CN104120106B - 利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法。本发明通过胶原酶消化法分离猪皮下脂肪组织的成熟脂肪细胞，去分化形成去分化脂肪细胞(DFAT细胞)。DFAT细胞与间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有相似的功能特性，能够在体外高效增殖和诱导多向分化。另外，本发明成功将猪DFAT细胞在体外利用半乳糖凝集素‑1(Galectin‑1)蛋白的诱导，分化形成能够表达骨骼肌细胞特异性标志分子的多核细胞。

Description

利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法

技术领域

本发明属于动物细胞离体培养技术领域，具体涉及一种利用猪去分化脂肪细胞(DFAT)诱导分化形成骨骼肌细胞的方法。

背景技术

猪肌肉组织是养猪生产过程中重要的生产性状。而形成肌肉组织的骨骼肌细胞是由中胚层的干细胞，经过定型和分化后形成的多核细胞。遗憾的是，在研究干细胞定型和分化为骨骼肌细胞的过程中，目前还未建立猪源的成肌细胞系或干细胞系。来源于成体组织的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,简称MSCs，下同)和卫星细胞，是常用的原代干细胞成肌分化的模型(Dezawa et al 2006)。

然而，来源于肌肉组织的卫星细胞由于体外分离数量小，在经历长期传代培养之后细胞的增殖活性和分化能力均会降低，为研究带来诸多不便；而间充质干细胞(MSCs)在体外具有多向分化潜能，在合适的培养条件下能够分化成为脂肪细胞，骨细胞，软骨细胞和骨骼肌细胞等(Hass et al 2011)。MSCs虽然能够通过体外诱导成肌分化，但是成肌分化相对于成脂或成骨分化要困难很多(Gang et al 2008)，导致MSCs成肌分化的效率低迄今为止还没有建立标准化的MSCs成肌分化诱导体系(Beier et al 2012)。此外，从动物体内分离的MSCs细胞数量小，细胞纯度不高(Matsumoto et al 2008)。这些问题，大大增加了猪骨骼肌生长发育和蛋白质合成机制研究的困难。

成熟脂肪细胞占脂肪组织体积的90％以上，通常被认为处于分化末期、细胞停滞于不再增殖的状态(Weisberg et al 2003)。但是近年来研究表明，成熟脂肪细胞在无诱导培养物的条件下进行体外培养时，能够去分化形成成纤维细胞样、具有多向分化潜能的干细胞，这些细胞被称为去分化脂肪细胞(dedifferentiated fat,简称DFAT，下同)(Matsumoto et al 2008)。用于去分化的成熟脂肪细胞分布广泛，且细胞量大，取材容易；而且去分化形成的DFAT细胞纯度高，体外增殖活性强，在体外具有成脂、成骨、成软骨和成肌多向分化潜能(Poloni etal 2012)。此外，Kazama等(Kazama et al 2008)用5-氮胞苷(5-azacytidine,5-Aza)处理小鼠DFAT细胞，能够诱导DFAT细胞成肌分化，确定了DFAT细胞成肌分化的可能。因此DFAT细胞有望成为良好的干细胞模型用于骨骼肌发育的研究。但是，目前关于猪DFAT细胞的成肌分化诱导尚无任何文献报道。

与本发明一般相关的专利文献，如申请号为201110404788.9(一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法)的专利申请，报道了从兔脂肪组织中分离成熟脂肪细胞，利用传统的“天花板”培养法得到兔DFAT细胞，并且再诱导分化形成心肌样细胞。该专利文献所涉及的只是DFAT细胞向心肌样诱导分化的途径和方法。

与本发明相关的专利申请文献是申请号为201110002340.4(发明名称：一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法)报道的方法，该文献报道了通过胶原酶消化法从猪脂肪组织中分离出成熟脂肪细胞，通过“天花板”培养法获得猪DFAT细胞，该文献公开了以DFAT细胞作为前体脂肪细胞的方法和路径，只是公开了获得猪DFAT细胞的分离方法，并没有对所得的猪DFAT细胞进行生物学特性和功能研究和验证，也没有提供相关的实验数据来支持所分离的DFAT细胞就是前体脂肪细胞的证据，在该专利公开说明书的实施例中也没有披露对分离的DFAT细胞进行相关的生物学鉴定的信息，特别是并没有对猪DFAT细胞向成肌方向分化做出任何实验支持及结果的描述。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用猪去分化脂肪细胞(DFAT细胞)向骨骼肌细胞分化的方法，本发明通过“天花板”培养法获得具有干细胞特性的猪DFAT细胞，进一步通过对猪DFAT细胞进行成肌方向诱导，使得猪DFAT细胞向骨骼肌细胞方向分化，诱导得到猪DFAT细胞形成骨骼肌细胞。

实现本发明的技术方案如下所述：

一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其步骤包括猪DFAT细胞的获取；其特征在于，它还包括以猪DFAT细胞作为干细胞模型，在体外培养条件下经成肌诱导培养基诱导之后向猪骨骼肌细胞方向分化，具体步骤如下所示：

(1)猪脂肪组织的分离：在离体和无菌条件下取1-7日龄仔猪皮下脂肪组织，用含有1％的双抗(抗青霉素-链霉素)、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗干净；

(2)猪成熟脂肪细胞的分离纯化：利用胶原酶分离法对步骤(1)所得的猪脂肪组织在37℃下用0.1％(w/v)I型胶原酶消化液消化(购自美国Sigma公司)45min-1h 30min，离心纯化后收集成熟脂肪细胞，使用差速贴壁法(方法参考Fernyhough et al 2004)对成熟脂肪细胞进行进一步的纯化；

(3)猪成熟脂肪细胞的“天花板”培养：将步骤(2)所得的猪成熟脂肪细胞接种至12.5cm²的细胞培养瓶中，加满细胞分离培养基后，于37℃、5％CO₂的条件下倒置培养瓶培养7-14d，直至出现成纤维状的DFAT细胞；

(4)猪DFAT细胞的传代培养：将步骤(3)中原代DFAT细胞用0.25％的胰酶(购自美国Invitrogen公司)消化1-2min，以1:2-1:4的传代比率进行传代培养，传代培养所用的培养基为细胞生长培养基，当细胞生长至汇合度为70％-80％时进行传代，2-3d传代一次；

(5)预先将细胞爬片置于12孔细胞板在37℃下用明胶包被1-2h，然后将步骤(4)所得的第3代DFAT细胞以5×10⁴个/cm²接种于上述含细胞爬片的12孔细胞板中，当细胞生长汇合度为70％-80％时，将所述的DFAT细胞转移至含100-400ng/ml的半乳糖凝素-1(Galectin-1)蛋白的低糖DMEM培养基，即成肌诱导培养基上培养18-24d，每隔3-4d更换一次新鲜的成肌诱导培养基；

(6)对成肌诱导后的DFAT细胞进行免疫荧光染色鉴定：将步骤(5)中诱导后的DFAT细胞进行成肌早期蛋白Desmin和成肌晚期蛋白MyHc的免疫荧光染色鉴定，验证、鉴定被诱导的DFAT细胞是否向骨骼肌细胞进行分化；

磷酸盐缓冲液、I型胶原酶消化液、培养基及组分如下：

0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8.0043g NaCl、0.1998g KCl、0.2717g KH₂PO₄、3.5786gNa₂HPO₄·12H₂O溶于去离子水中，调节PH至7.4，定容到1L，121℃高温灭菌30min；

0.1％(w/v)I型胶原酶消化液：100mg I型胶原酶粉末和1g牛血清白蛋白(BSA)粉末溶于100ml低糖DMEM培养基中，混匀后用0.22μm滤器过滤除菌，分装至10ml离心管中-20℃保存备用；

细胞分离培养基：体积浓度为20％的胎牛血清(简称FBS，购自美国Gibco公司)的低糖DMEM培养基(购自美国Gibco公司)；

细胞生长培养基：体积浓度为15％的FBS、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(简称bFGF，购自美国Peprotech公司)、1％非必需氨基酸(购自美国Sigma公司)、1％的双抗(抗青霉素-链霉素)(购自杭州吉诺生物医药技术有限公司)的低糖DMEM培养基；

成肌诱导培养基：含100-400ng/ml的半乳糖凝素-1(Galectin-1，购自美国Prospec公司)蛋白的低糖DMEM培养基。

作为优选方案，步骤(2)中的脂肪组织的最佳消化时间为1h。

作为优选方案，步骤(3)中成熟脂肪细胞的倒置培养时间为10d。

作为优选方案，步骤(4)中DFAT细胞的传代培养的比例为1:3。

作为优选方案，步骤(5)中DFAT细胞在成肌诱导培养基上的培养时间为21d。

作为优选方案，优选的成肌诱导培养基中的Galectin-1的浓度为200ng/ml。

本发明的优点是：

1、本发明中所用的材料，猪成熟脂肪细胞来源丰富，取样方便，所获得的细胞数量大。

2、本发明通过差速贴壁法对成熟脂肪细胞进行纯化，去分化得到了高纯度的DFAT细胞，能够有效的避免其他杂细胞的污染。

3、本发明通过对猪DFAT细胞培养体系的优化和细胞生物学特性的鉴定，使猪DFAT细胞在体外能长期传代培养能够保持高效的增殖活性、分化能力和遗传学特性，为猪DFAT细胞的应用提供了广阔的前景。

4、本发明是国内外首次使用Galectin-1蛋白诱导猪DFAT细胞表达骨骼肌细胞相关的标志分子，形成多核的骨骼肌细胞。本发明设计的成肌分化的诱导培养基和诱导程序简单方便，不需要复杂的多步诱导程序，能有效诱导猪DFAT细胞向骨骼肌细胞的分化。

与申请号为201110002340.4(一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法)相比，本发明具有如表1所示的特点(参见表1)。

表1本发明与对比文献的技术特征和发明效果的主要区别

更详细的技术方案与效果见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：是本发明是利用“天花板”培养法在培养箱中培养猪脂肪细胞和贴壁后的成熟脂肪细胞示意图。其中图1中A是利用改良的“天花板”培养法在培养箱中培养猪脂肪细胞的示意图；图1中B是“天花板”培养后贴壁的猪成熟脂肪细胞的示意图。

图2：是猪成熟脂肪细胞去分化形成猪DFAT细胞过程中细胞形态变化。其中图2中A是培养第1天，图2中B是培养第3天，图2中C是培养第6天，图2中D是培养第8天，图2中E是培养第10天，图2中F是培养第14天的形态(放大倍数均为200倍，标尺为50μm)。

图3：是经过传代后的第一代猪DFAT细胞的细胞形态。放大倍数为40倍，标尺为200μm。

图4：猪成熟细胞与DFAT细胞成脂相关基因的表达量的差异。图4中A-D分别是PPARγ、aP2、LPL和Adiponectin基因的相对表达量。

图5：是传代过程中不同代次猪DFAT细胞的形态。图5中A是P10代猪DFAT细胞形态；图5中B是P20代猪DFAT细胞形态；图5中C是P30代猪DFAT细胞形态；图5中D是P40代猪DFAT细胞形态；图5中E是P50代猪DFAT细胞形态；图5中F是P60代猪DFAT细胞的形态(放大倍数均为40倍，标尺为200μm)。

图6：是P5、P29和P59代猪DFAT细胞的细胞活力检测结果。

图7：是P5、P28和P58代猪DFAT细胞的生长曲线图。

图8：是猪DFAT细胞的累积群体倍增数检测结果。

图9：是P10、P30和P60代猪DFAT细胞的群体倍增时间检测结果。

图10：是供试细胞的表面抗原的表达检测结果。由图10，从上至下和从左至右依次是P4代猪DFAT细胞CD44、CD29、CD90、CD31和CD34的表面抗原的表达检测结果。

图11：是P3、P20和P50代猪DFAT细胞成脂诱导情况。图11中的A-C分别是P3、P20和P50代猪DFAT细胞成脂诱导12d的结果(采用常规的油红O染色方法)(放大倍数均为200倍，标尺为50μm)。图11中的D是P3代猪DFAT细胞成脂诱导12d时PPARγ基因的相对表达量，图11中的E是P20和P50代猪DFAT细胞成脂诱导12d时PPARγ基因的相对表达量。

图12：是P3、P20和P50代猪DFAT细胞成骨诱导情况。图12中的A-C分别是P3、P20和P50代猪DFAT细胞成骨诱导21d的结果(采用常规茜素红染色方法；放大倍数均为40倍，标尺为200μm)。图12中的D是P3代猪DFAT细胞细胞成骨诱导21d Runx2基因的相对表达量，图12中的E是P20和P50代猪DFAT细胞细胞成骨诱导21d时Runx2基因的相对表达量。

图13：是不同代次猪DFAT细胞的染色体核型检测结果。图13中的A是P8代猪DFAT细胞的染色体核型；图13中的B是P30代猪DFAT细胞的染色体核型；图13中的C是P60代猪DFAT细胞的染色体核型。

图14：是添加不同浓度的Galectin-1蛋白的成肌诱导培养基对猪DFAT细胞成肌分化的影响。图14中的A、B、C和D分别是对照组及100、200、400ng/ml的Galectin-1蛋白的成肌诱导培养基处理猪DFAT细胞21天后，Desmin蛋白的免疫荧光染色图；图14中的E、F、G和H分别是对照组及100、200、400ng/ml的Galectin-1蛋白的成肌诱导培养基培养猪DFAT细胞21天后，MyHc蛋白的免疫荧光染色图。

图15：是本发明优选实施例即200ng/ml Galectin-1蛋白的成肌诱导培养基诱导猪DFAT细胞的融合指数检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式仅仅是说明本发明的具体实施方式，所列技术特征和发明效果的举例仅仅用于说明本发明，并不是对本发明的限制。

实施例1

1、猪成熟脂肪细胞的分离纯化与“天花板”法培养

(1)猪成熟脂肪细胞的分离纯化：取5日龄“长白猪”公猪(或简称“长白公猪”，由华中农业大学实验种猪场提供，为常规品种)，用75％酒精对猪全身整体消毒两次之后，于颈动脉放血处死，尽量放净血液。随后，用含75％酒精的酒精棉擦拭仔猪全身消毒。将仔猪移入超净工作台，在无菌条件下用灭菌的剪刀镊子，采取仔猪背部皮下脂肪置于含1％双抗(抗青霉素-链霉素，购自杭州吉诺生物医药技术有限公司)磷酸盐缓冲液(PBS)的平皿中，用PBS反复冲洗4-5次，以保证脂肪组织无菌。将脂肪组织转入到无菌青霉素的小瓶内，用灭菌剪刀尽可能将脂肪组织剪碎。

用无菌吸管将剪碎的组织移入到提前预热的0.1％(w/v)I型胶原酶消化液(购自美国sigma公司)中。放入37℃培养箱消化1h，每隔10min震荡混匀一次，当脂肪组织被消化成絮状时即可。加入与胶原酶消化液相同体积的细胞分离培养基(配方见附录)终止消化，用吸管充分吹打混匀，使细胞分离出来，悬液过200目细胞筛，收集滤液于10ml离心管，1500r/min离心10min。

离心后取1ml上层含有脂肪细胞的悬液至10ml离心管中，加入5ml细胞分离培养基充分吹打洗涤。然后过200目细胞筛，收集滤液于10ml离心管，1500r/min离心10min，重复此步骤2遍。

(2)利用“天花板”培养法培养成熟脂肪细胞：经过离心纯化后的上层细胞即为猪成熟脂肪细胞，吸取该猪成熟脂肪细胞悬液1ml接种至12.5cm²细胞瓶中，加满37℃预热的细胞分离培养基(配方见附录)，盖紧瓶盖，颠倒放置在细胞培养箱中，37℃、5％CO₂的条件下培养，并保持细胞瓶水平(如图1A)。

在对猪成熟脂肪细胞进行“天花板”方法培养时，还利用差速贴壁法(Fernyhough et al2004)对脂肪细胞进行纯化。在成熟脂肪细胞接种培养瓶后，每隔8-12h将含有成熟脂肪细胞的细胞分离培养基转移入新的细胞瓶中再重新进行“天花板”培养，直至培养基中无杂细胞污染(如图1B)。

2、猪成熟脂肪细胞去分化过程中形态变化与基因表达量的变化

(1)用导致荧光显微镜监测猪成熟脂肪细胞“天花板”培养过程中的形态变化。在“天花板”培养后第2d，脂肪细胞紧贴于细胞瓶上壁。接着，在第3d细胞开始拉长，细胞形态开始由圆形变为椭圆；随后，在6-10d细胞内的单个大脂滴开始分散成小脂滴，直到脂滴越来越小，直至被排出细胞外。经过10d的“天花板”培养之后将细胞瓶正置，更换细胞生长培养基。经过2周的培养后形成成纤维状的DFAT细胞(细胞形态的变化如图2中的A-F)。猪DFAT细胞经过传代后形成均一的成纤维状细胞(如图3)。

(2)定量PCR检测猪成熟脂肪细胞与猪DFAT细胞的成脂基因PPARγ(GeneBank登录号：XM_005669790.1)、aP2(GeneBank登录号：NM_001002817.1)、LPL(GeneBank登录号：NM_214286.1)和Adiponectin(GeneBank登录号：EF601160.1)表达差异(其中以β-actin为内参基因，GeneBank登录号为DQ845171.1)。

DFAT与成熟脂肪细胞总RNA提取、纯化和反转录：

总RNA提取：用Invitrogen公司的Trizol试剂提取DFAT与成熟脂肪细胞总RNA。所有提取总RNA的枪头和离心管必须经过RNA酶抑制剂处理。将500μl Trizol细胞裂解液(Trizol试剂自带)转入1.5ml离心管中，加入100μl氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min后，4℃下12000r/min离心15min；小心吸取上清200μl至新离心管中，加入预冷的250μl异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃下12000r/min离心10min，离心管底部出现白色沉淀；小心吸弃上清，加入500μl 75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃下12000r/min离心5min；小心吸弃上清后将离心管盖打开，在超净台中风干5-10min以挥发多余的乙醇；加入20-30μl的DEPC H₂O溶解RNA。

纯化：使用TURBO DNA-free ^TM Kit加入0.1倍RNA体积的10×TURBO DNase Buffer和1μl TURBO DNase，混匀后在37℃恒温培养箱中孵育30-60min，其间每隔10min轻弹混匀一次；加入0.1倍RNA体积的DNase Inactivation Reagent(使用时涡旋混匀)，轻弹混匀，室温孵育5min后12000r/min离心3min，将含有RNA的上清转入新的离心管中。使用Nanodrop2000测定RNA的浓度，并通过OD260/280及OD260/230判断RNA的纯度，OD260/280在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较好。

反转录：反转录RNA总量为2.5μg，反转录体系(25μl)和反转录程序：

定量PCR检测基因表达：

定量PCR按照iTaq^TM Universal SYBR Green Supermix(购自美国Bio-Rad公司)说明书，20μl反应体系为：10μl Mix、9μl cDNA(cDNA原液50倍稀释液)、0.5μl(10mM)上游引物、0.5μl(10mM)下游引物。定量PCR仪的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，PCR仪采集荧光信号，共40个循环；熔解曲线从58℃上升到95℃，每0.5℃读板5s。试验3次重复，相对定量的结果使用2^-ΔΔCt法来计算结果。应用Primer Premier5.0软件跨越基因的内含子设计定量引物，定量引物的序列如表2所示(PCR体系中的上下游引物分别对应每个基因的上下游引物，下同)，结果显示猪成熟脂肪细胞与猪DFAT细胞的成脂基因PPARγ、aP2、LPL和Adiponectin表达极显著(P＜0.01)(如图4)。表明了在本发明的方法诱导培养下猪成熟脂肪细胞通过去分化，能形成猪DFAT细胞，并且形成的猪DFAT细胞失去了脂肪细胞的功能特性。

3、猪DFAT细胞的长期传代培养

将猪DFAT细胞置于细胞生长培养基中进行长期传代培养，每次当传代培养的细胞生长至70％左右用0.25％胰酶消化1-2min，至DFAT细胞变圆时终止消化，制成DFAT细胞悬液，以1：3的传代比率进行传代培养，在倒置荧光显微镜下观察猪DFAT细胞形态并拍照(结果如图5所示)，猪DFAT细胞在传代过程中保持着正常的成纤维状，在传代至60代(P60)时，DFAT细胞内无黑色颗粒物质或空泡，表明本发明培养的猪DFAT细胞生长状态良好。

4、DFAT细胞细胞活力的检测

分别取传代早期(简称P3-P10代)、中期(简称P20-P30代)和晚期(简称P50-P60代)的猪DFAT细胞用0.25％胰酶消化，取10μl细胞悬液与10μl 0.4％台盼蓝染液(购自美国Sigma公司)混匀，然后分别加入到细胞计数载玻片的A、B区室，将载玻片插入Countess细胞计数器(购自美国Invitrogen公司)中。细胞计数器会自动测定猪DFAT细胞的活细胞数、死细胞数，并计算DFAT细胞的活力。不同代数的猪DFAT细胞分别进行4-5次重复(如图6所示)，实测第P5、P29和P59代的猪DFAT细胞的活力分别为98.00％±0.82％、98.60％±1.14％和99.25％±0.96％，各代次之间的猪DFAT细胞活力差异不显著(P>0.05)。表明猪DFAT细胞在长期培养的过程中仍保持非常高的细胞活力。

5、猪DFAT细胞的生长动力学特性试验

(1)猪DFAT细胞的生长曲线

分别取传代早期(P3-P10代)、中期(P20-P30代)和晚期(P50-P60代)的猪DFAT细胞配成1×10⁴/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板的孔中，每种接种6个复孔，每孔200μl，共接种8组。分别在接种第1、2、3、4、5、6、7、8d取出一组培养板，每孔加入5mg/ml MTT溶液(购自美国Amresco公司)20μl，孵育4h后弃孔内溶液，加入150μl二甲亚砜溶液，避光震荡10min，在酶联免疫检测仪上测各孔492nm的OD值，并绘制成DFAT细胞的生长曲线，每种细胞进行6个复孔的重复。如图7所示为猪DFAT细胞生长曲线，测定的各代DFAT细胞生长都符合S形曲线，即显示猪DFAT细胞在接种后1-2d内处于生长延滞期，在2d后DFAT细胞进入生长对数期，经过4-5d的指数生长期的猪DFAT细胞进入平台期。表明本发明培养的猪DFAT细胞在传代培养过程中，DFAT细胞均能够保持良好的生长特性。

(2)猪DFAT细胞的群体倍增数试验

将分离的P1代猪DFAT细胞以1×10⁴/cm²接种于6孔板的孔中，当猪DFAT细胞生长至70-90％汇合时用0.25％胰酶消化，用Countess细胞计数器细胞测定猪DFAT细胞数量。并以1×10⁴/cm²接种于新的6孔板的孔中继续培养，计算每代猪DFAT细胞的群体倍增数(populationdoubling，PD)，其计算公式为：PD＝log₂(每代收获的细胞数/接种的细胞数)。累积的群体倍增数(cumulative population doubling，CPD)是指细胞连续传代的过程中每代细胞PD的总和。试验进行3次重复(结果如图8所示)，当猪DFAT细胞经过58d的连续培养(猪DFAT细胞经过16次传代培养)，可见猪DFAT细胞的群体倍增数呈线性增加，DFAT细胞的累积群体倍增数达到47.40±1.64。

(3)猪DFAT细胞的群体倍增时间试验

分别取传代早期(P3-P10代)、中期(P20-P30代)和晚期(P50-P60代)的猪DFAT细胞。以1×10⁴/cm²接种于6孔板的孔中，当猪DFAT细胞生长至70-90％汇合度时胰酶消化，用Countess细胞计数器细胞测定细胞数目，猪DFAT细胞的群体倍增时间(population doublingtime，PDT)的计算公式为：PDT＝t/PD。PD为该代猪DFAT细胞的群体倍增数，t为每代猪DFAT细胞从接种到传代所用的时间。不同代数的猪DFAT细胞分别进行3次重复(结果如图9)所示，P10、P30和P60代猪DFAT细胞的群体倍增时间分别为21.68±1.12h、20.72±1.69h和21.46±0.63h，三个不同代次的细胞群体倍增时间没有显著差异(P＞0.05)，表明猪DFAT细胞在体外长期传代培养过程中能保持稳定的生长特性和良好的增殖能力。

6、猪DFAT细胞表面抗原的鉴定

取P4代生长状态良好的猪DFAT细胞，用0.25％胰酶消化细胞后在用细胞生长培养基终止消化，转移至10ml离心管中，1000r/min离心7min去除胰酶。用PBS洗涤2次后，用PBS重悬细胞进行细胞计数，用PBS配制成1×10⁶/ml的单细胞悬液，分别分装至7个离心管中，每管装200μl细胞悬液，分别加入荧光标记的单抗CD29(552369，购自美国BD公司)、内皮细胞表面抗原CD31(MCA1746PET，购自美国AbD serotec公司)、造血干细胞表面抗原CD34(GB12013，购自武汉谷歌生物科技有限公司)、CD44(ab19622，购自美国Abcam公司)、CD90(562245，购自美国BD公司)，并设置对照组，4℃避光孵育30min。每管加入200μl PBS洗去未标记抗体，用300μl PBS重悬后上机测样，进行流式分析，结果见图10所示：发现猪DFAT细胞CD44、CD29和CD90的试验组表达均呈阳性，其表达量分别为91.51％、71.61％和86.84％，而内皮细胞表面抗原CD31和造血干细胞表面抗原CD34的表达均呈阴性，分别为1.26％和3.59％。表明DFAT细胞与MSCs具有相似的表面抗原模式，与Jumabay等(2010)和Poloni等(2012)的报道的结果相符。

7、猪DFAT细胞分化能力的检测

(1)成脂诱导：分别取传代早期(P3-P10代)、中期(P20-P30代)和晚期(P50-P60代)的猪DFAT细胞，以5×10⁴个/cm²接种于6孔板的孔中。当猪DFAT细胞生长至汇合度为80％-90％时加入成脂诱导培养基(10％FBS的高糖DMEM培养基中含有1μmol/L地塞米松、500μmol/L IBMX、10μg/ml的胰岛素和200μmol/L吲哚美辛)诱导6d，其间更换新鲜的成脂诱导培养基一次。之后再换成含10μg/ml胰岛素的10％FBS高糖DMEM培养基培养诱导3d，最后换成细胞生长培养基培养3d。对照组只加细胞生长培养基培养，12d后收集细胞样品并对细胞进行油红O染色，结果如图11的A-C所示，表明本发明的P3、P20和P50代猪DFAT细胞均能分化形成脂肪细胞，通过定量PCR检测(方法和步骤同前面的定量PCR程序，引物序列见表2)细胞成脂分化的标志基因PPARγ的表达量(图11中D-E所示)，发现PPARγ基因在诱导后的表达量显著上调(P＜0.05)。这些结果表明，本发明中猪DFAT细胞具有向脂肪细胞分化的能力。

(2)成骨诱导：分别将传代早期(P3-P10代)、中期(P20-P30代)和晚期(P50-P60代)的猪DFAT细胞以5×10⁴个/cm²接种于6孔板的孔中，当猪DFAT细胞生长至汇合度为40％-50％时加入成骨诱导培养基(10％FBS的高糖DMEM培养基，含有0.1μmol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸和50mol/L Vc)培养21d，每3d更换一次新鲜的成骨诱导培养基。对照组只加细胞生长培养基处理，21d后收集细胞样品并对细胞进行茜素红染色，发现P3、P20、P50代猪DFAT细胞在成骨诱导之后，出现了红色的钙结节(见图12中的A-C)。而且定量PCR检测成骨标志基因Runx2的表达量(方法和步骤与成脂基因的检测相同，引物的序列见表2)(参见图12中的D-E)，发现Runx2基因的表达量均显著上调(P＜0.05)。表明本发明中猪DFAT细胞在长期培养的过程中保持着成骨分化能力。

表2猪成脂和成骨标志基因的定量引物序列(引物均由上海生工生物工程有限公司合成)

8、猪DFAT细胞染色体核型分析

分别传代早期(P3-P10代)、中期(P20-P30代)和晚期(P50-P60代)的猪DFAT细胞，按照细胞染色体核型染色的方法对检测各代猪DFAT细胞进行染色(Freshney 2000)。对P8、P30和P60代猪DFAT细胞进行染色核型分析，发现各代次猪DFAT细胞细胞染色体均为38条(见图13中的A-C)，处于正常的核型，表明本发明制备的DFAT细胞在经过长期传代培养后仍具有稳定的遗传学特性。

9、猪DFAT细胞成肌分化诱导及其鉴定

(1)提前将细胞爬片置于12孔细胞板在37℃下用明胶包被1-2h，然后将生长状态良好的猪DFAT细胞以5×10⁴个/cm²接种于含细胞爬片的12孔细胞板中。

(2)DFAT细胞生长至汇合度70-80％，分别用含有100、200和400ng/ml Galectin-1蛋白的成肌诱导培养基(配方见附录1)诱导猪DFAT细胞成肌分化21d，每3-4天更换一次新鲜的成肌诱导培养基。对照组为含体积比为10％的FBS的低糖DMEM培养基。

(3)将诱导后的猪DFAT细胞用PBS洗3遍，加入4％多聚甲醛固定10min，用PBS漂洗3遍，每次3min。

(4)加入0.1％的Triton-100通透细胞膜10min，用PBS漂洗3遍，每次3min。然后加入5％的牛血清白蛋白(BSA)于室温下封闭30min，弃去封闭液。

(5)加入体积比为1:100稀释的一抗兔抗Desmin(sc-14026，美国Santa Cruz公司)和一抗鼠抗MyHc(ab11083，美国Abcam公司)，4℃孵育过夜。

(6)用PBS漂洗3遍，每遍5min，再加入TRITC标的羊抗兔二抗(稀释体积比为1:64)和FITC标的羊抗鼠二抗(稀释体积比为1:100)，室温孵育1h。

(7)用PBS漂洗3次，每次5min，加入DAPI(购自美国Sigma公司)染核10min。用PBS漂洗3次，每次3min，然后用50％的甘油封片，荧光显微镜下拍照。测定细胞融合指数，融合指数的计算方法是肌管中细胞核数目占总核数目的百分比(肌管是指一个细胞内至少含有2个核以上)。

如图14所示，对照组不表达成肌早期标志蛋白Desmin和后期标志蛋白MyHc，表明对照组未能诱导DFAT细胞成肌分化。而100、200和400ng/ml的Galectin-1诱导组细胞均有Desmin和MyHc的表达，其中200ng/ml Galectin-1诱导组表达量最高，细胞出现多核肌管。另外，200ng/ml Galectin-1蛋白诱导组细胞的融合指数为18.77％±8.19％(见图15)。

附录1本发明实施例中培养基的组成

注：DMEM基础培养基的成分参见Freshney RI，Culture of animal cells：a manual of basictechnique.2000。其中低糖DMEM所含的葡萄糖浓度为1g/L。

参考文献

1.Dezawa M,Ishikawa H,Itokazu Y,Yoshihara T,Hoshino M,Takeda S,Ide C,Nabeshima Y.Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration.Science,2006,309:314-317

2.Hass R,Kasper C,Bohm S,Jacobs R.Different populations and sources of humanmesenchymal stem cells(MSC):A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.CellCommun Signal,2011,9:12

3.Gang EJ,Bosnakovski D,Simsek T,To K,Perlingeiro RC.Pax3 activation promotes thedifferentiation of mesenchymal stem cells toward the myogenic lineage.Exp Cell Res,2008,314:1721-1733

4.Beier JP,Bitto FF,Lange C,Klumpp D,Arkudas A,Bleiziffer O,Boos AM,Horch RE,KneserU.Myogenic differentiation of mesenchymal stem cells co-cultured with primary myoblasts.Cell Biol Int,2011,35:397-406

5.Matsumoto T,Kano K,Kondo D,Fukuda N,Iribe Y,Tanaka N,Matsubara Y,Sakuma T,Satomi A,Otaki M,Ryu J,Mugishima H.Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cellsexhibit multilineage potential.J Cell Physiol,2008,215:210-222

6.Weisberg SP,McCann D,Desai M,Rosenbaum M,Leibel RL,Ferrante AW.Obesity isassociated with macrophage accumulation in adipose tissue.J Clin Invest,2003,112:1796-1808

7.Poloni A,Maurizi G,Leoni P,Serrani F,Mancini S,Frontini A,Zingaretti MC,Siquini W,Sarzani R,Cinti S.Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bonemarrow-derived mesenchymal stem cells.Stem Cells,2012,30:965-974

8.Kazama T,Fujie M,Endo T,Kano K.Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells cantransdifferentiate into skeletal myocytes in vitro.Biochem Biophys Res Commun,2008,377:780-785

9.Jumabay M,Zhang R,Yao Y,Goldhaber JI,Bostrom KI.Spontaneously beatingcardiomyocytes derived from white mature adipocytes.Cardiovasc Res,2010,85:17-27

10.Fernyhough ME,Vierck JL,Hausman GJ,Mir PS,Okine EK,Dodson MV.Primary adipocyteculture:adipocyte purification methods may lead to a new understanding of adipose tissuegrowth and development.Cytotechnology,2004,46:163-172

11.Freshney RI.Culture of animal cells:a manual of basic techniques.4^thed.New York:Wiley-Liss,2000。

Claims (1)

1.一种利用猪去分化脂肪细胞诱导分化形成骨骼肌细胞的方法，其步骤包括猪去分化脂肪细胞即DFAT的培养；其特征在于，它还包括以猪DFAT细胞作为干细胞模型，在体外培养条件下经成肌诱导培养基诱导之后向猪骨骼肌细胞方向分化，具体步骤如下所示：

(1)猪脂肪组织的分离：在离体和无菌条件下取1-7日龄仔猪皮下脂肪组织，用含有1％的青霉素-链霉素混合液、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液反复冲洗干净；

(2)猪成熟脂肪细胞的分离纯化：利用胶原酶分离法对步骤(1)所得的猪脂肪组织在37℃下，用I型胶原酶消化液消化1h，离心纯化后收集成熟脂肪细胞，使用差速贴壁法对成熟脂肪细胞进行进一步的纯化；

(3)猪成熟脂肪细胞的“天花板”培养：将步骤(2)所得的猪成熟脂肪细胞接种至12.5cm²的细胞培养瓶中，加满细胞分离培养基后，于37℃、5％CO₂的条件下倒置培养瓶培养10d，直至出现成纤维状的DFAT细胞；

(4)猪DFAT细胞的传代培养：将步骤(3)中原代DFAT细胞用0.25％的胰酶消化1-2min，然后以1:3的传代比率进行传代培养，传代培养所用的培养基为细胞生长培养基，当细胞生长至汇合度为70％-80％时进行传代，2-3d传代一次；

(5)预先将细胞爬片置于12孔细胞板在37℃下用明胶包被1-2h，然后将步骤(4)所得的第3代DFAT细胞以5×10⁴个/cm2接种于上述含细胞爬片的12孔细胞板中，当细胞生长汇合度为70％-80％时，将所述的DFAT细胞转移至含100-400ng/ml的半乳糖凝素-1蛋白的低糖DMEM培养基，即成肌诱导培养基上培养21d，每隔3-4d更换一次新鲜的成肌诱导培养基；

(6)对成肌诱导后的DFAT细胞进行免疫荧光染色鉴定：将步骤(5)中诱导后的DFAT细胞进行成肌早期蛋白Desmin和成肌晚期蛋白MyHc的免疫荧光染色鉴定，验证、鉴定被诱导的DFAT细胞是否向骨骼肌细胞进行分化；

磷酸盐缓冲液、I型胶原酶消化液、培养基及制备方法如下：

0.1mol/L磷酸盐缓冲液：称取8.0043g NaCl、0.1998g KCl、0.2717g KH₂PO₄、3.5786gNa₂HPO₄·12H₂O溶于去离子水中，调节PH至7.4，用双蒸水定容至1L，121℃高温灭菌30min；

I型胶原酶消化液：100mg I型胶原酶粉末和1g牛血清白蛋白(BSA)粉末溶于100ml低糖DMEM培养基中，混匀后用0.22μm滤器过滤除菌，分装至10ml离心管中-20℃保存备用；

细胞分离培养基：体积浓度为20％的胎牛血清的低糖DMEM培养基；

细胞生长培养基：体积浓度为15％的胎牛血清、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1％非必需氨基酸、1％的青霉素-链霉素混合液的低糖DMEM培养基。