CN111471650B - 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体、鉴定方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体、鉴定方法及应用。本发明发现，由人脐带间充质干细胞分泌出的外泌体可以被心肌细胞摄取且可以有效改善柯萨奇B3(CVB3)诱导病毒性心肌炎小鼠(VMC)的心脏功能、抑制心肌炎小鼠心脏细胞的凋亡，且可以有效抑制CVB3诱导体外培养人源心肌细胞(HCMs)细胞凋亡。按照本发明，可以实现将人源脐带间充质干细胞来源的外泌体(hucMSC‑exosomes)作用于VMC小鼠模型，在一定程度起到改善病症作用，从而为未来采用干细胞来源外泌体治疗病毒性性心肌炎提供新的方法。

Description

一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体、鉴定方法及应用

技术领域

本发明涉及一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体、鉴定方法及应用。

背景技术

病毒性心肌炎(VMC)是导致年轻人心衰、心律失常、猝死的重要原因，该疾病与病毒感染后引起的机体细胞免疫损伤和凋亡密切相关。在过去的几十年里，病毒性心肌炎患者主要通过常规治疗、免疫调节治疗、免疫抑制治疗等，可以部分带来患者临床康复，但不能完全康复的患者可能会演变为扩张型心肌病。因此，探索新的有效治疗方法变得越来越有必要。

干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的祖细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。但是目前发现采用干细胞移植治疗具有免疫排斥，伦理学问题，以及致瘤风险等问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，第一方面，本发明提供一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体，其制备过程包括以下步骤：

步骤一：获得人脐带间充质干细胞(hucMSCs)并进行培养；

步骤二：当人脐带间充质干细胞达到80-90％融合后，用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化传代细胞，进行扩增培养；

步骤三：收集细胞上清，离心去除漂浮的死细胞和细胞碎片，过滤离心后的上清液，以120000g离心力超速离心90分钟得到外泌体，收集的外泌体用PBS洗涤1次。

步骤一中，在无菌条件下，将脐带组织切开，剔除脐动静脉；将脐带组织用含1％庆大霉素的PBS冲洗2次，去除血凝块和红细胞，切割成1mm³大小组织块。然后用0.1％II型胶原酶在37℃摇床上消化6小时，用100目筛网过滤，滤液1000转/分钟离心10分钟,PBS重悬沉淀洗涤2次；用DMEM/F12+10％FBS(胎牛血清)+1％P/S(青霉素/链霉素)完全培养基轻轻吹打细胞沉淀，充分混匀后，转移到25cm²的培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，此时细胞计为原代(P0)。培养期间每2天更换一次新鲜培养基。

步骤二中，传代后的hucMSCs(P1)达到80％融合之后,用PBS洗3次,然后用含10％exosome-depleted FBS(不含外泌体的胎牛血清)的DMEM/F12完全培养基培养40-56小时。

步骤三中，离心去除漂浮的死细胞和细胞碎片具体离心的过程如下：300g离心力离心10分钟，2000g离心力离心10分钟,10000g离心力离心50分钟。

步骤三中，上清液用直径为0.22微米过滤器离心过滤收集。

第二方面，本发明提供上述的脐带间充质干细胞来源的外泌体的鉴定方法，通过免疫印迹方法分析外泌体蛋白标记物的表达情况，具体表达包括以下：阳性表达CD63、CD81、CD9。

透射电镜成像显示人脐带间充质干细胞来源的外泌体呈杯托状。

纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果表明人脐带间充质干细胞来源的外泌的大小呈单峰排列，平均大小为115.4纳米。

第三方面，本发明提供上述的脐带间充质干细胞来源的外泌体可替代间充质干细胞用于治疗病毒性心肌炎的应用。

本发明发现，由人脐带间充质干细胞分泌出的外泌体可以被心肌细胞摄取且可以有效改善CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠(VMC)的心脏功能、抑制心肌炎小鼠心脏细胞的凋亡，且可以有效抑制CVB3诱导体外培养人源心肌细胞(HCMs)细胞凋亡。按照本发明，可以实现将人源脐带间充质干细胞来源的外泌体(hucMSC-exosomes)作用于VMC小鼠模型，在一定程度起到改善病症作用，从而为未来采用干细胞来源外泌体治疗病毒性性心肌炎提供新的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1为人源脐带间充质干细胞(hucMSCs)和脐带间充质干细胞来源的外泌体(hucMSC-exosomes)的鉴定；(A)hucMSCs的明场图片，标尺100微米；(B)流式细胞术分析hucMSCs表面标志物的表达；(C)使用纳米颗粒跟踪分析(NTA)分析hucMSC-exosomes的大小分布；(D)利用透射电镜(TEM)观察hucMSC-exosomes(黑色箭头)的大小和形状，标尺100纳米；(E)免疫印迹分析；

图2为心脏组织和HCMs对hucMSC-exosomes的摄取；荧光显微镜显示用PKH26标记的hucMSC-exosomes(红色荧光)在体内心脏心肌细胞(A)和体外培养的HCMs(B)中，标尺100微米；

图3为hucMSC-exosomes对CVB3诱导的心肌炎(VMC)小鼠心脏功能的影响；(A)心脏组织H&E染色，标出100微米。(B)每组的组织病理学评分(n＝8)；(C)qPCR检测IL-1,IL-6和TNF-ɑ在心脏组织中的表达情况(n＝6)；(D)典型的M型超声心动图(n＝8)；(E)四组的LVEF和LVFS定量结果，数据以均数±标准差表示，NS表示无显著性差异。^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001显示与正常对照组(0.1毫升NS，无CVB3)或hucMSC-exosome处理(0微克)相比有显著差异；

图4为HucMSC-exosome抑制CVB3诱导的心肌炎(VMC)小鼠细胞凋亡；(A)心脏组织的TUNEL和cTNI染色，标尺100微米；(B)TUNEL阳性细胞百分比；(C)免疫印迹分析；(D)免疫印迹的定量结果，数据以均数±标准差表示(n＝6)。NS表示无显著性差异，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001显示与正常对照组(0.1毫升NS，无CVB3)或hucMSC-exosome处理(0微克)相比有显著差异；

图5为HucMSC-exosomes抑制CVB3诱导体外培养人源心肌细胞(HCMs)细胞凋亡；(A)Annexin V和PI法检测细胞凋亡；(B)Annexin V和PI结果定量分析；(C)免疫印迹分析；(D)免疫印迹的定量分析，数据以均数±标准差表示(n＝6)，^**P<0.01,^***P<0.001显示与正常对照组(0.1毫升NS，无CVB3)或hucMSC-exosome处理(0微克)相比有显著差异。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：人源脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-exosomes)的获得

步骤一：人源脐带间充质干细胞(hucMSCs)的分离和培养：

采用胶原酶消化法获得人脐带间充质干细胞(hucMSCs)。简而言之，在无菌条件下，将脐带组织切开，剔除脐动静脉。将脐带组织用含1％庆大霉素的PBS冲洗2次，去除血凝块和红细胞，切割成1mm³大小组织块。然后用0.1％II型胶原酶在37℃摇床上消化6小时，用100目筛网过滤，滤液1000转/分钟离心10分钟,PBS重悬沉淀洗涤2次。用DMEM/F12+10％FBS(胎牛血清)+1％P/S(青霉素/链霉素)完全培养基轻轻吹打细胞沉淀，充分混匀后，转移到25cm²的培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，此时细胞计为原代(P0)。培养期间每2天更换一次新鲜培养基。当细胞达到80-90％融合时，用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化传代细胞。

步骤二：人源脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-exosomes)的分离：

hucMSCs达到80％融合之后,用PBS洗3次,然后用含10％exosome-depleted FBS(不含外泌体的胎牛血清)的DMEM/F12完全培养基培养。培养40-56小时后,将收集的细胞上清，按如下程序离心：300g离心力离心10分钟，2000g离心力离心10分钟,10000g离心力离心50分钟，分别去除漂浮的死细胞和细胞碎片。用直径为0.22微米过滤器过滤离心后上清液。然后以120000g离心力超速离心90分钟得到外泌体，收集的外泌体用PBS洗涤1次。最后，收集的外泌体用一定体积的PBS重悬，分装后保存在-80℃备用(一般不超过一个月)。

实施例2：人源脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-exosomes)的鉴定

细胞流式鉴定实施例1中步骤一得到的人源脐带间充质干细胞(hucMSCs)：用含0.25％EDTA的胰蛋白酶消化第三代hucMSCs(P3)，1500转/分钟离心5分钟收集hucMSCs。PBS清洗1次，然后500微升4％多聚甲醛4℃固定过夜，弃固定液，2毫升PBS震荡重悬，离心弃上清。用2毫升含5％FBS的PBS室温封闭10分钟，离心弃上清，同时设置同型对照组。按1：50加入FITC或PE标记的荧光抗体FITC-CD29，FITC-CD44，FITC-CD59，FITC-CD90，PE-CD105，PE-CD166，和FITC-CD34工作液100微升(5微升抗体/100微升细胞悬液)，室温避光孵育30分钟，离心去上清，加入500微升PBS清洗3次，最后用200微升PBS重悬，过滤并上机检测。从人脐带分离的hucMSCs具有典型的间充质干细胞样梭形(图1A)。细胞流式检测结果显示，分离的hucMSCs能阳性表达CD44、CD29、CD90、CD59、CD105、CD166，阴性表达CD34(图1B)。

鉴定实施例1步骤二得到的人源脐带间充质干细胞外泌体(hucMSC-exosomes)：用ZetaView进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)来检测外泌体的粒径和浓度。用透射电镜(TEM)观察外泌体的形态。使用BCA蛋白检测试剂盒测定分离外泌体的蛋白浓度，从而相对定量外泌体的浓度。通过免疫印迹方法分析CD81、CD63、CD9等外泌体蛋白标记物的表达情况。纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果表明，hucMSC-exosomes的大小呈单峰排列，平均大小为115.4纳米(图1C)。此外，透射电镜(TEM)成像显示hucMSC-exosomes直径约100纳米，呈杯托状(图1D)。同时，免疫印迹检测结果显示，hucMSC-exosomes可阳性表达CD63、CD81、CD9等外泌体特异性蛋白标志物(图1E)。这些结果表明从人脐带组织中分离出的细胞为hucMSC，并成功分离出hucMSC-exosomes。

实施例3：人源脐带间充质干细胞(hucMSCs)治疗病毒性心肌炎(VMC)效果的验证

病毒

利用Hep2细胞对柯萨奇B3病毒(CVB3,Nancy株，美国)进行了维持培养和扩增。采用50％组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。

动物实验

所有动物实验均按照国家卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并经温州医科大学动物伦理委员会批准，35日龄雄性BALB/c小鼠(20-22克)购自上海斯莱克实验动物中心。在23±2℃的温度下，以12小时暗/光周期饲养，并可随意取食和取水。BALB/c小鼠腹腔注射0.1毫升含1×10⁵TCID50 CVB3的生理盐水(NS)，建立小鼠VMC模型。对照组腹腔注射0.1毫升不含CVB3的NS。老鼠被随机分为四组即对照组(尾静脉注射0.1毫升NS),VMC组(尾静脉注射0.1毫升NS),VMC+L-EXO组(尾静脉注射0.1毫升含5微克hucMSC-exosomes的NS),和VMC+H-EXO组(尾静脉注射0.1毫升含50微克hucMSC-exosomes的NS)。

细胞实验

人心肌细胞sv40(HCM，Abmgood，美国)用10％exosome-depleted FBS(不含外泌体的胎牛血清)在37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养基每2天更换一次。在FBS饥饿条件下，HCMs暴露于CVB3处理2小时，病毒感染复数(MOI)为10，建立细胞VMC模型。对照组仅给予无FBS的DMEM/F12基础培养基处理2小时。将HCMs以3×10⁵个/孔的密度接种到6孔培养板上，待细胞贴壁培养24小时后,暴露于CVB3建立VMC模型，然后给予50微克/毫升exosomes培养24小时。

PKH26标记的hucMSC-exosomes细胞摄取实验

按照说明书，将来自hucMSC的外泌体用PKH26(西格玛奥德里奇,美国)进行标记。把1微升PKH26与250微升稀释剂C混合，再将25微升的hucMSC-exosomes添加到混合物，室温下孵育5分钟。然后添加500微升0.5％exosome-depleted FBS(不含外泌体的胎牛血清)室温孵育5分钟使反应停止。然后，外泌体在4℃条件下120000g离心力离心90分钟,最后用PBS重悬后，进行细胞摄取试验。动物水平摄取,小鼠尾静脉注射PKH26标记液(5微克或者50微克)或同等体积的PBS。注射后第7天处死小鼠，收集心脏组织，使用O.C.T.将心脏组织冻存于-80℃。将冷冻组织不连续切成5微米厚的切片。细胞水平摄取，HCMs中加入50微克/毫升PKH26标记的外泌体在含10％exosomes-depleted FBS(不含外泌体的胎牛血清)，在37℃、5％CO₂培养箱培养24小时。对照组则用等体积的PBS孵育。组织冰冻切片和细胞爬片首先用PBS洗涤两次,然后用新鲜4％多聚甲醛室温固定10分钟,再用含0.1％曲通-100(Triton x-100)的PBS室温通透15分钟。再用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室温下封闭1小时,接着用肌钙蛋白I(cTNI)抗体在4℃下孵育12小时。之后，用带绿色荧光FITC标记的二抗(艾博抗，美国)在37℃孵育1小时。再用DAPI(碧云天，中国)室温条件下避光染色5分钟，最后在荧光显微镜下观察(奥林巴斯，日本)。

病理变化评估

小鼠处理后7天,过麻醉后处死取心脏组织。每组小鼠心脏用4％福尔马林固定,脱水,石蜡包埋,切成5微米厚的切片。用苏木精和伊红染色观察心脏组织的病理变化。每个心脏平均切成3片，每片观察5个视野。在光学显微镜下对心脏组织的炎症、水肿和坏死进行半定量评分。心脏损伤的程度是由两个独立的观察者盲目分级的。病理评分如下:0分表示无病变；1分表示病变侵犯了25％的心肌；2分表示病变范围为心肌的25-50％；3分表示病变范围为心肌的50-75％；4分表明病变涉及75-100％的心肌。每个部分的分数取平均值。

实时定量PCR(RT-qPCR)检测

使用Trizol试剂(英潍捷基，美国)从四组小鼠心脏组织中提取总RNA，根据说明书，经逆转录试剂盒(全氏金，中国)进行逆转录成cDNA。这些cDNAs被作为后续使用SYBR试剂盒(伯乐,美国)进行qPCR测定的模板。反应后根据Ct值统计分析，使用基于Ct(2^-ΔΔCt)方法进行定量分析。所有反应均为一式三份。引物序列为：

IL-1-F:TTCATCTCGGAGCCTGTAGTG

IL-1-R:TGTCTTTCCCGTGGACCTT

IL-6-F:CACCAGCATCAGTCCCAAG

IL-6-R:GGAGCCCACCAAGAACG

TNF-α-F:GCTCCTCCACTTGGTGGTTTGT

TNF-α-R:ACTCCAGGCGGTGCCTATGTC

GAPDH-F:GGTTGTCTCCTGCGACTTCA

GAPDH-R:TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC

多普勒超声心动图检测

小鼠处理后7天,使用M型超声(30兆赫兹，Vevo 1100，加拿大)进行经胸超声心动图检测。在乳头状肌水平，经长轴测量左室收缩末期内径(LVESd)和左室舒张末期内径(LVEDd)。根据LVESd和LVEDd计算左室射血分数(LVEF)和缩短分数(FS)。

TUNEL染色

心脏组织用O.C.T.包埋后切成5微米厚的切片。之后切片先用cTNI染色，然后用TUNEL试剂盒(罗氏，德国)染色检测细胞的凋亡。图像由尼康显微镜(奥林巴斯，日本)拍摄。

免疫印迹分析

从均质心肌组织和HCM细胞中提取蛋白。使用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天，中国)测定蛋白浓度。20-40微克蛋白质用8-12％聚丙烯酰胺凝胶分离,然后被转移到PVDF膜(赛默飞，美国)。将膜在5％脱脂牛奶中室温封闭2小时，然后与一抗4℃孵育过夜。用1:2000稀释的兔或小鼠与辣根过氧化物酶结合的二抗(艾博抗，美国)室温孵育2小时，洗涤3次每次10分钟。最后，使用增强型化学发光检测系统对膜进行检测。一抗为：CD81(1:200,圣克鲁斯，美国)，CD63(1:200,圣克鲁斯，美国)，CD9(1:200,圣克鲁斯，美国)，GAPDH(1:1000,艾博抗，美国)，BAX(1：1000，艾博抗，英国),BCL-2(1:1000,艾博抗，美国),cTNI(1：1000，艾博抗，英国)。

Annexin V和PI法检测细胞凋亡率

HCMs以1×10⁵细胞/孔的密度接种于12孔板中。细胞建立VMC模型后，用50微克/毫升外泌体或同等体积的PBS处理培养24小时。使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(优宁维，中国)评估早期和晚期细胞凋亡。所有细胞用含0.25％EDTA胰蛋白酶消化收集，然后用冷PBS洗涤两次，用Annexin V缓冲液重悬。之后，细胞用5微升Annexin V和5微升PI混液室温孵育15分钟。凋亡细胞包括Annexin V⁺/PI^-的细胞。用DTX800多模检测器(贝克曼,加拿大)测定荧光强度，从而评估凋亡率。

通过以上实验，最后发现如下结果：

1.体内和体外实验验证hucMSC-exosomes可被心肌细胞摄取

为了证明hucMSC-exosomes在体内可以被心肌细胞摄取，在体外可以被HCMs摄取，首先用带红色荧光的PKH26染料对hucMSC-exosomes进行了标记，标记后的hucMSC-exosomes在荧光显微镜下可呈现出强烈的红色荧光。体内示踪结果显示，带有红色荧光的hucMSC-exosomes可以均匀地分布到被cTNI染色的心肌细胞中，随着hucMSC-exosomes浓度的增加，荧光密度增强(图2A)。此外，体外示踪结果显示，被cTNI染色后的HCMs也可内摄取PKH26标记的hucMSC-exosomes(图2B)。对照组在体内外均未见细胞内红色荧光。这些结果提示hucMSC-exosomes可被体内和体外的心肌细胞所摄取。

2.HucMSC-exosomes对CVB3诱导的心肌炎(VMC)小鼠心脏功能的影响

为了探索hucMSC-exosomes对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的心肌炎(VMC)的治疗效果。分别将低浓度hucMSC-exosomes(5微克，L-EXO)和高浓度hucMSC-exosomes(50微克,H-EXO)通过尾静脉注射入VMC小鼠。外泌体作用后的心脏切片，H&E染色结果表明，hucMSC-exosomes(50微克,H-EXO)可以有效地减少VMC小鼠的细胞炎症渗透和坏死(图3A),以及显著改善心肌病理评分(图3B)。然而，hucMSC-exosomes(5微克，L-EXO)没有显著的效果。此外,qPCR数据显示，高浓度hucMSC-exosomes可以明显减少VMC小鼠心脏组织中炎症细胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α的水平(图3C)。此外，M型心超图显示，高浓度hucMSC-exosomes也能显著地改善VMC小鼠的室壁运动，但是低浓度hucMSC-exosomes效果不明显(图3D)。另外，高浓度hucMSC-exosome可显著增加VMC小鼠的LVEF和LVFS值(图3E)。这些结果表明hucMSC-exosomes(50微克，H-EXO)可以有效地改善VMC小鼠的心脏功能。

3.HucMSC-exosome抑制CVB3诱导的心肌炎(VMC)小鼠细胞凋亡

细胞凋亡是心肌组织损伤的一个重要指标。与正常对照组相比，在CVB3诱导的心肌炎(VMC)小鼠心脏组织中发现较多被TUNEL染色的凋亡细胞。然而，hucMSC-exosome(50微克，H-EXO)能有效地减少VMC小鼠的凋亡细胞(图4A)。定量结果显示，与VMC组相比，高浓度hucMSC-exosome(50微克，H-EXO)可以显著地降低TUNEL阳性细胞的比率，而低浓度hucMSC-exosome(5微克，L-EXO)效果并不显著。此外,免疫印迹结果表明高浓度和低浓度hucMSC-exosomes都能明显抑制VMC小鼠心脏中凋亡蛋白Bax的表达，但是仅高浓度hucMSC-exosome(50微克，H-EXO)可以明显上调VMC小鼠心脏的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(图4C和4D)。这些数据表明，高浓度hucMSC-exosome(50微克,H-EXO)可以显著地抑制VMC小鼠心脏细胞的凋亡。

4.HucMSC-exosomes抑制CVB3诱导体外培养人源心肌细胞(HCMs)细胞凋亡

为了进一步证实hucMSC-exosomes可有效地抑制CVB3诱导的心肌细胞凋亡，我们通过细胞流式(图5A)和免疫印迹(图5B)检测了不同处理条件下体外培养的HCM细胞凋亡。统计晚期凋亡(Q1-UR)和早期凋亡(Q1-LR)之和来计算细胞凋亡百分比。Annexin V和PI法检测结果显示，对照组细胞凋亡率仅为1.87％，而CVB3诱导的HCMs(VMC)细胞凋亡率却高达16.58％。HucMSC-exosomes(50微克/毫升)能有效地抑制VMC的细胞凋亡，凋亡率为6.71％(图5C)。免疫印迹结果显示VMC组细胞凋亡蛋白Bax水平明显上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下调。HucMSC-exosomes(50微克/毫升)可以有效地抑制CVB3诱导的HCM细胞凋亡蛋白Bax水平和促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达(图5D)。这些数据表明，hucMSC-exosomes可以有效地抑制CVB3诱导体外培养人源心肌细胞(HCMs)细胞凋亡。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (8)

1.一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：

所述人脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备过程包括以下步骤：

步骤一：获得人脐带间充质干细胞并进行培养；

步骤二：当人脐带间充质干细胞达到80-90%融合后，用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化传代细胞，进行扩增培养；

步骤三：收集细胞上清，离心去除漂浮的死细胞和细胞碎片，过滤离心后的上清液，以120000g离心力超速离心90分钟得到外泌体，收集后的外泌体用PBS洗涤1次。

2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：步骤一中，在无菌条件下，将脐带组织切开，剔除脐动静脉；将脐带组织用含1%庆大霉素的PBS冲洗2次，去除血凝块和红细胞，切割成1mm³大小组织块；然后用0.1% II型胶原酶在37°C摇床上消化6小时，用100目筛网过滤，滤液1000转/分钟离心10 分钟，PBS重悬沉淀洗涤2次；用DMEM/F12+10% FBS+1% P/S完全培养基轻轻吹打细胞沉淀，充分混匀后，转移到25 cm²的培养皿中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，此时细胞计为原代；培养期间每2天更换一次新鲜培养基。

3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：步骤二中，传代后的人脐带间充质干细胞达到80%融合之后,用PBS洗3次，然后用含10% exosome-depleted FBS的DMEM/F12完全培养基培养40-56小时。

4.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：步骤三中，离心去除漂浮的死细胞和细胞碎片具体离心的过程如下：300 g离心力离心10分钟，2000g离心力离心10分钟, 10000g离心力离心50分钟。

5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：步骤三中，上清液用直径为0.22微米过滤器离心过滤收集。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：所述人脐带间充质干细胞来源的外泌体的鉴定方法通过免疫印迹方法分析外泌体蛋白标记物的表达情况，具体表达包括以下：阳性表达CD63、CD81、CD9。

7.根据权利要求6所述的人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：透射电镜成像显示人脐带间充质干细胞来源的外泌体呈杯托状。

8.根据权利要求6所述的人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于制备治疗病毒性心肌炎药物的应用，其特征在于：纳米颗粒跟踪分析结果表明人脐带间充质干细胞来源的外泌体 的大小呈单峰排列，平均大小为115.4纳米。

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