CN111944749A - 一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，涉及生物技术领域。本发明提供的用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：培养人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体。本发明的优点在于，通过培养人脂肪间充质干细胞，制备得到人脂肪间充质干细胞外泌体，该人脂肪间充质干细胞外泌体含有多种RNA和细胞因子，有效修复梗死的心肌细胞，增强心脏功能，降低代偿性心肌负荷，缓解心衰，为心肌梗死提供一种治疗药物或者治疗策略。

Description

一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备 方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法。

背景技术

冠状动脉粥样硬化性心脏病，是由于脂质代谢不正常，血液中的脂质沉着在原本光滑的动脉内膜上，并逐渐堆积形成白色斑块，引起血管腔狭窄或阻塞，严重可导致冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死，造成心肌梗死。发生心肌梗死后，部分心肌细胞由于缺血缺氧难以修复，使得心脏功能降低，代偿性心肌负荷增加，久而久之会造成心衰等严重并发症。冠心病发病时，冠状动脉会闭塞20-30分钟，这样的心肌损伤通常为可逆性的，但是随时间推移，坏死的心肌量会逐渐增加。如果冠状动脉闭塞时间延长至2-6小时，受累心肌边缘会有波浪状纤维形成，超过6小时至梗死后3天，心肌会呈凝固性坏死、间质充血、水肿和中性粒细胞浸润。如果有足够量的心肌受累，可诱发心室舒张和收缩功能障碍，产生一系列的血流动力学变化。

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。由于心肌梗死的高致死率以及干细胞较强的分化能力，以干细胞为基础的细胞治疗成为心肌梗死的研究热点。虽然利用干细胞治疗心肌梗死理论上安全可行，但是细胞移植后在损伤区域分布的数量及滞留率是否足以治疗或保护心肌梗死细胞还有待研究。众所周知，细胞在移植后凋亡较快，凋亡过程中产生的活性物质是否致瘤也不明确。因此，深入研究干细胞对心肌梗死产生的治疗或保护作用以及寻找干细胞治疗心肌梗死的新的靶点和方法具有重要意义。

脂肪间充质干细胞是干细胞中优势较明显的一种，相对于其他干细胞，具有一些特殊的优点：如取材方便、来源广泛、更强的增殖、分化能力、成瘤率低以及不涉及社会和道德伦理等方面的争议。多项研究表明，脂肪间充质干细胞分泌物中含有大量的细胞因子和蛋白等，可用于多种疑难杂症的治疗，是一种来源极为广泛，取材简单且方便的新型生物医学材料。然而，目前脂肪间充质干细胞也存在普通干细胞常见的一些问题，比如虽然脂肪间充质干细胞含有较多的生物活性因子，但这些生物活性因子的含量低、性质不稳定、在病灶区域滞留率低，这些问题都极大程度的限制了脂肪间充质干细胞在临床上的广泛应用。

外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的膜囊泡，其中包含DNA片段、mRNA、功能蛋白及转录因子等多种具有生物活性的物质，外泌体的膜结构还可表达多种抗原、抗体分子，这些生物活性物质进入靶细胞，可参与调节靶细胞内的多种生理生化过程，进而产生各种生物学效应。外泌体的发现，为干细胞以及脂肪间充质干细胞心肌梗死方面的进一步应用提供了思路。虽然目前有研究表明，干细胞来源的外泌体在心肌梗死方面作用显著，其能够抑制心机细胞凋亡、促进新生血管生成、改善心肌梗死后心肌细胞的功能。但由于不同来源的干细胞的表达的外泌体中生物活性物质有很大差异，脂肪间充质干细胞来源的外泌体是否表达能治疗心肌梗死的活性物质还需要较多研究证明。

本发明通过构建SD大鼠，验证脂肪间充质干细胞来源的外泌体对心肌细胞的保护作用，并以此构建脂肪间充质干细胞系，为脂肪间充质干细胞来源的外泌体用于治疗心肌梗死提供技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，制备的人脂肪间充质干细胞外泌体可用于心肌梗死后心肌细胞的修复。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本申请实施例提供一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其主要包括如下步骤：培养人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到前述人脂肪间充质干细胞外泌体。

在本发明的一些实施例中，前述人脂肪间充质干细胞通过消化人体脂肪组织、接种和传代培养制得，消化前述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.06～0.16％的IV型胶原酶和质量百分数为0.015～0.02％的BSA。

在本发明的一些实施例中，前述人脂肪间充质干细胞为P2～P8代。

在本发明的一些实施例中，消化前述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.1％的IV型胶原酶和质量百分数为0.02％的BSA。

在本发明的一些实施例中，消化的时间为30～35min。

在本发明的一些实施例中，培养前述人体脂肪干细胞的培养液为体积百分数为10％的无外泌体的胎牛血清培养基。

在本发明的一些实施例中，前述人脂肪间充质干细胞消化后接种的密度为2～6×10⁴cells/cm²。

在本发明的一些实施例中，对前述上清液进行超速离心时，前述差速离心包括以1500g离心10min后再以10000g离心10min。

在本发明的一些实施例中，前述超速离心的条件为100000g离心2h，过滤前述目的微球所用的滤膜的孔径为0.22μm。

相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：

本发明提供的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，通过采用特定的方法分离培养人脂肪间充质干细胞，并以特定的方式收集人脂肪间充质干细胞外泌体，整个过程简单方便，得到的人脂肪间充质干细胞外泌体效果稳定。由于梗死的心肌细胞较难修复，以至于心脏功能降低，代偿性心肌负荷增加，最终造成心衰等严重并发症，但本发明提供的人脂肪间充质干细胞外泌体富含多种生物活性成分，可有效缓解心肌梗死后心肌细胞的损伤，增强心脏功能，降低代偿性心机负荷，缓解心衰。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例1中酶解液浓度筛选结果I；

图2是本发明实施例1中不同酶解液筛选结果II；

图3是本发明实施例1中原代细胞的鉴定结果；

图4是本发明实施例2中不同提取条件下的人脂肪间充质干细胞外泌体含量；

图5是本发明实施例2中人脂肪间充质干细胞外泌体的鉴定结果；

图6是本发明实施例3中传代细胞的鉴定结果；

图7为本发明实施例4的结果示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

本申请实施例提供一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，通过如下步骤制备而成：培养人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到所述人脂肪间充质干细胞外泌体。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例的目的在于，分离培养人脂肪间充质干细胞。

1.材料

准备人体脂肪为手术后废弃的正常人体脂肪(已签署知情同意书)、PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD29⁺、CD44⁺、CD90⁺、CD34^-和CD45^-的单克隆抗体。

2.方法

2.1人脂肪间充质干细胞的分离

(1)无菌条件下收集脂肪组织约15mL，去除脂肪组织表面的结缔组织包膜及血管；

(2)迅速剪碎至糊状，加入不含外泌体的培养基3mL，不含外泌体的培养基中包含终浓度为0.06～0.16％的IV型胶原酶和0.015～0.02％的BSA，37℃恒温120r/min振荡消化30～35min，随时观察组织消化状态，期间每隔5～8min取出混匀，终止消化后用100目和200目筛网依次过滤，去除未消化组织，收集滤液；不同的消化条件对分离出的原代细胞的的活性及后续的增殖率影响较大，因此，本实施例中探讨不同消化条件对细胞活性和细胞增殖率的影响。消化条件分组如下：

表1消化条件

(3)将步骤(2)中所获得的滤液以1500r/min离心15min，弃上清，得到沉淀；

(4)将沉淀用37℃PBS轻轻吹打清洗2～3遍，再向沉淀中加入含体积分数为10％的无外泌体的胎牛血清的培养基重悬，检测细胞活性后，以2～6×10⁴cells/cm²的密度接种，于37℃、5％CO₂、100％相对湿度的培养箱中培养，培养12～14h后，首次换液，换液动作要轻，防止刚贴壁的细胞被换下，之后每48h更换1次新鲜培养基并用电镜观察细胞形态。

2.2细胞增殖率分析

于固定时间向细胞中加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，于37℃培养箱孵育4h后吸除上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜。摇床震荡10min，酶联免疫检测细胞490nm波长检测各孔光密度(OD)值。计算均值，以时间为横坐标，(特定时间点光密度-第0天光密度)/第0天光密度*100％，即为不同时间点细胞的增殖率，以此为纵坐标绘制生长曲线。

2.3细胞表面标志蛋白检测

显微镜下观察细胞状态及细胞融合度，待细胞状态良好且融合度超过95％时，消化细胞，待细胞边缘开始脱离培养板后，加入培养基中止消化，离心后取沉淀，再用新鲜培养基重悬细胞调整细胞浓度，准备多个离心管，分别加入含1×10⁶个细胞的细胞悬液，再分别加入粘附分子受体表达标记物CD29⁺和CD44⁺、干细胞标记物CD90⁺以及造血细胞标记物CD34^-和CD45^-，孵育后上机检测。

3.结果

3.1不同消化条件得到的h-MSCs的细胞活性

消化结果如图1所示，由图1可知，0.1％IV型胶原酶组的细胞活性显著(P<0.05)高于0.12％IV型胶原酶，极显著高于其他组的细胞活性(P<0.05)，当加入0.015～0.02％的BSA进行消化时，0.015％BSA能一定程度提高得到的h-MSCs的细胞活性，但不具有统计学上的显著差异，0.02％BSA能显著提高0.1％IV型胶原酶消化的h-MSCs的细胞活性(P<0.05)。

3.2不同消化条件得到的h-MSCs的细胞增殖率

细胞增殖率结果如图2所述(除4、7和8组外，其他组未示出)，相对于0.1％IV型胶原酶组，虽然加入0.015～0.02％的BSA进行消化时，对h-MSCs的细胞活性无统计学意义上的提升，但添加0.02％的BSA能极显著提升相应时间点h-MSCs的早期增殖(第1～3d，尤其是1～2d)(P<0.01)，0.015％的BSA能显著提升h-MSCs的早期增殖(第1～3d，尤其是1～2d)(P<0.05)，并且添加一定量的BSA能一定程度延长h-MSCs的对数期。

由此可见，消化酶液中IV型胶原酶的浓度优选为0.1％IV型胶原酶，而BSA的浓度优选为0.02％。

3.3h-MSCs鉴定结果

电镜观察细胞形态发现，该细胞为成纤维样，呈涡旋状。取0.1％IV型胶原酶+0.02％的BSA组培养5d后的细胞，以流式测量h-MSCs表面标志蛋白CD29⁺、CD44⁺、CD90⁺、CD34^-和CD45^-，结果如图3所示，由此可见，该细胞高表达粘附分子受体表达标记物CD29⁺和CD44⁺、干细胞标记物CD90⁺，低表达造血细胞标记物CD34^-和CD45^-，该结果符合国际细胞治疗协会对MSCs的鉴定标准。因此，本实施例分离的细胞为h-MSCs。

实施例2

本实施例的目的在于，分离并提纯人脂肪间充质干细胞来源的人脂肪间充质干细胞外泌体，包括如下步骤：

1.材料方法

准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪，已签署知情同意书)、PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD40的单克隆抗体以及二甲基乙二酰基甘氨酸。

2.收集人脂肪间充质干细胞外泌体

(1)收集人脂肪间充质干细胞，接种，用无外泌体的血清培养基在37℃、5％CO₂条件下开始培养；

(2)培养12h后，换入含有300μmol/L二甲基乙二酰基甘氨酸的无人脂肪间充质干细胞外泌体的血清培养基，继续培养36h，收集细胞培养液；

(3)将步骤(2)中得到的细胞培养液于4℃进行差速离心，即在1500g条件下离心10min，再以10000g离心10min去除细胞碎片和大分子蛋白质后，得到上清液；

(4)将步骤(3)中的上清液进行超速离心，即在100000g超速离心2h，收集沉淀，即获得目的微球；

(5)向步骤(4)中的目的微球中加入生理盐水重悬，得到重悬液，再将重悬液用0.22μm过滤膜过滤，去除凋亡小体和微泡，再将过滤后的目的微球进行纯化，得到纯化后的人脂肪间充质干细胞外泌体(EVs)，将纯化后的人脂肪间充质干细胞外泌体灭菌后即得到人脂肪间充质干细胞外泌体；

(6)电子显微镜鉴定上述人脂肪间充质干细胞外泌体；并利用Elisa对得到的人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定。

3.结果

3.1本实施例分组信息

本实施例中，按照下述方式进行分组探索添加二甲基乙二酰基甘氨酸及差速离心对外泌体含量的影响，“+”表示按照加入二甲基乙二酰基甘氨酸或差速离心，“-”代表不添加二甲基乙二酰基甘氨酸或者按照常规方式离心。具体如表2所示：

表2分组信息

3.2外泌体表达量及电镜检查结果

由图4可知，相对于不添加二甲基乙二酰基甘氨酸，不采用差速离心的A组，添加二甲基乙二酰基甘氨酸并利用差速离心的D组能有效提升人脂肪间充质干细胞外泌体的含量(P<0.01)。使用电子显微镜对步骤(6)中得到的人脂肪间充质干细胞外泌体的形态进行鉴定，结果显示，人脂肪间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形，有完整薄膜结构，直径在40～120nm。

3.3Elisa检测结果

利用Elisa对得到的人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定，EVs标记物包括CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD40，检测结果表示(如图5所示)，该人脂肪间充质干细胞外泌体能表达外泌体标志物CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD40。由此可见，本实施例制备的外泌体为人脂肪间充质干细胞来源的外泌体。

需要注意的是，本实施例中涉及的人脂肪间充质干细胞培养步骤未说明的地方，则与实施例1相同。

实施例3

本实施例的目的在于培养h-MSCs细胞系。

1.材料

准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪，已签署知情同意书)、PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD29⁺、CD44⁺、CD90⁺、CD34^-和CD45^-的单克隆抗体。

2.h-MSCs传代

(1)按实施例1中所示方法收集脂肪组织，以0.1％IV型胶原酶+0.02％BSA组的消化条件消化后，按照实施例1中所述方法培养细胞至80％～90％融合时，用0.25％胰酶-0.02％EDTA消化，离心后得到细胞沉淀；

(2)将细胞沉淀用新鲜无外泌体的培养基重悬，按照1:2～4传代，培养至P10，每代细胞分别命名为P1-h-MSCs、P2-h-MSCs、P3-h-MSCs、P4-h-MSCs、P5-h-MSCs、P6-h-MSCs、P7-h-MSCs、P8-h-MSCs、P9-h-MSCs和P10-h-MSCs；

(3)收集P2-h-MSCs、P5-h-MSCs、P8-h-MSCs和P10-h-MSCs，分别消化后制成单细胞悬液，分别通过流式细胞仪检测细胞表面分子标记CD29⁺、CD44⁺、CD90⁺、CD34^-和CD45^-的表达。

3.结果

3.1不同传代比例对细胞增殖率的影响

不同传代条件的细胞传代时间和细胞增殖率如表3所示，由表3可知，按照1:3比例传代，细胞的增殖率显著大于同期按1:2传代比例得到的细胞的增殖率(P<0.05)，极显著高于同期按1:4传代比例得到的细胞的增殖率(P<0.01)，由此可见，按1:3传代能得到最佳传代时间间隔和细胞增殖率，利于后期试验的进行。

表3不同传代条件的细胞传代时间和细胞增殖率

3.2不同代细胞的细胞标志物表达情况

流式检测结果表明，如图6所示，本实施例培养的人脂肪间充质干细胞的细胞形态良好，P2～P8中CD29⁺、CD44⁺和CD90⁺高表达，CD34^-和CD45^-基本不表达，P10中CD29⁺、CD44⁺和CD90⁺表达开始下降，但CD34^-和CD45^-依然不表达。由此可见，本实施例提供的分离培养方法和传代方法，能得到稳定的人脂肪间充质干细胞，至少可顺利传到至P8。

本实施例通过选择适宜的消化体系消化脂肪组织，并通过贴壁筛选，形成了一种简单高效的分离培养人脂肪间充质干细胞的方法。结果显示，本实施例特定比例的胶原酶浓度和消化条件可以有效分离纤维结缔组织与脂肪组织，并提高原代细胞的浓度、纯度和活性，使原代细胞至少能稳定传代至P8。

实施例4

本实施例的目的在于，构建心肌梗死SD大鼠模型。

心肌梗死SD大鼠模型具体构建方法如下：

(1)饲养SPF级SD雄性大鼠至2～3月龄，体重为2.59±21g；

(2)利用水合氯醛溶液(10％w/v)进行腹腔注射麻醉，每只SD雄性大鼠麻醉时水合氯醛溶液(10％w/v)的用量为0.3mL/100g；

(3)调整麻醉后的SD雄性大鼠的呼吸频率至70次/分，吸气/呼气比值至1:3，潮气量约为3mL/100g，同时进行呼吸机辅助呼吸；

(4)冠脉结扎：在麻醉后的SD雄性大鼠的左侧胸部常规脱毛并消毒，依次切开皮肤、浅筋膜和深筋膜，用止血钳钝性分离胸大肌和前锯肌交界处，在靠胸骨缘处用止血钳钝性分离第3-4肋间进胸，剪断第3-4肋软骨，撑开肋间露出心脏，用两个带橡皮圈的小拉钩拉开手术切口两侧组织，用湿润的棉签小心推开心脏周围的肺组织，扩大手术视野，用镊子提起心包壁层，再用眼科剪小心剪开心包，棉签向上推开胸腺即可清楚暴露左冠状静脉，以左冠状静脉为标志，用7-0眼科无创带线缝合针穿过其深部，进针深度为0.5～1.0mm并打结，在大鼠左心耳与肺动脉圆椎间，距主动脉根部约3mm结扎冠状动脉；

(5)术后处理：术毕，将步骤(4)中大鼠放入小饲养笼中，30℃条件下苏醒，每只存活的大鼠放入小饲养笼中单独饲养(主要防止术后因为大鼠的伤口或者血腥味相互打斗)，共饲养7d，术后肌肉注射青霉素预防感染并给予姜黄素腹腔注射治疗。将饲养7d后的小鼠分组备用。

实施例5

本实施例的目的在于，验证实施例2提供的人脂肪间充质干细胞外泌体对心肌梗死SD大鼠模型中梗死心肌组织修复的影响。

将实施例4中存活的心肌梗死SD大鼠均分为3组，编号为A、B、C、，分别注射生理盐水、实施例1提供的脂肪间充质干细胞、实施例2提供的人脂肪间充质干细胞外泌体。A组为心肌梗死模型组，每次按0.5ml/只注射生理盐水；B组为人脂肪间充质干细胞组，按照0.5ml/只注射实施例3提供的人脂肪间充质干细胞悬液，人脂肪间充质干细胞悬液中细胞密度为5×10⁵cells/ml；C组按0.5ml/只注射实施例3提供的人脂肪间充质干细胞来源的外泌体。A～C三组大鼠均分别处理3次，每隔5d处理一次。

处理结果如图7和表4所示。图7中A～C图以及表4中的A～C组均分别对应本实施例中A～C组。

表4不同处理方式处理心肌梗死SD大鼠后的结果

由图7可知，A组注射生理盐水后，梗死面积远远大于注射脂肪间充质干细胞的B组，而B组的梗死面积又远远远大于C组的梗死面积(p<0.05)。

人脂肪间充质干细胞外泌体作为一种膜囊泡，可以通过生长因子、趋化因子、细胞因子、转录因子、基因和RNA等起到一定的作用。干细胞本身是具有极大的医用价值的生物材料，也有较多的干细胞被应用于心肌梗死、心理衰竭等心脏疾病及心脏相关的疾病，目前的研究仍然面临一些障碍，比如细胞在损伤区留置率比较低，细胞植入人体后存活率也比较低。并且，实际上多数研究仅仅停留在细胞水平，由于其技术本身的缺陷，比如某些技术参数的限制，使得这些研究无法进入动物水平验证其心肌保护的作用。然而，本发明提供的人脂肪间充质干细胞外泌体，选用人脂肪间充质干细胞，通过特定的细胞培养、离心和过滤等步骤，获得了能克服前述缺陷的人脂肪间充质干细胞来源外泌体，该人脂肪间充质干细胞外泌体含有对心肌梗死后心肌细胞修复的多种活性因子，如抑炎因子IL-10、IL-7、HGF以及TGF-β等，活性促生长因子miR-145、VEGF、EGFR、PDGF和miR-146b等，这些因子协同作用以保护受损细胞，其具体作用机制如下，主要通过4种方式发挥细胞间信息传递及生物学功能：

(1)人脂肪间充质干细胞外泌体作为信号复合物，可以通过细胞表面的配体作用，直接刺激受体细胞，激发受体细胞内信号级联，引发一系列的生化和生理过程；

(2)人脂肪间充质干细胞外泌体在细胞间转移受体，将受体转移至靶细胞，促进抑炎因子和活性促生长因子的作用，加速受损心肌细胞的恢复；

(3)人脂肪间充质干细胞外泌体向受体细胞运送功能蛋白或传染性颗粒，进一步促进受体细胞的恢复；

(4)人脂肪间充质干细胞外泌体通过mRNA、microRNA或转录因子向受体细胞传递遗传信息。人脂肪间充质干细胞外泌体被受体细胞吸收后，其内载有的脂质、蛋白质、mRNA、microRNA等抑炎及生命活性因子可以通过改变受损心肌细胞转录和翻译程序影响蛋白修饰和定位，调节信号级联通路、关键酶反应以及细胞自动调节等方式影响受体细胞的细胞表型和功能，从而对心肌细胞起到修复及保护作用。

本发明的优点在于：人体脂肪可以从皮下脂肪获得，取材方法较为简单，使用人脂肪制备自体脂肪间充质干细胞外泌体时，更容易被患者从心理上接受，同时，由于是自体人脂肪间充质干细胞外泌体，不会发生排斥反应。同时，脂肪间充质干细胞增殖能力强，受年龄影响较小，就算是年龄较大的患者，依然可以获得活力较好的脂肪间充质干细胞外泌体。因此，本发明提供的人体脂肪干细胞来源外泌体制备方法可简单高效的制备大量高纯度效果好的人脂肪间充质干细胞外泌体，可以进一步应用于心肌梗死的治疗当中。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：培养人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到所述人脂肪间充质干细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞通过消化人体脂肪组织、接种和传代培养制得，消化所述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.06～0.16％的IV型胶原酶和质量百分数为0.015～0.02％的BSA。

3.根据权利要求2所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞为P2～P8代。

4.根据权利要求3所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，消化所述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.1％的IV型胶原酶和质量百分数为0.02％的BSA。

5.根据权利要求4所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，消化的时间为30～35min。

6.根据权利要求5所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，培养所述人体脂肪干细胞的培养液为体积百分数为10％的无外泌体的胎牛血清培养基。

7.根据权利要求6所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞消化后接种的密度为2～6×10⁴cells/cm²。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，对所述上清液进行超速离心时，所述差速离心包括以1500g离心10min后再以10000g离心10min。

9.根据权利要求8所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，对所述上清液进行超速离心时，所述超速离心的条件为100000g离心2h。

10.根据权利要求8所述的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，过滤所述目的微球所用的滤膜的孔径为0.22μm。

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