CN102908364A

CN102908364A - 一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用

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Publication number: CN102908364A
Application number: CN2012104583151A
Authority: CN
Inventors: 魏斯溧; 高宏; 王丽; 胡建霞; 张学峰
Original assignee: Qingdao Aoke Biological Development Co ltd
Current assignee: Qingdao Aoke Biological Development Co ltd
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2013-02-06
Also published as: WO2014075592A1; WO2014075592A9

Abstract

本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用，间充质干细胞注射液含有：2×10⁵-1×10⁷个/ml的间充质干细胞；体积比为5-8%的临床级DMSO；质量体积比为1-6%的人血白蛋白和复方电解质溶液。本发明用胎盘和脐带来制备间充质干细胞注射液，此间充质干细胞产量较大，制备体系易于质控，易于产业化；它可以直接经程控降温冻存，复苏后可直接用于临床注射，安全可靠；本发明可以改变扩张的心肌结构，恢复心脏功能，改善全身各组织供血状态，改善患者的生活质量，彻底治疗扩张型心肌病。从而使患者摆脱大量服药及生命活动受限以及病情控制不佳导致的严重并发症。

Description

一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用。

背景技术

扩张型心肌病是一侧或双侧心腔扩大并伴有心肌肥厚，心肌收缩期泵血功能障碍，产生充血性心力衰竭。本型的特征为左或右心室或双侧心室扩大，并伴有心肌肥厚。心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭。病情呈进行性加重，死亡可发生于疾病的任何阶段。室性或房性心律失常多见，为首见或主要的表现，并有多种心律失常合并存在而构成比较复杂的心律，可以反复发生。高度房室传导阻滞、心室颤动、窦房阻滞或暂停可导致阿-斯综合征，成为致死原因之一，此外，尚可有脑、肾、肺等处的栓塞。目前的药物治疗或心脏移植不能很好的改善患者的病情及死亡率。干细胞技术的发展为此疾病的治疗带来了希望。

儿童扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）是一类原因不明的心肌疾病，国内其发病率约为84/10万人。DCM的病程呈进行性，预后极差，严重危害儿童健康，其1年的存活率为60%～90%，5年的存活率为20%～80%。目前，DCM仍无特效治疗，基础药物包括洋地黄、利尿剂、血管扩张剂、神经内分泌阻滞剂，生长激素、大剂量免疫球蛋白等在内的治疗措施虽可改善部分DCM患儿的预后，但仍不能从根本上解决问题。在世界各地所作的心脏移植病例中，DCM病人约占44%；虽然有研究者认为左室减容术可明显提高左心室功能，但其住院死亡率仍高达10～20%，其2年生存率仅为60%；几乎50%的有症状的儿童心肌病患者需要接受心脏移植或在2年内死亡。因此，创新性探索儿童DCM治疗的新方法，对改善儿童DCM的预后具有重要的临床意义。

目前儿童扩张型心肌病的治疗主要解决的是防治心律失常和心功能不全，以及对症支持治疗，不能从根本上治疗疾病，患者需服用大量纠正心律失常及维护心脏功能的药物，日常活动严格受限，在此情况下病情仍然容易加重，疲劳、受凉、感染等诱因下很容易发生心力衰竭，危及患者生命。目前的药物与手术治疗并不能很好的避免这些情况的发生，改变患者扩大的心脏，恢复正常心脏结构才是治疗扩张型心肌病的根本。

理论上，胚胎干细胞和诱导的多能分化干细胞是儿童心肌病患者细胞性心肌成形术的理想种子细胞；但前者的来源有限，且可能存在伦理学问题；而后者在培养过程中需要添加的诱导物质以及培养液本身对种子细胞以及对心肌细胞的作用尚未明确，因此大大限制了其临床应用，多限于动物实验研究。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新能力的多能分化干细胞，分布在骨髓、脐带、胎盘和成人的许多其他组织中。可分化为多种细胞，如骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞和肌腱细胞。因此，MSCs被称为通用捐献细胞。近年来，应用骨髓间充质干细胞移植修复受损心肌成为国内外研究的热点；研究证实间充质干细胞可以抑制心肌内的炎症反应、抑制心肌细胞的凋亡、刺激心肌内血管新生；在DCM动物模型中有明显的治疗效果，在临床研究中显示间充质干细胞治疗早期可明显改善成人DCM的心室功能。但骨髓间充质干细胞的来源有限，获取途径具有创伤性；且随年龄的增长，骨髓中有分化潜能的间充质干细胞逐渐减少；另外，诱导后的骨髓间充质干细胞转化为心肌样细胞的效率较低。对儿童来说抽取骨髓极不方便，儿童本人和家长接受度不高，同时小儿骨髓的抽取量较少。

后来研究者相继发现脐带组织和胎盘中含有丰富的间充质干细胞，且经诱导后可分化为神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞以及心肌细胞等。Yoo等比较了来源于成人骨髓、睾丸组织和脐带组织的MSCs的免疫调节作用，发现它们的免疫抑制作用和分泌因子基本一致，认为来源于脐带组织的间充质干细胞可作为骨髓来源的MSCs的替代者用于同种异体干细胞治疗。脐带MSCs具有低免疫原性和独特的免疫调节作用，能调节体内过激或较弱的免疫反应，减少自身异常免疫反应对自身组织而破坏。胎盘、脐带来源的MSCs具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，使其有可能成为用于组织修复、免疫紊乱的调节和代谢性疾病细胞治疗最具临床应用前景的多能干细胞。

综上，目前儿童扩张型心肌病的治疗主要依赖于控制心律失常、改善心脏功能等药物治疗，这些药物不能有效地改善心脏结构及功能，病情严重时只能靠心脏移植，但由于心脏来源有限，且配型困难，很多患者等不到可供移植的心脏。干细胞技术的发展使得学者们开始了干细胞治疗扩张型心肌病的研究。理论上，胚胎干细胞和诱导的多能分化干细胞是儿童心肌病患者细胞性心肌成形术的理想种子细胞；但前者的来源有限，且可能存在伦理学问题；而后者在培养过程中需要添加的诱导物质以及培养液本身对种子细胞以及对心肌细胞的作用尚未明确，因此大大限制了其临床应用，多限于动物实验研究。

发明内容

针对现有技术中存在的治疗儿童扩张型心肌病的上述缺点，本发明提供了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用。本发明可以从根本上改变扩张型心肌病患者的心脏结构，提高患者的生存率，彻底治疗扩张型心肌病。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种间充质干细胞注射液，它包括以下组分：

含量为2×10⁵-1×10⁷个/ml的间充质干细胞；

体积比为5-8%的临床级DMSO；

质量体积比为1-6%的人血白蛋白；

余量为复方电解质溶液。

对上述技术方案的进一步改进：所述间充质干细胞来源于人脐带和/或人胎盘。

对上述技术方案的进一步改进：所述间充质干细胞活力保持在85%以上。

本发明还提供了所述的间充质干细胞注射液的制备方法，包括脐带间充质干细胞的制备和胎盘间充质干细胞的制备。

本发明还提供了所述的间充质干细胞注射液在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用。

对上述技术方案的进一步改进：含有间充质干细胞注射液药物的用量为含有1×10⁶-1×10⁸个/ml间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1.本发明用人间充质干细胞注射液来治疗儿童扩张型心肌病，选择用胎盘和脐带来制备间充质干细胞注射液，此间充质干细胞产量较大，制备体系易于质控，易于产业化。

2.本注射液可以直接经程控降温冻存，复苏后可直接用于临床注射，安全可靠。

3.间充质干细胞免疫原性低，异体使用无需配型。间充质干细胞注射到患者体内后，可分泌很多细胞生长因子、血管新生因子及干细胞激活因子，促进病变心肌的恢复，激活体内心脏干细胞再生修复心脏结构，从而达到从根本上治疗扩张型心肌病的目的。本发明可以逆转扩张型心肌病的病程，改变扩张的心肌结构，从根本上改变扩张型心肌病患者的心脏结构，恢复心脏功能，改善全身各组织供血状态，提高患者的生存率，改善患者的生活质量，彻底治疗扩张型心肌病。从而使患者摆脱大量服药及生命活动受限以及病情控制不佳导致的严重并发症。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明中大鼠心肌组织治疗后病理变化比较图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、脐带间充质干细胞的制备

1.新鲜足月健康胎儿脐带，用PBS缓冲液冲洗；所述PBS缓冲液含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素；

2.剪取3-15cm长脐带，将脐带剪成1-2cm长的小段，用PBS缓冲液反复冲洗；所述PBS缓冲液含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素；

3.将脐带组织块剪碎成5mm³小块；

4.将剪碎组织加入L-DMEM培养基洗涤，在500-700g条件下离心5分钟，弃上清；

5.将组织块和培养基按体积比2-3：1比例混匀，接种至细胞培养皿中，置培养箱培养；所述的培养基为MSC专用无血清培养基；

6.每3天换一次培养基，细胞达80%左右融合时传代；传代培养基为MSC专用无血清培养基。

二、胎盘间充质干细胞的制备

1.用含青霉素（100kU/L）、链霉素（100mg/L）和肝素钠（50u/ml）的PBS缓冲液冲洗胎盘，将胎盘剪成3-10mm³小块；

2.将胎盘组织块用上述含青霉素和链霉素的DMEM培养基混匀，在700-900g条件下离心10min；

3.弃上清，每管加含体积比0.25%胰蛋白酶的DMEM培养基于37℃消化10min，在850g条件下离心10min；

4.保留上清，过滤网后收集的滤过液在2200rpm条件下离心10min；

5.弃上清，用MSC专用无血清培养基重悬细胞，接种于培养皿，在培养箱培养；每3天进行半量换液；

6.细胞融合至80-90%，进行细胞传代，传代培养基为MSC专用无血清培养基。

三、间充质干细胞注射液的制备

该注射液是由以下成分按比例配制而成：

1、来源于人脐带和/或胎盘间充质干细胞，每毫升注射液中间充质干细胞的数量为2×10⁵-1×10⁷；

2、体积比为5-8%的DMSO（临床级）；

3、质量体积比为1-6%的人血白蛋白；

4、余量为勃脉力(复方电解质溶液)。

普通DMSO，在细胞冻存过程中起到防冻剂的作用，防止冷冻过程中细胞内形成冰晶，但细胞复苏后最好漂洗掉。临床级DMSO对细胞无毒，可以更好地起到保护细胞的作用，在细胞复苏后无需漂洗，可直接用于临床注射，对患者安全无毒。

人血白蛋白为临床常用注射液，可为细胞提供营养，利于细胞的新陈代谢。

勃脉力(复方电解质溶液)，可以保持细胞的渗透压，利于细胞的存活。该注射液组份为临床常用电解质溶液，可方便临床输注。

所述注射液可在-196℃温度中稳定保存。使用时解冻复苏后可直接输注到患者体内，细胞保持为单细胞悬液状态，细胞活力保持在85%以上，且不会引起患者不适反应。这种注射液非常利于间充质干细胞的保存、运输及存活，且临床输注安全，细胞可在此注射液中长时间保持较高的活力，便于运输而不受使用时间的苛刻限制，解决了异地患者使用时细胞长时间运输影响细胞活力的问题。

间充质干细胞注射液的具体配制过程为：如配制100ml干细胞注射液，该注射液由人间充质干细胞、临床级DMSO 5ml、人血白蛋白原液（原液质量体积比浓度为20%）25ml、勃脉力（复方电解质溶液）70ml组成。每毫升注射液中间充质干细胞的数量为2×10⁵-1×10⁷。间充质干细胞注射液在-196℃环境温度中，仍可保持单细胞悬液状态，复苏后细胞活力保持在85%以上，可直接用于临床注射。

四、间充质干细胞注射液对扩张型心肌病大鼠治疗的安全性和有效性实验

健康清洁级雄性SD大鼠50只，体重200-250g，随机分为三组：空白对照组10只，模型对照组20只，细胞治疗组20只。采用异丙基肾上腺素170mg/(kg*d)连续注射4天制备扩张型心肌病模型。模型建立成功4周后行人脐带间充质干细胞注射治疗。细胞治疗组大鼠四肢肌肉肥厚处各注射0.1ml间充质干细胞注射液（含2×10⁶细胞），空白对照组与模型对照组大鼠经四肢肌肉肥厚处各注射0.1ml PBS。

实验开始后每天定时观察大鼠活动及体征。三组均于造模末次给药后4周和治疗后4周经胸前壁测定各组动物左心结构及功能，指标包括左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、射血分数和缩短分数。同时进行心脏形态学检测：取心脏左室游离壁组织做常规病理切片，苏木精-伊红染色光镜下观察心肌组织的病理学改变，Masson三色染色显示组织胶原纤维。

结果：整个实验过程未见大鼠出现急性休克或死亡。

1.超声图像测定各组大鼠心脏功能

与空白对照组相比，细胞治疗组和模型对照组治疗前左室收缩末期内径明显增加，射血分数和缩短分数明显下降，差异有非常显著性意义(P<0.01)。治疗后4周各组大鼠进行超声心动图检查，结果显示，细胞治疗组治疗后4周和治疗前相比，左室收缩末期内径明显下降、射血分数和缩短分数明显升高，差异有显著性意义(P<0.01)。模型对照组治疗后和治疗前相比，左室舒张末期内径和左室收缩末期内径增加、射血分数和缩短分数下降，但差异无显著性意义(P>0.05)。空白对照组治疗后和治疗前相比，左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、缩短分数和射血分数差异均无显著性意义(P>0.05)，见表1和2。

表1各组大鼠造模后4周心脏功能治疗前后分析

表2各组大鼠治疗后4周心脏功能治疗前后分析

^aP<0.01,^bP<0.05,vs空白对照组；^cP<0.05，vs模型对照组；^dP<0.01vs细胞治疗组。LVDd：左室舒张末期内径；LVDs：左室收缩末期内径；FS：缩短分数；EF：射血分数。

2.心肌组织病理变化

模型对照组HE染色可见心肌细胞呈广泛的水肿和空泡变性，部分心肌细胞脂肪变性和坏死，组织间质水肿，有散在炎性细胞浸润，间质内可见成纤维细胞增生；细胞治疗组与之相比，各种受损表现减轻。Masson三色染色示胶原纤维呈蓝色，胞浆、肌纤维和红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色，见图1。其中左图为空白对照组，大鼠的正常心肌组织病理；中图为模型对照组，大鼠心肌组织病理，镜下可见大量心肌纤维化，正常心肌组织很少；右图为细胞治疗组，大鼠治疗后4周后心肌组织病理，镜下新生心肌细胞，心肌组织纤维化程度减少。细胞治疗组心脏胶原的表达明显低于模型对照组(P<0.05)。说明间充质干细胞治疗可抑制心肌纤维化的进展。

实验结果表明：人间充质干细胞注射液治疗扩张型心肌病大鼠安全可行，经间充质干细胞治疗后患病大鼠的生活状态、心脏功能及心脏结构均有明显好转，疗效显著。间充质干细胞注射液可以逆转扩张型心肌病患者的心脏结构改变，提高患者的生存率，改善生活质量。

实施例2

如配制100ml干细胞注射液，该注射液由人间充质干细胞、临床级DMSO8ml、人血白蛋白原液（原液质量体积比浓度为20%）30ml、勃脉力（复方电解质溶液）62ml组成。每毫升注射液中间充质干细胞的数量为2×10⁵-1×10⁷。间充质干细胞注射液在-196℃环境温度中，仍可保持单细胞悬液状态，复苏后细胞活力保持在85%以上，可直接用于临床注射。本发明所述质量体积比均代表质量(g)与体积(ml)的比例。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种间充质干细胞注射液，其特征在于它包括以下组分：

含量为2×10⁵-1×10⁷个/ml的间充质干细胞；

体积比为5-8%的临床级DMSO；

质量体积比为1-6%的人血白蛋白；

余量为复方电解质溶液。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于：所述间充质干细胞来源于人脐带和/或人胎盘。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液，其特征在于：所述间充质干细胞活力保持在85%以上。

4.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于配制体积比为5-8%的DMSO、质量体积比为1-6%的人血白蛋白和复方电解质溶液，将间充质干细胞重悬于上述溶液中制成单细胞悬液，使干细胞数量为2×10⁵-1×10⁷个/ml。

5.根据权利要求4所述的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于所述脐带间充质干细胞的制备包括以下步骤：

(1).新鲜足月健康胎儿脐带，用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液冲洗；

(2).剪取3-15cm长脐带，将脐带剪成1-2cm长的小段，用所述PBS缓冲液反复冲洗；

(3).将脐带组织块剪碎成5mm³小块；

(4).将剪碎组织加入L-DMEM培养基洗涤，在500-700g条件下离心5分钟，弃上清；

(5).将组织块和培养基按体积比2-3：1比例混匀，接种至细胞培养皿中，置培养箱培养；所述的培养基为MSC专用无血清培养基；

(6).每3天换一次培养基，细胞达80%左右融合时传代；传代培养基为MSC专用无血清培养基。

6.根据权利要求4所述的间充质干细胞注射液的制备方法，其特征在于所述胎盘间充质干细胞的制备包括以下步骤：

(1).用含100kU/L青霉素、100mg/L链霉素和50u/ml肝素钠的PBS缓冲液冲洗胎盘，将胎盘剪成3-10mm³小块；

(2).将胎盘组织块用上述含青霉素和链霉素的DMEM培养基混匀，在700-900g条件下离心10min；

(3).弃上清，每管加含体积比0.25%胰蛋白酶的DMEM培养基于37℃消化10min，在850g条件下离心10min；

(4).保留上清，过滤网后收集的滤过液在2200rpm条件下离心10min；

(5).弃上清，用MSC专用无血清培养基重悬细胞，接种于培养皿培养；每3天进行半量换液；

(6).细胞融合至80-90%进行细胞传代，传代培养基为MSC专用无血清培养基。

7.根据权利要求1所述的间充质干细胞注射液在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的间充质干细胞注射液在制备治疗儿童扩张型心肌病药物中的应用，其特征在于：含有间充质干细胞注射液药物的用量为含有1×10⁶-1×10⁸个/ml间充质干细胞。