CN103202794B - 一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用 - Google Patents
一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种皮肤干细胞活性素的制备方法及其应用。本发明的活性素只从与皮肤组织有最密切关系的皮肤干细胞中提取，与其他从包含多种干细胞的杂干细胞提取的活性素不同，是更具有皮肤个性化的活性素。本发明的另一个特点是不仅从干细胞分泌物中提取，而且将皮肤干细胞破碎，从干细胞的内容物中提取活性组份，使活性组份的含量更多、更丰富。本发明的活性素可广泛用于护肤、健肤及美容化妆品。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种干细胞活性素的制作方法。
背景技术
近年来随着干细胞技术的发展，干细胞用于治疗疾病，用于美容等的应用研究已引起业界的高度关注。由于干细胞在体外培养和扩增中有自我促进（自我催化）的表现，许多研究者认为干细胞在培养过程中会分泌一些活性物质，包括生长因子、细胞因子、活性多肽、蛋白质、生长激素、微量元素等物质，促进自身的扩增及分化的子细胞的增殖。已有人从干细胞培养的残液中提干细胞分泌因子（又称干细胞分泌素），用于化妆品、保健品。对化妆品而言，主要功能是促进损伤、老化皮肤的修复；阻止皮肤细胞过快衰老，但他们的干细胞来源主要是从血液、骨髓、牙肉等组织中提取成体干细胞，也有从胚胎组织中提取成体干细胞的。多数所得的是多种干细胞的混合物，包含骨髓间充质干细胞，造血干细胞、肝脏干细胞、肌肉干细胞，虽也有表皮干细胞，但数量不多，基本没有真皮干细胞。因为表皮干细胞及真皮干细胞（合称皮肤干细胞）主要存在（潜伏）于皮肤中。这些干细胞分泌素对上述多种干细胞及其分化的子细胞起促进作用，但对皮肤干细胞及皮肤细胞起促进作用的成分并不多。用于皮肤修复和保健的干细胞应以从人皮肤提取的皮肤干细胞活性成份最有针对性，最为集中和有效。
发明内容
为解决上述现有干细胞分泌素对皮肤细胞起促进作用的成份不多，本发明的目的是提供一种皮肤干细胞活性素的制备方法，该制备方法出来的皮肤干细胞活性素对皮肤修复和保健效果较好。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种皮肤干细胞活性素的制备方法，该制备方法的步骤为：
a)收集儿童包皮等新鲜皮肤，低温保存下运回制备车间，用4℃－6℃的生理盐水清洗三次。剪成皮粒，加入10－30倍的人工体液中，用组织打碎机打碎成皮浆；
b)向皮浆加入适量胶原酶消化4～48小时，低温离心，弃去上清液。沉积底层的细胞团，用人工体液洗涤三次，每次离心，弃去上清液，用无血清培养基培养洗净的混合细胞24小时；
c)将混合细胞染色，用荧光细胞分离器分离出干细胞，主要是皮肤干细胞；
d)将皮肤干细胞用无血清培养基进行传代扩增，扩增至适当倍数后，连培养基一同移入细胞破碎机中将干细胞破碎；
e)用核酸酶和基因酶将干细胞破碎后释出的DNA和RNA分解为戊糖、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、磷酸及其盐等基础物质；
f)低温离心，收集上清液，底部沉积物用人工体液洗涤一次，离心，收集上清液，将两上清液合并，将合并的上清液以一定流速通过分子筛吸附柱，以除去残存的蛋白质及其他生物分子，再用人工体液将吸附在柱上的中、低分子洗脱出来；
g)在透析机上用超纯水透析去除洗脱液中的电解质离子，冷冻干燥得本发明产品的冻干粉。
一种优选方案，所述皮肤干细胞将扩增至适当倍数，是指扩增15－25代，即扩增到215－225倍，亦即32768～33554432倍。
一种皮肤干细胞活性素的制备方法制备出来的冻干粉的应用，所述的冻干粉，用人工体液又称生理平衡液溶解后施用，人工体液的用量为50－500ug干粉兑1ml人工体液，施用方式可直接涂擦于要保健的皮肤，也可用溶液湿润，溶解干粉的人工体液，可用保湿增稠剂增稠，保湿增稠剂为PH调至7±0.4的透明质酸，干态薄膜或面膜后覆盖于皮肤或面部。
相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：
本发明就是从人的皮肤（如小儿包皮）提皮肤干细胞，经培养和传代扩增至活性最佳期再提取活性组分的。本发明的另一特点是：本发明不是分离出干细胞后再从残液中提取活性组分的，而是将干细胞破碎，用基因酶和核酸酶将细胞核中的核糖核酸、脱氧核糖核酸（含基因）降解为中、低分子物，与培养液一起提取活性组分的。干细胞所含的活性组份，除分泌物外还应包括干细胞内的活性组分，可以认为干细胞内所含的活性组分比它分泌的多，也就是说本发明获得不只是干细胞分泌的活性组份，还包括干细胞内的活性活性组份，所以本发明的产物不叫干细胞分泌素（或分泌因子），而是叫“干细胞活性素”。本发明第三个特点是只注重于中、小分子有效成份的提取，对于不能被皮肤吸收易引发免疫排异反应的生物大分子（如蛋白质），我们用分子筛技术将它们去除。已有众多研究表明，蛋白质大分子不能透过皮肤而被吸收。所谓蛋白质化妆品可以营养皮肤，抗皮肤衰老，只是一个美丽的谎言，能通过皮肤吸收，对皮肤细胞起作用的主要是中、低分子物质。在应用上我们根据许多生长因子，离开生物体后在水或生理盐水中的异类环境中，其活性迅速衰退这一特点，专门设计了先将产品制成冻干粉。应用时，再用人工体液将其溶解，亦即让产品在人工体液中应用的，由于人工体液与体内环境相似，可有效延缓生长因子活性的衰减，使应用效果更好，这是本发明的又一创新点之一。干细胞是从人皮肤中提取的皮肤干细胞，经传代扩增至适当数量后，将皮肤干细胞破碎，将干细胞内容物中的活性物质和培养基中干细胞在生长增殖中所分泌的活性物质一并提取的。提取产物含多种对皮肤细胞活性有影响的生长因子、细胞因子、活性多肽、氨基酸、微量元素以及构成RNA和DNA的戊糖、嘌呤、嘧啶、磷酸盐等多种活性物质。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
收集新鲜切下的儿童包皮100g，干冰或液氮冷冻下保存、运回。用冰冻（4℃－6℃）生理盐水清洗三次。剪成皮粒，加入15倍体积的人工体液，用组织打碎机打成皮浆。向皮浆加入30mg胶原酶酶解消化以胶原为主体的细胞外基质，使成可溶性多肽及氨基酸；低温离心，沉淀于底部的为皮肤细胞及干细胞。弃去上清液，用人工体液洗涤底部沉积的细胞及干细胞，离心，弃去上部洗涤液。如此重复三次。将洗净的细胞及干细胞混合体移入无血清培养基中培养24小时，用Hoechst33324染液，用荧光细胞分离器分离出皮肤干细胞后，用无血清培养基对干细胞进行传代扩增培养约7天。用细胞破碎机将干细胞破碎。随即加入核酸酶及基因酶分解细胞内容物中的RNA和DNA，酶解4～24小时。离心，取上清液，弃去底部细胞碎片。用人工体液洗涤底部沉淀一次，离心，取上清液，合并两上清液。将其流过分子筛吸附柱，去除生物大分子。吸附在分子筛吸附柱上的中、低分子物，用人工体液洗脱，洗脱液移入透析器中用纯净水透析，除去人工体液的电解质，再放入冷冻干燥器中干燥，即得冻干粉。
皮肤干细胞活性素的制备方法制备出来的冻干粉的应用，所述的冻干粉，用人工体液又称生理平衡液溶解后施用，人工体液的用量为300ug干粉兑1ml人工体液，施用方式可直接涂擦于要保健的皮肤，也可用溶液湿润，溶解干粉的人工体液，可用保湿增稠剂增稠，保湿增稠剂为PH调至7.2的透明质酸，干态薄膜或面膜后覆盖于皮肤或面部
实施例2
皮肤干细胞活性素的制备方法的特征是：用人皮肤（如小儿包皮）作原料，剪成皮粒，加入10－30倍人工体液（又称生理平衡液），用组织打碎机打成皮浆，加入适量胶原酶，消化4－48小时，去除细胞外基质后，低温离心，弃去上清液，底部细胞团用人工体液洗涤三次，每次离心后弃去上清液。底部的混合细胞用无血清培养基培养24小时，得细胞团悬液。根据干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色，普通细胞可被染色的原理，应用荧光细胞分离器，分离出皮肤干细胞（包括表皮干细胞和真皮干细胞）。将所得干细胞用无血清培养基进行传代扩增培养，约培养至15～25代，即扩增至215～225（32768～33554432）倍后，用细胞破碎机将干细胞破碎，加基因酶和核酸酶分解核酸及脱氧核糖核酸和基因，再选用一定孔径的分子筛吸附法除去蛋白质等生物大分子。再用人工体液洗脱中、低分子物质。洗脱液移入透析机中用超纯水透析，去除人工体液中的电解质离子。然后冷冻干燥得冻干粉。富含人源性上皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、β-转化因子（TGF-β）、血小板衍生生长因子（P-DGF）等多种生长因子及活性多肽、氨基酸、微量元素等中、低分子活性物质。而且，还含有构成RNA和DNA的基础物质，如戊糖、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘌呤、尿嘧啶以及磷酸盐等。像构成蛋白质的20种氨基酸，可被细胞吸收合成自身的蛋白质和胶原那样，这些构成RNA和DNA的基础物质，同样可被细胞吸收合成自身的RNA和DNA，满足细胞和细胞核分裂增殖的需要。
这些来源于皮肤干细胞的中、低分子活性物质，用于护肤美容化妆品，可渗入皮肤深层激活皮肤干细胞，尤其真皮干细胞，使其分化为新生的皮肤细胞，促进皮肤修复，恢复皮肤活力。可作为护肤、美肤、健肤化妆品的主要元素，应用于护肤化妆品。
考虑到这些生长因子在一般水溶液或生理盐水的异环境中，活性衰减很快，混入一般化妆品中更易丧失活性，本发明的应用是将这些活性中、低分子物制成冻干粉，与溶剂分开封装；应用时再用溶剂将冻干粉溶解后施用。所用溶剂不是普通的高纯水或生理盐水，而是一种人工体液（又称生理平衡液）。这些活性物质存在于人工体液中，与存在于体内的环境相似，可有效延缓其活性衰减，这是本设计应用的创新之一。
冻干粉和溶剂的用量之比为50μg～500μg/ml。溶剂还可用0.3%～0.01%中性透明质酸钠或海藻酸钠增稠，以方便施用和保湿，使溶液不会干得太快，给中、低分子物更充裕的渗透皮肤的时间，施用的方式可直接涂布于皮肤表面，也可浸渍面膜，再将面膜覆盖于皮肤上，与面膜结合施用，效果更佳。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (2)
1.一种皮肤干细胞活性素的制备方法，其特征在于，该制备方法的步骤为：
a）收集儿童包皮等新鲜皮肤，低温保存下运回制备车间，用4℃－6℃的生理盐水清洗三次，剪成皮粒，加入10－30倍的人工体液中，用组织打碎机打碎成皮浆；
b）向皮浆加入适量胶原酶消化4～48小时，低温离心，弃去上清液，沉积底层的细胞团，用人工体液洗涤三次，每次离心，弃去上清液，用无血清培养基培养洗净的混合细胞24小时；
c）将混合细胞染色，用荧光细胞分离器分离出干细胞，主要是皮肤干细胞；
d）将皮肤干细胞用无血清培养基进行传代扩增，扩增至适当倍数后，连培养基一同移入细胞破碎机中将干细胞破碎；
e）用核酸酶和基因酶将干细胞破碎后释出的DNA和RNA分解为戊糖、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、磷酸及其盐等基础物质；
f）低温离心，收集上清液，底部沉积物用人工体液洗涤一次，离心，收集上清液，将两上清液合并，将合并的上清液以一定流速通过分子筛吸附柱，以除去残存的蛋白质及其他生物分子，再用人工体液将吸附在柱上的中、低分子洗脱出来；
g）在透析机上用超纯水透析去除洗脱液中的电解质离子，冷冻干燥得本发明产品的冻干粉。
2.如权利要求1 所述一种皮肤干细胞活性素的制备方法，其特征在于，所述皮肤干细胞将扩增至适当倍数，是指扩增15－25代，即扩增到215－225 倍，亦即32768～33554432倍。
3. 如权利要求1 和2 任意一项权利要求所述的一种皮肤干细胞活性素的制备方法制备出来的冻干粉的应用，其特征在于，所述的冻干粉，用人工体液又称生理平衡液溶解后施用，人工体液的用量为50 － 500ug 干粉兑1ml 人工体液，施用方式可直接涂擦于要保健的皮肤，也可用溶液湿润，溶解干粉的人工体液，可用保湿增稠剂增稠，保湿增稠剂为PH 调至7±0.4 的透明质酸，干态薄膜或面膜后覆盖于皮肤或面部。
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