CN112553154A - 一种用于维持脂肪间充质干细胞功能的改良增殖培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于培养肉种子细胞体外扩大培养的改良培养基，即脂肪间充质干细胞的体外扩大培养的改良培养基。改良后的培养基为添加bFGF的生长培养基，采用此改良培养基培养15天获得的细胞总数是对照生长培养基中获得的细胞总数的6倍，并且更为重要的是，脂肪间充质干细胞在体外大量扩增，达到需要的细胞数量之后，仍能保持较高的分化能力。因此，改良培养基有助于在体外获得大量具有功能性的脂肪间充质干细胞，较好地满足培养肉生产对种子细胞的数量和干细胞功能的需求。
Description
技术领域
本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种用于维持脂肪间充质干细胞功能的改良培养基。
背景技术
培养肉是利用畜禽干细胞经过体外培养而获得的肉类，它不需要经过动物养殖，直接用细胞工厂化生产肉类。据报道，作为传统畜牧业的替代模式，可减少现有畜牧生产系统对环境和动物福利造成的负面影响。目前，关于细胞培养肉的大多研究都集中在肌肉细胞及其组织，虽然脂肪只占肉类的一小部分，但它是影响肉类风味、质地、营养和外观的关键因素。因此，在细胞培养肉制品中生产和掺入脂肪至关重要。
培养肉是需要在体外大量培养具有分化能力的种子细胞。脂肪间充质干细胞是目前培养肉种子细胞选择中最具有潜力的细胞之一，在一定的诱导条件下，可向成熟脂肪细胞分化。但是研究表明，脂肪间充质干细胞在体外长期扩增过程中容易失去原始干性，表现出增殖分化潜能降低和细胞衰老。
目前公认的体外培养脂肪间充质干细胞的培养基是含10％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基。畜禽脂肪间充质干细胞在体外扩大培养过程中存在着增殖能力不断衰退，传代后期的细胞细胞分化效率降低甚至完全丧失分化能力。由于培养肉需要大量的种子细胞，但是目前的培养基体系无法满足细胞培养肉对种子细胞的数量和功能要求，因此如何建立一种可以维持猪脂肪间充质干细胞功能的培养条件至关重要。
发明内容
本发明的目的是延缓脂肪间充质干细胞在体外扩大培养过程中增殖和分化能力降低的现象，提供一种可以在体外维持猪脂肪间充质干细胞功能的培养基。
本发明的第一个目的是提供一种用于脂肪间充质干细胞体外扩大培养的增殖培养基，所述增殖培养基为向脂肪间充质干细胞生长培养基中添加生长因子后制备得到，所述脂肪间充质干细胞生长培养基包括基础细胞培养基和胎牛血清。
进一步的，所述生长因子为bFGF。
本发明所述bFGF是指碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growthfactor,bFGF)。
进一步的，基础细胞培养基为DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种
进一步的，所述脂肪间充质干细胞生长培养基中，基础细胞培养基和胎牛血清的体积比为9:1。
进一步的，所述bFGF在脂肪间充质干细胞生长培养基中的浓度为1-10ng/mL。
进一步的，所述bFGF在脂肪间充质干细胞生长培养基中的浓度为5ng/mL。
本发明的第二个目的是提供bFGF在促进脂肪间充质干细胞体外培养过程中的增殖速度，和/或维持脂肪间充质干细胞体外培养过程中的分化潜能中的应用，具体的，所述应用为将bFGF添加到脂肪间充质干细胞生长培养基中，获得前述的增殖培养基，利用所述增殖培养基对脂肪间充质干细胞进行体外扩大培养。
本发明的第三个目的是提供前述的增殖培养基在促进脂肪间充质干细胞体外培养过程中的增殖速度，和/或维持脂肪间充质干细胞体外培养过程中的分化潜能。
本发明所述的脂肪间充质干细胞包括但不限于猪脂肪间充质干细胞，牛脂肪间充质干细胞、羊脂肪间充质干细胞、鼠脂肪间充质干细胞。
前述添加有bFGF的脂肪间充质干细胞生长培养基在脂肪间充质干细胞体外扩大培养过程中维持干细胞功能的研究，包括以下步骤：
(1)以常规脂肪间充质干细胞生长培养基为对照生长培养基，将猪脂肪间充质干细胞分别接种到对照生长培养基、添加有bFGF的脂肪间充质干细胞生长培养基的细胞培养皿中，并进行换液传代培养，记录P3-P5细胞的扩增倍数。
(2)将P5代的脂肪间充质干细胞接种到分化培养皿中，用分化培养基进行诱导分化。
进一步的，脂肪间充质干细胞的获得方式为：无菌分离仔猪皮下脂肪组织，将脂肪组织剪碎成1mm3左右的小块，置于含有3％(体积百分比)的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液中，将剪碎的脂肪组织加入含0.1％(质量比)的Ⅰ型胶原酶的溶液中，所述消化过程还包含采用机械方式促进消化过程；终止消化，产物离心，收集沉淀，得到含有脂肪间充质干细胞的单核细胞群；纯化上述单核细胞群，即得到猪脂肪间充质干细胞；将上述所得沉淀经滤网过滤，红细胞裂解液去除红细胞，贴壁12小时后去除未贴壁的悬浮细胞，即得到待接种的猪脂肪间充质干细胞。
进一步的，将待接种的猪脂肪间充质干细胞分别接种至对照生长培养基、添加bFGF的生长培养基的培养皿中，并进行换液传代培养，观察细胞形态、记录每代细胞的增殖倍数。
进一步的，所述获得的P5代细胞，接种至3.5cm分化培养皿中，生长至细胞完全汇合，加入所述分化培养基，为地塞米松为1μM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤为0.5mM、胰岛素为10μg/mL的含10％胎牛血清的DMEM/F12，持续5天；然后将分化培养基替换为维持培养基，为胰岛素为10μg/mL的含10％胎牛血清的DMEM/F12，持续2天；最后，将维持培养基替换为10％胎牛血清的DMEM/F12，持续2天。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
细胞培养肉需要在体外获得大量的具有分化能力的干细胞，但是在含10％胎牛血清的DMEM/F12中传代培养的脂肪间充质干细胞增殖速度较慢，而且随着在体外扩大培养，细胞干性衰退，因此很难获得大量的均有分化能力的种子细胞，因此需要开发一种维持猪脂肪间充质干细胞功能的培养基。另一方面，脂肪间充质干细胞向成熟脂肪细胞高效分化也是培养肉的关键技术之一，因此开发最有效的诱导分化培养基至关重要。
本申请设计的脂肪间充质干细胞改良培养基，通过添加bFGF，在体外扩大极大的加快了细胞增殖速度，并且维持脂肪间充质干细胞的分化潜能。获得的细胞按照本申请设计的分化培养基诱导脂肪间充质干细胞可高效的向成熟脂肪细胞分化。
本发明发现，添加有bFGF的细胞生长培养基可以在体外扩大培养中促进脂肪间充质干细胞增殖，P3-P5代添加bFGF的生长培养基中的获得的细胞总数是对照生长培养基中获得的细胞总数的6倍。并且获得的P5代细胞经过诱导分化之后，结果表明添加bFGF的生长培养基获得的细胞分化能力较对照生长培养基中获得的细胞分化能力显著提高。综上，添加bFGF的生长培养基能够更好保持猪脂肪间充质干细胞功能。
附图说明
图1为对照生长培养基、添加有bFGF的生长培养基P5代细胞相同接种数量下培养第三天细胞密度及细胞形态
图2为对照生长培养基、添加有bFGF的生长培养基的细胞每三天(每三天为一代)的增殖倍数
图3为对照生长培养基、添加有bFGF的生长培养基的细胞生长曲线
图4为生长培养基、添加有bFGF的生长培养基的细胞P5代细胞成脂分化后，油红O染色结果，其中图4a为生长培养基获得的P5代细胞成脂分化结果，图4b为添加有bFGF的生长培养基获得的细胞P5代细胞成脂分化结果。
图5为对照生长培养基、添加有bFGF的生长培养基获得的P5代细胞成脂分化后油红O染色定量结果图
具体实施方式
以下实施例中采用用于脂肪间充质干细胞体外扩大培养的增殖培养基，为添加有浓度为5ng/mL bFGF的脂肪间充质干细胞生长培养基，脂肪间充质干细胞生长培养基中，含10％(体积比)胎牛血清的DMEM/F12(Gibco,A4192001)，其他方面与正常干细胞体外培养方法一致。
以下实施例中，对照生长培养基为常规脂肪间充质干细胞生长培养基，含10％(体积百分比)胎牛血清和90％(体积百分比)的DMEM/F12培养基。
下述实施例中，在细胞增殖过程中持续使用本发明所述的用于脂肪间充质干细胞体外扩大培养的增殖培养基(即含有bFGF)的增殖培养基，具体的，为每两天更换本发明所述的用于脂肪间充质干细胞体外扩大培养的增殖培养基。
下述实施例中采用的细胞为仔猪脂肪间充质干细胞，进一步的为贴壁细胞。
下述实施例中诱导分化培养基为：地塞米松为1μM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤为0.5mM、胰岛素为10μg/mL的含10％胎牛血清的DMEM/F12，培养的时间为5天。
下述实施例中采用的培养条件皆为CO2培养箱中37℃培养，CO2的浓度皆为5％(v/v)。
下述实施例中采用的检测方法，除非另外说明，否则都是领域内公开的实验方法、检测方法和制备方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1猪脂肪间充质干细胞分离及体外扩大培养：
(1)单细胞分离：取新鲜屠宰仔猪在75％(体积百分比)乙醇中浸泡一分钟，于无菌条件下取颈部皮下脂肪组织于基础培养液中保存。在无菌条件下，用含高浓度青霉素和链霉素的PBS缓冲液冲洗3次，剪去脂肪组织中可见的血管和结缔组织，将脂肪组织剪成1mm3左右的小块，加入含0.1％(质量百分比)的Ⅰ型胶原酶和含有3％(体积百分比)的青霉素-链霉素双抗消化液消化90min(37℃，水浴锅中振荡)，消化结束后用等体积的完全培养液中和消化液，100μm和40μm的细胞筛过滤，1500rpm离心10min，以去除悬浮的脂肪细胞及脂滴；沉淀部分即为SVF(stroma vascular fraction)，弃上清液，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置10min，1000rpm离心5min，弃上清液，加入无血清培养液，吹打均匀，1000rpm离心5min，弃上清液，加入完全培养基，吹打均匀，血细胞计数板进行计数，按5×104/mL的密度将细胞接种于未使用过的6孔培养板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；根据ADSCs比前体脂肪细胞，内皮细胞等贴壁速度快的特性，12小时后除去未贴壁的细胞，贴壁的细胞即为猪脂肪间充质干细胞。剩余细胞800g离心5min取细胞沉淀，即得到待接种的猪脂肪间充质干细胞，并按1×106/ml冻存细胞。
(2)脂肪间充质干细胞体外传代培养：以常规含10％(体积百分比)胎牛血清的DMEM/F12脂肪间充质干细胞生长培养基为对照生长培养基，用对照生长培养基、添加了bFGF的含10％(体积比)胎牛血清的DMEM/F12生长培养基培养上述待接种的猪脂肪间充质干细胞，并两天进行更换本发明所述的含有bFGF的增殖培养基，三天用0.25％(质量百分比)的胰酶消化，血细胞计数板进行计数后，继续按照1.5×105接种10cm培养皿传代。观察并拍照细胞生长至第三天时的细胞形态(图1)；以传代次数为横坐标，以增殖倍数为纵坐标，绘制每代细胞扩增倍数图(图2)；以时间(d)为横坐标，细胞数目(×104cells)为纵坐标，绘制生长曲线(图2)。
(3)结果显示：所述的添加有bFGF的细胞培养基培养的脂肪间充质干细胞细胞形态呈小梭形、三角形、细胞边缘清晰，而作为对照的常规生长培养基培养的脂肪间充质干细胞细胞形态呈现出大梭形、多角形、细胞边缘不清晰。此外，添加有bFGF的细胞培养基培养15天，即体外培养至P5代获得的猪脂肪间充质干细胞总数是对照生长培养基培养培养15天(P5代)获得的细胞总数的6倍，因此bFGF改良的用于脂肪间充质干细胞体外扩大培养的增殖培养基可促进脂肪间充质干细胞在体外增殖。
实施例2脂肪间充质干细胞成脂分化能力检测
(1)肌肉干细胞诱导分化：取实施例1培养得到的所述的对照生长培养基、添加bFGF的生长培养基获得的P5代猪脂肪间充质干细胞持续培养直到细胞完全汇合，更换由地塞米松为1μM、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤为0.5mM、胰岛素为10μg/mL组成的含10％胎牛血清的DMEM/F12分化培养基，每两天换液一次，持续5天；分化第6天，更换为含10μg/mL胰岛素的含10％胎牛血清的DMEM/F12维持培养基，持续2天；分化第8天，更换为含10％(体积百分比)胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，持续2天。
(2)油红O检测脂滴积累：取诱导成脂分化第10天的细胞，用PBS清洗三遍，用4％(体积百分比)的多聚甲醛固定20min或者4℃过夜，用PBS清洗三遍,每次5min，油红O染色10min，60％(体积百分比)异丙醇分色20s，甘油明胶封片，显微镜观察并拍照(图4)。并使用Image J统计脂滴面积，计算所述改良培养基获得的细胞成脂分化能力约是对照培养基获得的脂肪间充质干细胞分化率5倍(图5)
(3)结果显示：采用相同传代次数的脂肪间充质干细胞，即P5代对照生长培养基培养的脂肪间充质干细胞和所述的添加有bFGF的生长培养基培养的脂肪间充质干细胞，诱导成脂分化后，添加有bFGF的生长培养基获得的脂肪间充质干细胞，有大量的脂滴积累，充脂细胞更多，油红O染色阳性率更高，而对照生长培养基中的细胞充脂细胞较添加bFGF培养基的细胞少。综上，表明本申请设计的用于脂肪间充质干细胞体外扩大培养的增殖培养基可维持体外扩大培养的脂肪间充质干细胞的分化能力。
Claims (8)
1.一种用于脂肪间充质干细胞体外扩大培养的增殖培养基，其特征在于，所述增殖培养基为向脂肪间充质干细胞生长培养基中添加生长因子后制备得到，所述脂肪间充质干细胞生长培养基包括基础细胞培养基和胎牛血清。
2.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，所述生长因子为bFGF。
3.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，基础细胞培养基为DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种。
4.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞生长培养基中，基础细胞培养基和胎牛血清的体积比为9:1。
5.根据权利要求2所述的增殖培养基，其特征在于，所述bFGF在脂肪间充质干细胞生长培养基中的浓度为1-10ng/mL。
6.根据权利要求2所述的增殖培养基，其特征在于，所述bFGF在脂肪间充质干细胞生长培养基中的浓度为5ng/mL。
7.bFGF在促进脂肪间充质干细胞体外培养过程中的增殖速度和/或维持脂肪间充质干细胞体外培养过程中的分化潜能中的应用，其特征在于，将bFGF添加到脂肪间充质干细胞生长培养基中，获得权利要求1所述的增殖培养基，利用所述增殖培养基对脂肪间充质干细胞进行体外扩大培养。
8.权利要求1所述的增殖培养基在促进脂肪间充质干细胞体外培养过程中的增殖速度和/或维持脂肪间充质干细胞体外培养过程中的分化潜能中的应用。
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