CN112501115A - 一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，属于生物技术领域。本发明的分离纯化方法包括取得无菌的肌肉组织，高效率的消化肌肉组织以得到大量的肌肉单核细胞以及通过percoll梯度纯化获得高纯度的兔肌肉干细胞。应用本发明的纯化方法，可以稳定的获得纯度超过90％(以CD56染色为阳性计)的兔肌肉干细胞。应用本发明的方法，为兔的肌肉干细胞的培养提供了有效的分离提取方法。

Description

一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法

技术领域

本发明涉及一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，属于生物技术领域。

背景技术

近年来随着我国社会经济的飞速发展，肉类农产品的供求出现了严重的不平衡。传统的畜牧业资源消耗多，对环境污染严重，还存在着动物福利与动物疫病等一系列问题，矛盾日益突出，亟需发展绿色的肉类生产技术。细胞培养肉是近些年兴起的一项具有颠覆性的肉类生产技术，是依据动物肌肉生长修复机理，利用体外培养获得肉类的一种技术。培养肉的生产首先需要获得肌肉干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞等种子细胞。其中最有前途的是肌卫星细胞，它们是肌肉的主要成体干细胞。

肌肉干细胞又称为肌卫星细胞，是位于肌肉组织基膜和肌细胞膜之间的一类单核干细胞，一般处于静息状态。当受到刺激或者损伤时会被激活，通过增殖、分化为成肌细胞。一部分可以与其他成肌细胞融合为新的多细胞核肌管，从而形成肌纤维；另一部分自我更新补充干细胞，以保持自身数量稳定。肌肉干细胞经过分离提取可以实现体外培养，进行增殖、分化形成肌肉组织。肌肉干细胞培养首要需解决的问题就是在体外分离得到纯度高的肌肉干细胞。近些年，对于大型哺乳动物猪、羊、牛等的肌肉干细胞的提取及培养有了系统的发展，而对于兔肌肉干细胞的提取分离并没有具有很好效果的分离方法。

兔子作为一种肉食食材，口感细腻，肉质鲜嫩，受到了广大消费者的青睐。兔肌肉干细胞的提取及分离也是细胞培养肉发展过程中重要的部分之一，如何将兔肌肉干细胞从肌肉组织中提取并纯化，进而实现体外培养是培养出兔肉的关键步骤。据现有文献报道，兔肌肉干细胞的分离主要有组织块贴壁法和酶消化法，组织块贴壁法污染较大，且肌肉干细胞所占比例低，成纤维细胞、骨骼肌细胞等杂细胞较多，纯度低不适合兔肌肉干细胞的体外研究。传统的酶消化法采用胶原蛋白酶Ⅰ消化或者与胰蛋白酶结合消化，但初生兔肌纤维间间隙较大,排列不紧密，其间分布有多个结缔组织细胞，且兔肉筋膜较多，不易剔除，因此消化效率低、获得的细胞量较少。在肌肉干细胞的纯化方面，可采用差速贴壁法、密度梯度离心法、流式分选法。差速贴壁法虽然鉴别，但获得的兔肌肉干细胞纯度不高(<40％)；流式分选法虽然能够获得较高纯度的肌肉干细胞，但需要使用抗体，不仅成本高昂，并且针对兔肌肉干细胞的特异性表面标志物还未得到充分鉴定。Percoll密度梯度离心法根据不同类型细胞间细胞密度的差别将肌肉干细胞纯化，是一种低成本、简单、高纯度分离肌肉干细胞的方法。Percoll溶液的浓度梯度决定了所分离细胞的数量和纯度，已有文献报道的分离兔肌肉干细胞采用的是80％和20％或60％和20％的percoll浓度，其溶液密度相差较大，纯化率虽相较于差速贴壁法高，但仍低于70％，并不能满足作为培养肉生产种子细胞的要求。因此，开发一种高效的、稳定的兔肌肉干细胞提取及分离纯化方法具有重要的意义。

发明内容

针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供一种用于动物细胞培养肉或干细胞研究的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法。

本发明第一个目的是提供一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，所述方法包括如下步骤：

将兔碎肌肉组织置于含有胶原蛋白酶XI的基础培养基中孵育消化；

将兔肌肉干细胞采用percoll浓度梯度90％，55％，40％，35％，27.5％进行纯化。

本发明的一种实施方式，一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，包括如下步骤：

(1)兔肌肉干细胞提取

S1：选取七日龄的幼兔，采用CO₂安乐处死，在无菌环境下将兔解剖，除菌处理获得兔肌肉组织；

S2：将S1获得的兔肌肉组织用手术刀切碎，用镊子小心去除脂肪、血管、结缔组织，得到碎肌肉组织；

S3：将S2获得的碎肌肉组织置于含有1vol％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗和胶原蛋白酶XI的DMEM培养液中37℃孵育消化50-70min，每隔10min用5-50mL医用注射器吹打消化混合物，直到达到消化终点获得消化混合物；

S4：向S3获得的消化混合物加入1倍体积的PBS缓冲液，并充分混合均匀，混合液离心，收集沉淀，加入胰蛋白酶液进行二次消化获得消化混合物；

S5：向S4获得的消化混合物加入0.5倍体积的胎牛血清终止反应，终止胰蛋白酶消化，加入等量的含有2vol％胎牛血清的PBS缓冲液，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液；

S6：将S5所述悬浮液反复吹打混合均匀，通过70μm的滤网过滤，离心收集沉淀；将细胞重悬，并通过40μm的滤网过滤，2000rpm条件下离心5min，弃去上清获得细胞沉淀；

(2)兔肌肉干细胞的纯化

S7：将S6获得的细胞用基础培养基充分重悬，采用上述percoll浓度梯度对细胞进行纯化得到细胞沉淀；

(3)兔肌肉干细胞培养和诱导分化

S8：将S7获得的兔肌肉干细胞重悬于完全培养基中，接种在铺好matrigel的胶板中，37℃、5％CO₂条件下进行培养。

本发明的一种实施方式中，S1所述除菌处理为将去除内脏的整只兔子在70-75vol％乙醇中浸泡1min，除菌处理的整只兔子保存在含有1vol％青霉素、链霉素、和两性霉素B抗生素溶液的PBS缓冲液中。

本发明的一种实施方式中，S2所述的收集兔肌肉组织为用手术刀或手术剪收集兔子的腿部及背部肌肉，切碎至0.5-1.5mm³。

本发明的一种实施方式中，S3所述DMEM培养液，包含有抗生素的质量体积浓度为1vol％，其中抗生素溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素的含量为10000μg/mL，两性霉素B的含量为25μg/mL。

本发明的一种实施方式中，S3所述的胶原蛋白酶XI的质量体积浓度为0.1-0.5％，碎肌肉和胶原酶液的质量体积比例为1:2-1:5；

本发明的一种实施方式中，S3所述消化的终点为消化混合物顺畅通过10-16G的注射器针头。

本发明的一种实施方式中，S4所述离心为使用2000rpm离心5min，将上清再次离心5min，沉淀中加入胰蛋白酶液充分重悬合并两次重悬液，37℃消化10-12min。

本发明的一种实施方式中，S4所述胰蛋白酶的质量体积浓度比例为0.25％，碎肌肉和胶原酶液的质量体积比例为1:2-1:5。

本发明的一种实施方式中，S7中所述的percoll梯度纯化，用于梯度纯化的percoll溶液的浓度分别为90％，55％，40％，35％，27.5％，按从高到低的浓度将2mLpercoll溶液缓慢加入15mL离心管中，在最上层缓慢加入细胞悬液，1680g，离心20min，从55％和40％之间的界面层获得单核细胞，加入5倍体积的PBS缓冲液重悬，1680g，离心4min，去除上清；重复操作，收集细胞沉淀。

本发明的一种实施方式中，S7所述的基础培养基为包括5-15vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基；S8所述的完全培养基为包括5-25vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗的DMEM培养基。

本发明的第二个目的是，提供上述兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法在动物细胞肉培养、干细胞研究中的应用。

有益效果：

本发明提供的兔肌肉干细胞的分离纯化方法细胞得率高，在7日龄兔每克兔肉得到约1-2×10⁶个肌肉干细胞。分离过程中受污染几率小，在消化的过程中，与胶原蛋白酶Ⅰ相比，采用胶原蛋白酶XI，消化过程中，时间缩短，消化液没有粘连的筋膜等组织，可以顺畅通过5-50mL医用注射器，肌肉组织消化充分，结合滤网过滤和percoll梯度纯化，可以减少非肌肉干细胞的比例，从而得到高纯度的肌肉干细胞，干细胞的纯度通过流式分析表面标志物CD56的染色比例达到90％以上，为兔的肌肉干细胞的培养提供了有效的分离提取方法。

附图说明

图1为幼兔肌肉干细胞分离后的流式分析图。

图2为为幼兔肌肉干细胞percoll纯化后流式分析图。

图3为经percoll分离纯化后幼兔肌肉干细胞培养7天细胞显微照片。

图4为经percoll分离纯化后幼兔肌肉干细胞分化为肌管的细胞显微照片。

具体实施方式

实施例1：兔肌肉干细胞分离提取

(1)解剖兔

选取七日龄的幼兔，采用CO₂安乐处死，于生物安全柜中使用高压灭菌手术器械无菌将兔解剖，去除内脏；将去除内脏的整只兔子在75vol％乙醇中浸泡1min。除菌处理的整只兔子用PBS缓冲液清洗2次，随后保存在含有1vol％青霉素、链霉素和两性霉素B三抗溶液的PBS缓冲液中。

(2)获取兔肌肉组织

于生物安全柜中将兔子的外皮剥下，撕去兔子的外层筋膜，将兔子四肢以及背部的肌肉用手术刀全部取下，放入培养皿中，用手术刀将肌肉组织切碎，并在过程中剔除脂肪、结缔等组织，将肌肉组织切碎至0.5-1.5mm³。

(3)消化获得肌肉干细胞单细胞群

将获得的碎肌肉组织置于含有1vol％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗和0.1-0.5vol％胶原蛋白酶XI的DMEM培养液的50mL离心管中，碎肌肉和胶原蛋白酶液的质量体积比例为1:2-1:5。37℃孵育消化50-70min，每隔10min用5-50mL医用注射器吹打消化混合物，直到达到消化终点，消化的终点为消化混合物顺畅通过10-16G的注射器针头。向获得的消化混合物加入1倍体积的PBS缓冲液，并充分混合均匀。混合液2000rpm离心5min，收集沉淀，加入0.25vol％胰蛋白酶液进行二次消化，37℃孵育10-12min，向获得的消化混合物加入0.5倍体积的胎牛血清终止胰蛋白酶消化，并加入等量的含有2vol％胎牛血清的PBS缓冲液，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液。

(4)过滤网纯化细胞

将所获得的悬浮液反复吹打混合均匀，通过70μm的滤网过滤，获得的滤液2000rpm离心5min收集沉淀；将用2vol％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，并通过40μm的滤网过滤，获得的滤液在2000rpm条件下离心5min，弃去上清，收集细胞沉淀。

取少许所获得的细胞进行计数，取5×10⁴个细胞重悬于100μL含有1vol％BSA的PBS溶液中，用抗体CD56(串联荧光基团PE-Cy7)染色，冰上孵育45-60min。染色后，细胞悬液置于350g离心5min收集细胞，PBS缓冲液洗涤两次。将细胞重悬于基础培养基中。使用流式细胞分析仪(BD FACSAriaⅢ)进行分析。

结果显示如图1所示，每克肌肉组织分离得到的单个核细胞数量约1×10⁷个，肌肉干细胞特异性标志物CD56比例约为25％。

实施例2：兔肌肉干细胞纯化

(1)配置percoll溶液

用1.5M PBS稀释100％的percoll溶液，配制成90％的percoll溶液，在此基础上进一步用0.15M PBS稀释配制浓度分别为90％，55％，40％，35％，27.5％的percoll溶液。

(2)密度梯度纯化肌肉干细胞

将(1)中配置好的2mL percoll溶液按从高到低的浓度缓慢加入15mL离心管中，在最上层缓慢加入实施例1中的细胞悬液2mL，1680g离心30min。从55％和40％之间的界面层获得单核细胞。加入5倍体积的PBS缓冲液重悬，1680g离心4min，去除上清；重复操作，收集细胞沉淀。

(3)流式分析

取少许所获得的细胞进行计数，取5×10⁴个细胞重悬于100μL含有1vol％BSA的PBS溶液中，用抗体CD56染色(串联荧光基团PE-Cy7)，冰上孵育45-60min。染色后，细胞悬液置于350g离心5min收集细胞，PBS缓冲液洗涤两次。将细胞重悬于基础培养基(89vol％DMEM、10vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基)中。使用流式细胞分析仪(BD FACSAriaⅢ)进行分析。

经纯化，每克兔肌肉组织得到约2×10⁶个细胞。如图2所示，通过流式分析，percoll纯化得到的细胞CD56阳性率达90％以上。

实施例3：兔肌肉干细胞培养和诱导分化

将实施例2中percoll纯化得到的兔肌肉干细胞重悬于含有完全培养基的15mL离心管中(79vol％DMEM、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗的DMEM培养基)，最终细胞密度为5×10⁴/mL接种在铺好matrigel的胶板中，37℃、5％CO₂条件下进行培养。待细胞达到90％汇合度时，更换为分化培养基(97vol％DMEM培养基、2vol％马血清、1vol％青霉素-链霉素)，37℃、5％CO₂条件下诱导肌肉干细胞分化为多核肌管，培养5天左右后，显微镜下见到细长状多核肌管。

结果如图3和4所示，新鲜分离的肌肉干细胞呈圆形，体积较小，随培养时间延长细胞逐渐展开，体积增大，呈梭型、贴壁状态生长，利用分化培养基诱导分化后，兔肌肉干细胞融合形成多核肌管。

实施例4兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法用于制备含动物蛋白肉的食品

按照实施例1-3的方法培养肌肉干细胞，收集培养后的肌肉干细胞，作为制备动物蛋白肉的原料。

收集培养后的肌肉干细胞，以0.5～1×10⁶接种在胶原蛋白水凝胶支架上，添加分化培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3～5天，使肌肉干细胞分化形成肌纤维。收集分化完成的肌纤维，添加交联剂及食品风味剂。可选地，交联剂及食品风味剂按添加量的百分比包括：谷氨酰转氨酶5-10‰，食用盐10-15‰，焦磷酸盐3-5‰，三聚磷酸盐3-5‰，大豆蛋白15-20‰，重组血红素30-45‰，经通过充分混合，形成具有真实肉色和肉风味的细胞培养肉产品，可以根据需求进行烹调处理。

对比例1：利用胶原蛋白酶I消化得到肌肉干细胞单细胞群

取实施例1(2)中获得的碎肌肉组织置于含有1vol％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗和0.1-0.5vol％胶原蛋白酶I的DMEM培养液中，后续具体实施方式同实施例1(3)、(4)。

结果显示，每克肌肉组织分离得到的单个核细胞数量约3×10⁶个，与利用胶原蛋白酶XI结果相比，每克肌肉组织分离得到的单个核细胞数量少了66％。

对比例2：利用不同的浓度梯度percoll纯化肌肉干细胞

文献报道出现的浓度梯度percoll有以下几种，分别是浓度梯度为80％，20％和浓度梯度为60％，20％，用1.5M PBS稀释100％的percoll溶液，配制成90％的percoll溶液，在此基础上进一步用0.15M PBS稀释配制浓度分别为80％，20％和60％，20％的percoll溶液。密度梯度纯化肌肉干细胞同实施例2(2)，流式分析方法同实施例2(3)。经纯化，每克兔肌肉组织得到约2×10⁵和3×10⁵个细胞。通过流式分析，percoll纯化得到的细胞CD56阳性率为75％和70％。

表1不同Percoll浓度纯化细胞结果

Percoll浓度	80％，20％	60％，20％
			每克兔肌肉组织得到的细胞数	2×10<sup>5</sup>	3×10<sup>5</sup>
CD56阳性率	75％	70％

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

将兔碎肌肉组织置于含有胶原蛋白酶XI的基础培养基中孵育消化；

将兔肌肉干细胞采用percoll浓度梯度90％，55％，40％，35％，27.5％进行纯化。

2.如权利要求1一种兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)兔肌肉干细胞的提取：

S1：选取幼兔，处死，将在无菌环境下兔解剖，除菌处理获得兔肌肉组织；

S2：将S1获得的兔肌肉组织切碎，去除脂肪、血管、结缔组织，得到碎肌肉组织；

S3：将S2获得的碎肌肉组织置于含有抗生素和胶原蛋白酶XI的DMEM培养液中孵育消化，直到达到消化终点获得消化混合物；

S4：向S3获得的消化混合物加入PBS缓冲液，混合均匀并离心，收集沉淀，加入胰蛋白酶液进行二次消化获得消化混合物；

S5：向S4获得的消化混合物加入胎牛血清终止消化，加入含有胎牛血清的PBS缓冲液，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液；

S6：将S5所述悬浮液混合均匀，过滤，离心收集沉淀；将细胞重悬，并再次通过滤网过滤，离心，弃去上清得到细胞沉淀；

(2)兔肌肉干细胞的纯化：

S7：将S6获得的细胞用基础培养基重悬，采用权利要求1所述的percoll浓度梯度对细胞进行纯化得到细胞沉淀；

(3)兔肌肉干细胞培养和诱导分化：

S8：将S7获得的兔肌肉干细胞重悬于完全培养基中，接种在铺好matrigel的胶板中，30-40℃、1-10％CO₂条件下进行培养。

3.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，S1所述除菌处理为将去除内脏的整只兔子在70-75vol％乙醇中浸泡1-5min，保存在含有抗生素的PBS缓冲液中。

4.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，S2所述碎肌肉组织是将兔的肌肉组织切碎至0.5-1.5mm³。

5.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，权利要求1所述胶原蛋白酶XI的质量体积浓度为0.1-0.5％，碎肌肉和胶原酶液的质量体积比例为1:2-1:5。

6.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，权利要求2所述消化的终点为消化混合物顺畅通过10-16G的注射器针头。

7.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，S4所述胰蛋白酶的质量体积浓度比例为0.1-0.5％，碎肌肉和胶原酶液的质量体积比例为1:2-1:5。

8.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，权利要求1所述的percoll梯度纯化，按从高到低的浓度将2mL percoll溶液缓慢加入容器中，在最上层加入细胞悬液，离心，从55％和40％之间的界面层获得单核细胞，加入5倍体积的PBS缓冲液重悬，离心，去除上清；重复操作，收集细胞沉淀。

9.根据权利要求1-2任一所述的兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法，其特征在于，S7所述的基础培养基包括5-15vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基；S8所述的完全培养基包括5-25vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗的DMEM培养基。

10.权利要求1-9任一所述兔肌肉干细胞的提取分离及纯化方法在动物细胞肉培养、干细胞研究中的应用。

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