、小鼠等动物具有极强的致病力，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.19467。
2.如权利要求1所述的强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，其特征在于：用1.1×108cfu/ml的活菌液注射许氏平鲉、大菱鲆、小鼠，会造成实验动物在极短的时间内发病死亡，对动物具有强致病力。
3.一种如权利要求1所述的强致病力的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，其特征在于：用于制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种疫苗。
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