CN107513553B - 一种筛选具有拮抗空肠弯曲杆菌感染功能的乳酸菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请人提供了一种筛选具有拮抗空肠弯曲杆菌感染功能的乳酸菌的方法，包括如下步骤：(1)秀丽隐杆线虫的同期化培养；(2)C.jejuni及乳酸菌的培养及菌悬液的制备；(3)具有拮抗C.jejuni感染功能的乳酸菌筛选。本发明首先建立C.jejuni感染线虫模型，并用该模型对具有拮抗C.jejuni感染效应的乳酸菌进行筛选。经过与寄生虫C.jejuni共感染模型小鼠实验结果对比，确认该秀丽隐杆线虫模型筛选具有体内拮抗C.jejuni感染功能乳酸菌具有快速、准确的优点。

Description

一种筛选具有拮抗空肠弯曲杆菌感染功能的乳酸菌的方法
技术领域
本发明涉及益生菌筛选技术领域，尤其是涉及一种利用秀丽隐杆线虫模型快速筛选具有拮抗空肠弯曲杆菌感染功能的乳酸菌的方法。
背景技术
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)为革兰氏阴性菌，属于弯曲杆菌属。C.jejuni广泛分布于自然界，可通过动物、食物、水、牛奶等传播，能定植于各种野生动物和家禽、家畜的肠道内。接触禽畜类，食入未煮熟或受污染的鸡肉、牛肉、未彻底杀菌的牛奶以及污染的水都可以引起人类感染。近些年来，空肠弯曲杆菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。在一些发达国家，空肠弯曲杆菌感染引起的腹泻病例数甚至超过了沙门氏菌和志贺氏菌，成为最常见的腹泻致病菌。在发展中国家，空肠弯曲杆菌是婴幼儿感染性腹泻最常见的病原菌。人感染空肠弯曲杆菌后，最常见的会引起肠胃炎、腹泻、发烧以及腹部绞痛，免疫力低下者会进一步引起一系列的并发症，例如胆囊炎、腹膜炎、脑膜炎、败血症和骨髓炎等。空肠弯曲杆菌引起的最严重的并发症是格林-巴利综合征(Guillian-Barré Syndrome,GBS)，它会引起轴突的损伤及不可逆的神经伤害，导致呼吸肌麻痹而死亡。
目前临床治疗C.jejuni感染的常用手段为抗生素，但抗生素的使用会带C.jejuni及肠道菌对抗生素的耐药性，抗生素过度使用还会导致体内抗生素的残留。利用益生菌替代抗生素干预并治疗消化道细菌感染已经成为国内外食品科学与生物医药研究的一个重要领域。研究表明乳酸菌能在体内、外能有效干预C.jejuni的感染。乳酸菌干预C.jejuni感染的机理主要包括：乳酸菌能够产生抗菌物质抑制C.jejuni的生长；粘附性高的乳酸菌可以通过空间位阻效应或者产生抑制物质来抑制C.jejuni对宿主细胞的粘附；乳酸菌对肠道形态的完整性具有显著的保护作用，从而减轻C.jejuni对肠道上皮的感染症状；乳酸菌还可以向细胞外分泌一些具有免疫调节活性的物质，如胞外多糖和其它分泌蛋白，这些成分参与免疫调节或直接引起免疫应答，从而在抑制细菌定植等方面发挥作用。
迄今为止，对乳酸菌拮抗C.jejuni的研究主要涉及体外及体内证据。就体外而言，主要集中于乳酸菌抑菌活性成分分析、抑菌物质对C.jejuni毒力基因表达的抑制、乳酸菌对C.jejuni粘附和侵袭细胞的抑制等。然而某些体外实验效果良好的菌株在动物体内拮抗C.jejuni的效果却不尽如人意，体外实验的结果往往不能代表乳酸菌在体内拮抗C.jejuni感染的作用。而对于动物模型，研究多集中于禽类及小鼠。禽类感染模型是研究C.jejuni在体内定植的良好模型，但在模拟C.jejuni感染所导致的一系列病理症状和免疫反应方面并无优势，且造模时间一般在1-2月。而正常小鼠体内固有肠道菌群所产生的“定植抗性”阻止了C.jejuni在小鼠体内的有效定植，因此普通小鼠C.jejuni感染模型难以成功，因此多采用寄生虫共感染的方法或利用基因敲除小鼠构建C.jejuni的感染模型，然而以上两种模型或危险性较高或操作复杂且造价昂贵，且造模时间也多在4-6周。因此，用家禽、小鼠等动物造模筛选具有体内拮抗C.jejuni感染功能的乳酸菌均存在代价高、周期长、操作较繁琐、免疫应答指标不显著等缺点，不适用于功能性乳酸菌的大规模快速筛选。
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)属于假体腔动物，以细菌为食，培养方法简单，可以作为分子生物学和发育生物学研究的模式生物。虽然秀丽隐杆线虫是一类非常简单的生物，但其免疫调控机制仍然十分复杂，不乏进化上高度保守的通路。秀丽隐杆线虫因其易培养，易观察，全基因组清楚，免疫通路高度保守等优点，也受到致病微生物研究者的广泛关注，被作为一种研究菌体间拮抗功能的理想模型。因此秀丽隐杆线虫作为一种相对更为简单的模式生物，用以构建一个相对简单快速且和哺乳动物之间存在相似的致病菌毒力激活机制、感染过程及免疫反应的动物模型，具有快速、准确、成本低等优势，能够满足大规模快速筛选具有体内拮抗C.jejuni感染效应乳酸菌的需求。且目前国内尚无以秀丽隐杆线虫作为模型动物筛选具有体内拮抗消化道病原菌功能的益生菌的发明专利。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种利用秀丽隐杆线虫为模型筛选具有拮抗空肠弯曲杆菌感染功能的乳酸菌的方法。本发明首先建立C.jejuni感染线虫模型，并用该模型对具有拮抗C.jejuni感染效应的乳酸菌进行筛选。经过与寄生虫C.jejuni共感染模型小鼠实验结果对比，确认该秀丽隐杆线虫模型筛选具有体内拮抗C.jejuni感染功能乳酸菌具有快速、准确的优点。
本发明的技术方案如下：
一种筛选具有拮抗空肠弯曲杆菌感染功能的乳酸菌的方法，包括如下步骤：
(1)秀丽隐杆线虫的同期化培养；
(2)C.jejuni及乳酸菌的培养及菌悬液的制备；
(3)具有拮抗C.jejuni感染功能的乳酸菌筛选。
步骤(1)的具体操作方法为：
(1)将大肠杆菌OP50接种于液体培养基中振荡培养，当OD600为1.0-1.2时，震荡混匀后吸取菌液滴加在秀丽隐杆线虫生长NGM平板上并涂布均匀，培养并贮存备用；
(2)秀丽隐杆线虫冻存管冻融，离心，弃上清，将线虫倒入长有大肠杆菌OP50的NGM平板使其复苏；待线虫长成成虫后，用移液枪吸取无菌水反复冲洗平板，并将含有线虫的液体转移至离心管中，吸取含有线虫的无菌水悬液加入新的离心管中，并加入氢氧化钠溶液和次氯酸钠溶液，充分混匀；
(3)每振荡2-3分钟后将离心管置于显微镜下观察，直到看不到大片的线虫碎片；离心，无菌水清洗；用S培养基液重悬，将含有虫卵的S培养基液培养，离心收集L1期线虫，转移到长有大肠杆菌OP50的NGM培养板中，备用。
步骤(2)的具体操作方法为：
(1)C.jejuni菌株于37℃三气培养箱培养后，挑取单菌落，转接于灭菌的改良BHI溶液中进行扩大培养，离心收集菌体，收集的菌体经磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于磷酸盐缓冲液中，备用；
(2)待筛选的益生菌菌株活化后，接种于相应液体培养基中，静置培养，离心收集菌体，收集的菌体经磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于磷酸盐缓冲液中，菌体密度为108CFU/mL，备用。
步骤(3)的具体操作方法为：
(1)将同期化培养得到的秀丽隐杆线虫的幼虫转移到长有大肠杆菌OP50的NGM平板上，培养获得L4期线虫；
(2)挑取线虫转移至改良NGM平板中，每板中含有线虫条数为80-100条，对照组中加入大肠杆菌OP50菌悬液，干预组中加入乳酸菌菌悬液，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，不同组别分别加入对应菌悬液；
(3)持续三天后，干预组停止喂食乳酸菌，对照组和干预组中均加入C.jejuni菌悬液，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，记录每组线虫死亡条数，改良NGM平板中加入C.jejuni菌悬液；
(4)以首次加入C.jejuni菌悬液当天为观察第0天，观察时用挑虫器末端轻轻触碰虫体，无反应则认为线虫已经死亡，直至线虫全部死亡即实验终止；采用秀丽隐杆线虫模型快速筛选具有拮抗C.jejuni感染效应的乳酸菌时，乳酸菌优先干预三天，随后喂食C.jejuni，在模型后期，一般为喂食C.jejuni 12天以后，乳酸菌干预组存活的线虫条数多于对照组存活条数的30％或是干预组线虫最长寿命比对照组延长20％以上的，即认为该组乳酸菌具有良好的拮抗C.jejuni的能力。
所述L1期线虫是指线虫虫卵培养后发育成为与成虫结构相似且形态略小的幼虫。
所述三气培养箱中含有体积百分数为5％的O2，10％的CO2，85％的N2。
所述改良BHI溶液是指将线虫重悬于去离子水中，细胞破碎2～4次后加入至BHI溶液中，并加入终浓度为0.05～0.15wt％甘胆酸钠，灭菌即可。
所述L4期线虫是指线虫虫卵培养后发育成为与成虫结构相似的幼虫。
所述改良NGM平板是指普通NGM培养基倒板前，在融化的培养基三角瓶中加入4～8％的无菌绵羊血，倾倒于无菌培养皿中，即为改良NGM平板。
以下为每一个步骤具体的操作方法和试验参数。
1、线虫的同期化培养
将大肠杆菌OP50接种于5mLLB(Luria.Bertani)液体培养基中，37℃150r/min振荡培养12h，当OD600为1.0-1.2时，震荡混匀后吸取200μL菌液滴加在线虫生长NGM(NematodesGrowth Medium)平板上并涂布均匀，37℃培养12h，4℃贮存备用。
线虫冻存管置于37℃恒温水浴锅冻融，1300×g离心1分钟，弃上清，将线虫倒入长有大肠杆菌OP50的NGM平板，20℃放置使其复苏。待线虫长成成虫后，用移液枪吸取无菌水反复冲洗平板，并将含有线虫的液体转移至10mL离心管中，吸取3.5mL含有线虫的无菌水悬液加入新的离心管中，并加入0.5mL 5M氢氧化钠溶液和1mL 5％的次氯酸钠溶液，充分混匀。每振荡2-3分钟后将离心管置于显微镜下观察，直到看不到大片的线虫碎片，裂解时间不超过8分钟。1300×g离心1分钟，无菌水清洗两次，用S培养基液(5.58g氯化钠，1g磷酸氢二钾，6g磷酸二氢钾，1mL5mg/mL胆固醇，定容至1L，高压灭菌，后加入10mL1M柠檬酸钾溶液，3mL1M氯化钙溶液，3mL1M硫酸镁溶液，充分混匀)重悬，将含有虫卵的S培养基液放于20℃培养8-12h，1500×g离心3min收集L1期线虫(线虫虫卵于20℃培养8-12h后发育成为与成虫结构相似且形态略小的幼虫，该时期的线虫称为L1期线虫)，转移到长有大肠杆菌OP50的NGM培养板中，备用。
2、C.jejuni及乳酸菌的培养及菌悬液的制备
C.jejuni菌株以含体积分数为30％甘油的培养基冻存于-80℃超低温冰箱中，使用时先于4℃下解冻并在哥伦比亚血平板上划线接种，于37℃三气培养箱(5％O2，10％CO2，85％N2)培养48h后，挑取单菌落，转接于灭菌的改良BHI(100条线虫重悬于1mL去离子水中，60Hz、30s细胞破碎三次后加入至9mL的BHI溶液中，并加入0.1％甘胆酸钠，121℃灭菌15min)溶液中进行扩大培养48h，2800r/min离心5min收集菌体，收集的菌体经pH 7.3的磷酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于磷酸盐缓冲液中，备用。
待筛选的益生菌菌株均保存于添加了30％(v/v)甘油的deMan Rogosa andSharpe(MRS)培养基中，保存温度为-80℃，菌株在实验之前先活化转接2次。菌株活化的方法为以2％(v/v)的接种量将冻存的菌接种到相应培养基中，在37℃条件下培养18h后再以同样的接种量转接一次至新鲜的培养基。菌株活化后，以2％(v/v)接种量接种于相应液体培养基中，37℃静置培养18h，7000r/min离心5min收集菌体，收集的菌体经pH 7.3的磷酸盐缓冲液洗涤3次，重悬于磷酸盐缓冲液中，菌体密度为108CFU/mL，备用。
3、具有拮抗C.jejuni感染功能的乳酸菌筛选
将L1时期的幼虫转移到长有大肠杆菌OP50的NGM平板上，20℃培养48小时获得L4期线虫(线虫虫卵于20℃培养72h后发育成为与成虫结构相似的幼虫，该时期的线虫称为L4期线虫)。
用无菌挑虫器挑取线虫转移至改良NGM平板(普通NGM培养基倒板前，在融化的培养基三角瓶中加入6％的无菌绵羊血，倾倒于无菌培养皿中，即为改良NGM平板)中，每板中含有线虫条数大致为80-100条，对照组中加入终浓度为108CFU/mL大肠杆菌OP50菌悬液200μL，干预组中加入终浓度为108CFU/mL的乳酸菌菌悬液200μL，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，不同组别分别加入对应菌悬液。持续三天后，干预组停止喂食乳酸菌，对照组和干预组中均加入108CFU/mL的C.jejuni菌悬液200μL，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，记录每组线虫死亡条数，改良NGM平板中加入108CFU/mL的C.jejuni菌悬液200μL(以加菌当天为观察第0天，观察时用挑虫器末端轻轻触碰虫体，无反应则认为线虫已经死亡，直至线虫全部死亡即实验终止)。
采用秀丽隐杆线虫模型快速筛选具有拮抗C.jejuni感染效应的乳酸菌时，乳酸菌优先干预三天，随后喂食C.jejuni，在模型后期，一般为喂食C.jejuni12天以后，乳酸菌干预组存活的线虫条数多于对照组存活条数的30％或是干预组线虫最长寿命比对照组延长20％以上的，即认为该组乳酸菌具有良好的拮抗C.jejuni的能力。
本发明有益的技术效果在于：
本发明建立了C.jejuni NCTC11168感染秀丽隐杆线虫模型，该模型和一般动物模型相比，有着耗时短，费用低，操作简单等优点。已有的C.jejuni体内感染模型，造价昂贵，操作复杂，且实验周期长，不适合用于大规模考察益生菌体内拮抗C.jejuni感染效果，而本发明所建立的C.jejuni感染秀丽隐杆线虫模型则刚好弥补了现有动物模型的缺陷。使用本专利中的线虫模型得到的乳酸菌在寄生虫共感染小鼠模型中可得到相似的结果，说明该线虫模型准确可行且又避免了寄生虫共感染小鼠模型构建时的危险性和复杂性。
本发明实验结果准确、操作方便、便于大规模筛选使用，成本低、时间短。选用的生物模型为秀丽隐杆线虫，易于培养及检测，每个样品仅需进行线虫水平上的检测，且以此方法得到的结果与小鼠实验结果匹配程度高，而花费时间远低于小鼠体内实验所耗时间，节约了大量的时间及耗材成本，也更符合动物伦理的要求。
本发明实用性强。能够批量地对多株菌株同时进行测定，非常适用于功能个体差异大的益生菌在拮抗空肠弯曲杆菌方面的筛选。
本发明是一种利用秀丽隐杆线虫模型快速筛选具有拮抗C.jejuni感染作用的乳酸菌的方法，通过这种实验方法可快速、准确地筛选出具有优良拮抗C.jejuni感染作用的乳酸菌，对阐述乳酸菌体内拮抗C.jejuni的作用机制及开发抗C.jejuni感染的功能性乳酸菌具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1C.jejuni NCTC11688感染线虫模型。
图2为实施例2线虫感染采用改良BHI培养的C.jejuni后线虫体内C.jejuni毒力基因flaA的变化。
图3为实施例3采用改良NGM平板线虫感染C.jejuni后体内C.jejuni定植量的变化。
图4为实施例5乳酸菌有效降低C.jejuni在体内的定植量的示意图。
图5为实施例5对乳酸菌预感小鼠三天以及五天后C.jejuni体内清除率和乳酸菌干预线虫后感染C.jejuni的存活率进行相关性分析。
图6为实施例6乳酸菌干预线虫感染C.jejuni后线虫中C.jejuni的定植示意图。
图7为实施例6对C.jejuni感染线虫六天后C.jejuni线虫体内清除率和线虫感染C.jejuni的存活率进行相关性分析。
图8为实施例7乳酸菌干预线虫感染C.jejuni后对线虫免疫调节的影响。
图9为实施例7对C.jejuni感染线虫三天后C.jejuni线虫体MAPK(Spp-1)以及Daf-16(Daf-16)信号通路变化率和线虫感染C.jejuni的存活率进行相关性分析。
图10为实施例8乳酸菌干预线虫感染C.jejuni后线虫体内C.jejuni毒力基因flaA的变化。
图11为实施例8对C.jejuni感染线虫三天后体内C.jejuni毒力基因flaA表达量和线虫感染C.jejuni的存活率进行相关性分析。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进行具体描述。
实施例1：以C.jejuni NCTC11688感染线虫模型建立及改良BHI使用对C.jejuni提高线虫致死率的影响
实施例中用的C.jejuni的菌株为模式菌株，编号为NCTC 11168，购买自美国模式培养物研究所(American Type Culture Collection，ATCC)，但本专利应该可以适用于所有C.jejuni，并取得类似的效果。
本发明首先构建了C.jejuni NCTC11688感染线虫模型，如图1所示，图1中线虫的处理方式为将L1时期的幼虫转移到长有大肠杆菌OP50的NGM平板上，20℃培养48小时获得L4期线虫。用无菌挑虫器挑取线虫转移至改良NGM平板中，每板中含有线虫条数大致为80-100条，大肠杆菌组中加入终浓度为108CFU/m L的大肠杆菌OP50菌悬液200μL，C.jejuni组中加入终浓度为108CFU/mL的普通培养C.jejuni菌悬液200μL，改良C.jejuni组中加入利用改良BHI(100条线虫重悬于1mL去离子水中，60Hz、30s细胞破碎三次后加入至9mL的BHI溶液)培养的108CFU/mL的普通培养C.jejuni菌悬液200μL，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，记录每组线虫死亡条数，不同组别分别加入对应菌悬液。图1的实验结果显示，单独喂食E.coli OP50的线虫最长寿命可达三周，改良C.jejuni感染组的线虫最长寿命只有两周，在整个试验周期里，改良C.jejuni感染组线虫的死亡率远高于大肠杆菌OP50对照组以及普通C.jejuni感染组。结果说明108CFU/mL的利用改良BHI液体培养的C.jejuni对线虫具有更明显的毒力作用，使得线虫的寿命相较之未改良前明显缩短。
实施例2：线虫感染BHI中加入甘胆酸钠培养的C.jejuni后线虫体内C.jejuni毒力基因flaA的变化
本实施例考察预线虫感染BHI中加入质量分数为0.1％甘胆酸钠培养的C.jejuni后线虫体内C.jejuni毒力基因flaA的变化。
C.jejuni毒力基因q RT-PCR引物设计与合成按表1所示
表1C.jejuni的q PCR引物
Figure BDA0001411135830000081
线虫及C.jejuni总RNA的提取和c DNA的合成：
对照组与甘胆酸钠组的线虫喂食108CFU/mL的大肠杆菌OP50和乳酸菌3天后，再次各自感染108CFU/mL的普通培养以及在BHI中加入质量分数为0.1％甘胆酸钠培养的C.jejuni3天，从NGM平板中挑取收集大约100条左右实验组线虫，用PBS清洗离心，将收集的线虫在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL Trizol试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1m L用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μL RNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据TaKaRa公司的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作步骤逆转录合成c DNA，-20℃下保存。
qRT-PCR反应体系及条件：
用Bio-
Figure BDA0001411135830000091
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。
C.jejuni毒力基因qRT-PCR反应体系为：
Figure BDA0001411135830000092
C.jejuni毒力基因qRT-PCR反应条件为：
95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s(40个循环)。
结果如图2所示，利用在BHI中加入质量分数为0.1％甘胆酸钠培养的C.jejuni喂食线虫后，线虫体内C.jejuni毒力基因flaA的表达比对照组提高1.7倍左右，说明在培养液中加入甘胆酸盐可以提高C.jejuni在线虫体内毒力基因的表达。
实施例3：采用改良NGM平板线虫感染C.jejuni后体内C.jejuni定植量的变化
本实施例中对照组和改良组(L4时期线虫喂食108CFU/mL的大肠杆菌OP50和乳酸菌三天后，停止喂食大肠杆菌OP50以及乳酸菌，转而喂食108CFU/mL的C.jejuni)的线虫(开始喂食C.jejuni记为0天，后每两天收集一次线虫)，其中对照组使用普通的NGM平板，改良组采用改良NGM平板(普通NGM培养基倒板前，在融化的培养基三角瓶中加入6％的无菌绵羊血，倾倒于无菌培养皿中，即为改良NGM平板)，收集的线虫M9缓冲液冲洗2次之后，1100×g离心2min，收集线虫，马上加入70％的酒精浸泡40s，消毒线虫表面，然后加入6mL的M9缓冲液稀释酒精浓度，离心2min(1100×g)后，继续用M9缓冲液冲洗2遍，吸取一定量的线虫置于显微镜下观察表面是否完好，并涂平板，观察表面的细菌是否完全除去。在表面消毒后的线虫用振荡器碾碎，期间用移液枪取50μl液体在显微镜下观察，直到看不到大块的线虫碎片为止，将碾碎液用M9缓冲液重悬，并稀释涂平板，计算菌落总数。就图3结果而言，改良组中C.jejuni的定植量比对照组同时期C.jejuni的定植量高出0.5个数量级，说明采用改良NGM平板能有提高进线虫感染C.jejuni后C.jejuni在线虫体内的定植量。
实施例4：以C.jejuni NCTC11688感染的线虫模型筛选具有体内拮抗C.jejuni感染作用并延长线虫寿命的乳酸菌
本实施例以C.jejuni NCTC11688感染线虫模型为基础筛选能保护线虫的乳酸菌。表2表示实施例4所用的乳酸菌菌株。
表2实施例4所用乳酸菌菌株
Figure BDA0001411135830000101
Figure BDA0001411135830000111
表3为乳酸菌拮抗C.jejuni保护线虫效果的统计分析结果。
表3乳酸菌拮抗C.jejuni保护线虫效果的统计分析
Figure BDA0001411135830000112
Figure BDA0001411135830000121
a：用Kaplan-Meier生存模型计算第13天线虫的存活率。
b：DT50，线虫死亡50％所需时间。
表中线虫的处理方式为采用无菌挑虫器挑取L4期线虫转移至改良NGM平板中，每板中含有线虫条数约为80-100条，对照组(E.coli+C.jejuni)和干预组中分别加入终浓度为108CFU/m L大肠杆菌OP50和乳酸菌菌悬液200μL，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，不同组别分别加入对应菌悬液，持续三天后，干预组停止喂食乳酸菌，对照组和干预组中均加入采用改良BHI培养的108CFU/mL的C.jejuni菌悬液200μL，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，各组中均加入采用改良BHI培养的108CFU/mL的C.jejuni菌悬液200μL，空白组(E.coli)中则每天转移至新的NGM平板中并加入终浓度为108CFU/m L大肠杆菌OP50，记录每组线虫死亡条数，从图中结果来看，不同的乳酸菌干预感染C.jejuni的线虫后对其寿命的影响不同，鸡乳杆菌G20，唾液乳杆菌13-7、Z5，卷曲乳杆菌X13，植物乳杆菌N9、N34、427这几株乳酸菌优先干预线虫后，线虫感染C.jejuni后寿命与对照组相比，寿命明显提高；然而罗伊氏乳杆菌G14，发酵乳杆菌B，唾液乳杆菌X14以及植物乳杆菌Z6、422反而进一步缩短了感染C.jejuni后线虫的寿命。
实施例5：线虫体内筛选的可拮抗C.jejuni的乳酸菌在小鼠感染模型中的验证
本实施例采用弓形虫、C.jejuni混合感染的C57BL/6小鼠作为实验小鼠。弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，研究表明C57BL/6小鼠灌胃弓形虫后可以产生Th-1型免疫反应，这与炎性肠病引起的免疫反应类似，在弓形虫感染小鼠体内C.jejuni可以大量定植。表4为实施例5所用的乳酸菌菌株，为实施例4中得到的效果差异明显的菌株。
表4实施例5所用乳酸菌菌株
Figure BDA0001411135830000122
Figure BDA0001411135830000131
小鼠灌胃剂的制备：
C.jejuni灌胃剂：取活化2代的C.jejuni并于37℃三气条件下培养至24h，于4℃、2800r/min离心6min收集菌体，弃去上清并用无菌磷酸盐缓冲液重悬菌体，使C.jejuni浓度达到3×109CFU/mL。
乳酸菌灌胃剂：取活化2代的乳酸菌并于37℃(5％O2，10％CO2，85％N2)下培养至24h，于4℃、8000r/min离心3min收集菌体，弃去上清并用无菌磷酸盐缓冲液重悬菌体，使乳酸菌浓度达到5×109CFU/mL。
弓形虫灌胃剂：将慢性感染弓形虫Me49的小鼠处死后取脑组织，加入无菌磷酸盐缓冲液并研磨充分。滴加10μL脑匀浆于载玻片上，于光镜下计数，重复3次。根据计数结果调整脑匀浆浓度，每只小鼠灌胃200μL脑匀浆液，使弓形虫灌胃剂量达到20个包囊/只。
小鼠分组及处理：
每个实验组有8只小鼠，4只小鼠分为1笼，所有小鼠灌胃剂剂量为300μL/只。动物实验第1天，对小鼠灌胃病原；第2、3、4天正常饲养以便病原开始破坏小鼠免疫系统；第5、6天对小鼠分别灌胃C.jejuni和乳酸菌，两次灌胃时间间隔至少1h，以避免灌胃剂之间相互影响；第7、8、9、10天小鼠表现出C.jejuni感染症状；第11天将小鼠处死，动物实验结束。
小鼠粪便C.jejuni活菌数检测：
取小鼠新鲜粪便，精确称重后将粪便在无菌生理盐水中浸泡30min以软化粪便。将粪便悬液充分混匀并梯度稀释，选取合适梯度的稀释液100μL，均匀涂布于添加了弯曲杆菌选择性抗生素的哥伦比亚血平板，置于三气培养箱37℃培养48h，对平板上长出的C.jejuni菌落进行计数。
如图4所示，乳酸菌有效降低C.jejuni在体内的定植量，不同菌株间清除效果存在差异。模型组中，第三天以及第五天C.jejuni在体内的定植量均达到108CFU/g feces，且随着时间的推移，定植量逐渐升高；干预组，在第三天时，G20、13-7、Z5、N8、591干预组的C.jejuni定植量可以减少到105CFU/g feces，与对照组相比，下降了约有3个数量级；到第五天时，由于小鼠受弓形虫感染逐步严重，C.jejuni在小鼠体内的定植也相应的得到了提高，但某些乳酸菌干预后依然表现出良好的清除能力，其中G20、13-7、Z5、N8、591的C.jejuni定植量可以减少到106CFU/g feces，下降了约有两个数量级。
图5通过SPSS软件采用统计学方法对乳酸菌预感小鼠三天以及五天后C.jejuni体内清除率和线虫感染C.jejuni的存活率进行相关性分析，从结果来看，乳酸菌预感小鼠三天以及五天后C.jejuni体内清除率和线虫感染C.jejuni的存活率的R2指数分别达到了0.63703和0.57832，说明两者具有强相关性，反映出线虫感染C.jejuni模型能良好模拟小鼠感染C.jejuni模型，可作为大规模筛选乳酸菌拮抗C.jejuni感染的良好模式生物。
实施例6：乳酸菌干预影响了感染C.jejuni线虫中C.jejuni的定植
对照组以及干预组的线虫处理方式同实施例4，体外培养C.jejuni均采用改良BHI培养液，线虫孵育均采用改良NGM平板。从图6中A-I结果而言，不同乳酸菌干预后C.jejuni在线虫体内定植量不同，C.jejuni在线虫体内定植量与对照组相比减少较大(下降0.5-1个数量级)的乳酸菌组别有13-7、427、N9、Z5、rui、X13、408、675、5691，其中13-7、427、N9、Z5、X13也是对干预线虫感染C.jejuni后对线虫寿命有提高的菌株，图7通过SPSS软件采用统计学方法对C.jejuni感染线虫六天后C.jejuni线虫体内清除率和线虫感染C.jejuni的存活率进行相关性分析，从结果来看，其R2指数达到了0.52965，两者具有强相关性，说明乳酸菌干预后C.jejuni在线虫体内定植量的减少与其干预线虫感染空弯后线虫寿命的提高存在很高的相关性，空弯定植量的减少很有可能是其毒力减少的一个重要因素。以上线虫体内C.jejuni定植率也可以用于具有拮抗C.jejuni功能的乳酸菌的筛选。
实施例7：乳酸菌干预线虫感染C.jejuni后对线虫免疫调节的影响
考察乳酸菌干预线虫感染C.jejuni后对线虫免疫调节的影响，表5为实施例7所用的菌株。
表5实施例7所用菌株
Figure BDA0001411135830000151
线虫防御基因qRT-PCR引物设计与合成按表6所示。
表6线虫防御基因的q PCR引物
Figure BDA0001411135830000152
Figure BDA0001411135830000161
线虫总RNA的提取和c DNA的合成
对照组与干预组的线虫喂食108CFU/mL的大肠杆菌OP50和乳酸菌3天后，再次感染采用改良BHI培养的108CFU/mL的C.jejuni3天，从改良NGM平板中挑取收集大约100条左右实验组线虫，用PBS清洗离心，将收集的线虫在加有液氮的研钵(180℃，4h高温灭酶)中反复研磨，再向研钵中加入1mL Trizol试剂，继续研磨，待液体基本澄清后，收集至1.5mL无酶离心管中，室温静置15min，向离心管中加入200μL三氯甲烷溶液，轻摇15s，室温静置10min，4℃、12000r/min离心15min，取600μL上层无色水相至另一只无酶离心管中，加入500μL异丙醇。上下颠倒混匀，室温下静置10min，静置结束后，4℃、12000r/min离心10min，弃去上清，留下RNA在离心管底部形成的白色沉淀，加入1m L用DEPC水配制的75％的乙醇溶液，漩涡震荡重悬，4℃、7500r/min离心5min，弃去上清，室温自然挥发干燥。向干燥的RNA中加入30μLRNase free water，待RNA溶解后，以Nanodrop测定RNA浓度及纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。以提取的总RNA为模板，根据TaKaRa公司的PrimeScript 1st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒说明书操作步骤逆转录合成c DNA，-20℃下保存。
q RT-PCR反应体系及条件：
用Bio-
Figure BDA0001411135830000171
CFX96TM实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并读取荧光信号。线虫防御基因q RT-PCR反应体系为：
i TaqTMUniversal
Figure BDA0001411135830000172
Green Supermix 10μL
上游引物(10μmol/L) 1μL
下游引物(10μmol/L) 1μL
c DNA模板 1μL
dd H2O 7μL
线虫防御基因q RT-PCR反应条件为：
95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s(40个循环)。
从图8中结果来看，寿命劣势菌防御基因表达量与对照组相比基本无差异，寿命优势菌的防御基因表达量则相应提高，不同乳酸菌组别之间存在差异。图9通过SPSS软件采用统计学方法对C.jejuni感染线虫三天后C.jejuni线虫体MAPK(Spp-1)以及Daf-16(Daf-16)信号通路变化率和线虫感染C.jejuni的存活率进行相关性分析，从结果来看，其R2指数分别达到了0.85664和0.72836，两者具有强相关性。乳酸菌干预后对线虫的防御基因的表达调控主要集中在MARK与Daf-16信号通路以及某些具有抗菌功能的抗菌肽基因，而这些基因也被认为是线虫抵御致病菌的一些主要的防御基因，这也说明乳酸菌可能是通过调节这些信号通路上的关键基因从而发挥保护作用的。以上线虫防御基因的变化也可以用于具有拮抗C.jejuni功能的乳酸菌的筛选。
实施例8：乳酸菌干预线虫感染C.jejuni后线虫体内C.jejuni毒力基因flaA的变化
本实施例考察乳酸菌干预线虫感染C.jejuni后线虫体内C.jejuni毒力基因flaA的变化，表7为实施例8所用的菌株。
表7实施例8所用菌株
Figure BDA0001411135830000181
该实施例相应的实现方法详见实施例2。体外培养C.jejuni均采用改良BHI培养液，线虫孵育均采用改良NGM平板。
从图10中结果来看，寿命劣势菌C.jejuni的毒力基因flaA表达量与对照组相比基本无差异，寿命优势菌的C.jejuni的毒力基因flaA表达量则得到了很大程度的降低。图11通过SPSS软件采用统计学方法对C.jejuni感染线虫三天后体内C.jejuni毒力基因flaA表达量和线虫感染C.jejuni的存活率进行相关性分析，从结果来看，其R2指数分别达到了0.9122，两者具有强相关性。以上线虫体内C.jejuni毒力基因flaA表达量的变化也可以用于具有拮抗C.jejuni功能的乳酸菌的筛选。

Claims (4)

1.一种筛选具有拮抗空肠弯曲杆菌感染功能的乳酸菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)秀丽隐杆线虫的同期化培养；
(2)C.jejuni及乳酸菌的培养及菌悬液的制备；
(3)具有拮抗C.jejuni感染功能的乳酸菌筛选；
步骤(1)的具体操作方法为：
(1)将大肠杆菌OP50接种于液体培养基中振荡培养，当OD600为1.0-1.2时，震荡混匀后吸取菌液滴加在秀丽隐杆线虫生长NGM平板上并涂布均匀，培养并贮存备用；
(2)秀丽隐杆线虫冻存管冻融，离心，弃上清，将线虫倒入长有大肠杆菌OP50的NGM平板使其复苏；待线虫长成成虫后，用移液枪吸取无菌水反复冲洗平板，并将含有线虫的液体转移至离心管中，吸取含有线虫的无菌水悬液加入新的离心管中，并加入氢氧化钠溶液和次氯酸钠溶液，充分混匀；
(3)每振荡2-3分钟后将离心管置于显微镜下观察，直到看不到大片的线虫碎片；离心，无菌水清洗；用S培养基液重悬，将含有虫卵的S培养基液培养，离心收集L1期线虫，转移到长有大肠杆菌OP50的NGM培养板中，备用；
步骤(2)的具体操作方法为：
(1)C.jejuni菌株于37℃三气培养箱培养后，挑取单菌落，转接于灭菌的改良BHI溶液中进行扩大培养，离心收集菌体，收集的菌体经磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于磷酸盐缓冲液中，备用；所述改良BHI溶液是指将线虫重悬于去离子水中，细胞破碎2～4次后加入至BHI溶液中，并加入终浓度为0.05～0.15wt％甘胆酸钠，灭菌即可；
(2)待筛选的益生菌菌株活化后，接种于相应液体培养基中，静置培养，离心收集菌体，收集的菌体经磷酸盐缓冲液洗涤，重悬于磷酸盐缓冲液中，菌体密度为108CFU/mL，备用；
步骤(3)的具体操作方法为：
(1)将同期化培养得到的秀丽隐杆线虫的幼虫转移到长有大肠杆菌OP50的NGM平板上，培养获得L4期线虫；
(2)挑取线虫转移至改良NGM平板中，每板中含有线虫条数为80-100条，对照组中加入大肠杆菌OP50菌悬液，干预组中加入乳酸菌菌悬液，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，不同组别分别加入对应菌悬液；
(3)持续三天后，干预组停止喂食乳酸菌，对照组和干预组中均加入C.jejuni菌悬液，此后每天将活体线虫转移至新的改良NGM平板中，记录每组线虫死亡条数，改良NGM平板中加入C.jejuni菌悬液；
(4)以首次加入C.jejuni菌悬液当天为观察第0天，观察时用挑虫器末端轻轻触碰虫体，无反应则认为线虫已经死亡，直至线虫全部死亡即实验终止；采用秀丽隐杆线虫模型快速筛选具有拮抗C.jejuni感染效应的乳酸菌时，乳酸菌优先干预三天，随后喂食C.jejuni，在模型后期，喂食C.jejuni12天以后，乳酸菌干预组存活的线虫条数多于对照组存活条数的30％或是干预组线虫最长寿命比对照组延长20％以上的，即认为该组乳酸菌具有良好的拮抗C.jejuni的能力；
所述改良NGM平板是指普通NGM培养基倒板前，在融化的培养基三角瓶中加入4～8％的无菌绵羊血，倾倒于无菌培养皿中，即为改良NGM平板。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述L1期线虫是指线虫虫卵培养后发育成为与成虫结构相似且形态略小的幼虫。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述三气培养箱中含有体积百分数为5％的O2，10％的CO2，85％的N2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述L4期线虫是指线虫虫卵培养后发育成为与成虫结构相似的幼虫。
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