CN102895165A - 面膜复合活性物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及日用品的面膜工艺，具体为哺乳动物细胞原代培养余液在制备面膜活性物质中的应用；本发明以国内外以细胞培养液余液为生长因子类物质的来源，价廉物美，余液再生利用，安全可靠；细胞培养液余液中所含的酶类，在常温下对丝素蛋白进行有效的降解，得到小分子的丝素蛋白，操作简便，安全；其次，蚕丝中的丝胶具有免疫原性，会引发过敏反应，后部丝腺来源的丝素蛋白完全不含有丝胶，使得过敏反应的可能大大降低；蚕丝面膜的成膜性是制备的难点，本发明中丝素蛋白在多次的高温、搅拌及干燥过程中，蛋白分子的silk I构象逐渐向silk II转变，结构稳定，具有良好的机械性能。

Description

面膜复合活性物及其制备方法

技术领域

本发明属于日用品领域，特别涉及面膜的制备工艺。

背景技术

面膜是人们日常生活中最常使用的化妆品之一。对人体面部皮肤起到补充水分是目前的面膜产品最有保障的功能。然而人们更期待解决的问题是面膜能够促进人体面部皮肤的新陈代谢，起到美容作用。为此，需要研制一种具有皮肤营养作用的面膜，其中的主要活性物质是面膜能否达到预期效果的关键。

目前，面膜制备工艺主要存在如下问题：1)面部皮肤的感染：人体面部皮肤在诸如去“死皮”，挤“暗疮”等日常护理操作，都有可能导致表皮结构乃至腺体结构不同程度的物理损伤，并导致不同程度的炎症反应。所以消炎和预防感染是面临的首要问题。2)面部皮肤的吸收：面部皮肤具有一定的吸收功能，但是仅限于小分子物质，对于大分子量的蛋白类物质没有吸收作用。特别对于蛋白质的降解产物(如氨基酸，小分子多肽等分子量较小的物质)具有一定的吸收作用。所以，面膜功效成分采用非小分子物质将导致吸收困难。3)生物活性物质的价格问题：生物活性物质主要是指生长因子类物质。生长因子类物质的促组织修复和增强细胞活力的功能是不容置疑的，在美容护肤产品中添加生长因子类物质无疑会起到很好的美容护肤效果。但是，此类物质极其昂贵，每毫克干粉的平均售价为近万元人民币左右。另外，需要指出的是：人体面部皮肤美容保健的实质是促进新的表皮细胞迅速有序地替代坏死表皮细胞，以促进表皮更新的过程。这一过程的实现，需要多种生长因子类物质的协同作用，这些物质有已知的，也有未知的。而现有面膜制剂片面地强调单因素的作用，忽略了多种生长因子的协同作用，但过多的生长因子又可能增加皮肤过敏的风险。

细胞培养液余液是指细胞原代培养过程中更换下来的培养液。本发明中特指哺乳动物的细胞培养余液；原代培养是泛指非细胞株或细胞系的细胞培养。在细胞培养过程中，培养液主要由两个部分构成。一是基础培养基，如DMEM等，主要为细胞的生长提供能量来源如葡萄糖、适宜的pH值及渗透压、以及其他无机条件；二是血清，如胎牛血清、类胎牛血清、小牛血清等；它们除了提供细胞生长的有机营养外，还提供指导细胞生长的生长因子类物质。含不同浓度血清的基础培养基被称为完全培养基。在细胞培养过程中，由于物质(主要是葡萄糖)的消耗，培养基中的指示剂会由红色变为透明的浅黄色，此时，则意味着必须更换新的完全培养基。在细胞的培养中，除了人工制备的完全培养基成分外，被培养的细胞会根据一些目前人们还未彻底了解的一些原理和信号通路分泌一些特定浓度的生长因子类物质。这些物质的分泌种类及其分泌量以及浓度控制的双向反馈机制，目前，人们还没有完全掌握。但是，可以确定的是，在细胞培养过程中，细胞会向培养基中分泌多种酶类以及生长因子类物质，这些物质以适宜的生理浓度存在，对细胞的生长和类似在体条件下功能的表达起协同调节作用。这些即将被倾倒的培养基与新鲜完全培养基相比，有机成分，如葡萄糖、蛋白质等被大量消耗，但是却富集了很多种类的酶类及生长因子类物质，所以，它们是提取生长因子类物质的最佳原料。正是由于这一原因，国外有报道称，成功利用原代培养牛血管内皮细胞培养液余液，添加到原代培养的人包皮来源微血管内皮细胞的培养基中，成功实现了体外诱导微血管内皮细胞形成微血管。但是，目前还没有关于细胞培养余液制备面膜活性成分的研究。

发明内容

本发明的目的之一在于提供绌胞培养余液的一种新应用，该应用以细胞培养余液中含有的多种生长因子类物质作为面膜的活性物质，为面膜制备提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

哺乳动物细胞的原代培养余液在制备面膜活性物质中的应用。哺乳动物细胞原代培养余液具体是指哺乳动物细胞原代培养过程中更换下来的培养液，这里所指的“原代培养”是泛指非细胞株或细胞系的细胞培养；哺乳动物细胞原代培养余液中含有多种已知和未知的生长因子类物质，这些物质都以生理浓度存在，与市售的生长因子类物质昂贵的价格相比，价廉物美。

进一步，所述应用为哺乳动物细胞原代培养余液与丝素蛋白联合在制备面膜活性物质中的应用。优选的，所述丝素蛋白为家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白。所述哺乳动物细胞包括上皮细胞、间充质细胞、神经外胚层细胞、造血细胞、干细胞和生殖腺细胞中的任一种或多种。通常制作蚕丝面膜或其他蚕丝生物材料成分之一的丝素蛋白都是再生丝素，即将蚕丝经过物理或化学的方法去除丝胶后得到的丝素蛋白。但实验证明，目前还没有能完全去除丝胶的方法，再生丝素中都存在有丝胶的残留，这就使得丝素蛋白存在生物安全性的隐患。有实验证明，丝胶会引发Type I型过敏反应。同时在丝素蛋白的二级结构中，由于丝胶的存在使得silk I构象向silk II转变的难度加大。稳定性和力学性质都受到不同程度的影响。利用后部丝腺来源的丝素蛋白制备面膜材料，不但完全没有丝胶，而且力学性质容易控制，安全性高。

本发明的目的之二在于提供一种面膜活性物质的原料物，其可以通过相应的工艺制备得到面膜活性物质。本发明还提供了利用所述原料物制备膜活性物质的方法，该方法操作简单，适用于工业化生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

面膜复合活性物的原料物，由哺乳动物绌胞的原代培养余液和丝素蛋白组成，所述哺乳动物细胞包括上皮细胞、间充质细胞、神经外胚层细胞、造血细胞、干细胞和生殖腺细胞中的任一种或多种。所述丝素蛋白为家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白，所述面膜复合活性物中的所述丝素蛋白的质量体积百分浓度为50-90％。

优选的，面膜复合活性物的原料物，由所述原代培养余液和丝素蛋白组成，所述丝素蛋白来源于家蚕后部丝腺，所述面膜复合活性物中的所述丝素蛋白的质量体积百分浓度为60-80％。

由所述的原料物制备面膜活性物质的制备方法，具体包括以下步骤：

1)将所述哺乳动物细胞在哺乳动物细胞原代培养基中培养不少于8小时，得哺乳动物细胞的原代培养余液；将丝素蛋白置于所述哺乳动物细胞原代培养余液中降解，37±2℃孵育不少于12小时，优选24小时，得丝素蛋白降解液(含丝素蛋白的多肽小分子)，所述丝素蛋白降解液中丝素蛋白的用量(以质量体积百分比计)为60-80％；

2)冷冻干燥处理，即得面膜活性物质。

进一步，步骤1)中，所述哺乳动物细胞在培养基中培养12-24小时，所述哺乳动物细胞原代培养基为MEM、DMEM、F12、M199、L15、RPMI1640、McCoys5A、Fischer和CMRL1066中任一种。

进一步，步骤1)中，丝素蛋白的获得的具体步骤为：将家蚕后部丝腺放入蒸馏水中，在3-6℃条件下摇床处理48-80小时，并灭菌，得丝素蛋白。

本发明的目的之三在于提供制备面膜的方法，所述面膜活性物质价格便宜，含有多种生长因子成份；其制备面膜的方法简单，适用于大众使用。另外，还提供降解丝素蛋白的方法，该方法效率高，为制备面膜提供了有效的中间工艺。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

应用所述的面膜活性物质制备面膜的方法，将所述面膜活性物质与水介质按照1∶5-25的重量比充分混合，或将所述面膜活性物质与面膜基质按照1：9-10的重量比充分混合，得面膜。

降解丝素蛋白的方法：将丝素蛋白置于哺乳动物细胞的原代培养余液中，37±2℃孵育不少于12小时，优选为24小时，得丝素蛋白降解液。丝素蛋白以干重计和原代培养余液的用量范围为：每50mL原代培养余液中置入2-5g丝素蛋白，所述丝素蛋白来源于家蚕后部丝腺。丝素蛋白降解液中添加链霉素和青霉素(各200个活性单位/ml)。

本发明的有益效果在于：在本发明中，首次在国内外以绌胞培养液余液为生长因子类物质的来源，价廉物美，余液再生利用，安全可靠。也是首次采用细胞培养液余液中所含的酶类，在常温下对丝素蛋白进行有效的降解，得到小分子的丝素蛋白，操作简便，安全。

其次，蚕丝中的丝胶具有免疫原性，会引发过敏反应，后部丝腺来源的丝素蛋白完全不含有丝胶，使得过敏反应的可能大大降低。

蚕丝面膜的成膜性是制备的难点，本发明中丝素蛋白在多次的高温、搅拌及干燥过程中，蛋白分子的silk I构象逐渐向silk II转变，结构稳定，具有良好的机械性能。

更多的有益效果，详见具体实施方式。

具体实施方式

哺乳动物细胞的原代培养余液：本发明中所指的“细胞培养液余液”是指哺乳动物细胞的原代培养过程中，更换下来的培养液。换液包括全量换液和半量换液。换液的时机选择：1)观察细胞生长旺盛，代谢产酸性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄；2)视绌胞的状态进行换液。这里所指的“原代培养”是泛指非细胞株或绌胞系的细胞培养。

哺乳动物细胞的原代培养基：例如RPMI-1640、DMEM、McCoys5A、M199、F12等。更多培养基参见司徒镇强主编的《细胞培养为一书。

实施例1面膜制备

一细胞培养液余液的收集

收集大鼠间充质干细胞原代培养过程中，更换新鲜完全培养基时所更换下来的未经微生物污染的培养液，无菌操作除去细胞碎片，置于经灭菌处理的容器中，低温(1-4℃)密封保存备用。

二丝素蛋白获得

家蚕5龄期是后部丝腺细胞大量合成并分泌蚕丝主要成分丝素蛋白的时期。解剖得到5龄家蚕后部丝腺，放入蒸馏水中，4℃、72小时摇床处理，开将丝素蛋白溶液经湿热灭菌处理。经检测，本方法获得的丝素蛋白中不含丝胶蛋白。

三丝素蛋白的降解

称取2g经湿热灭菌处理的家蚕后部丝腺来源丝素蛋白，置于50mL上述绌胞培养液余液中，37℃孵育24小时，即得丝素蛋白降解液，在孵育中或孵育后可添加链霉素和青霉素各200个活性单位/mL。

四面膜活性成分的制备

将上述丝素蛋白降解液置于摇床，40℃处理24小时，所述丝素蛋白降解液中丝素蛋白的用量(以质量体积百分比计)为60％后置于培养皿中，滤去没有完全水解的固体物质及杂质，滤液冷冻干燥处理，即得面膜活性物质。

五包装

将制备好的活性物质，抽真空避光密封包装，无菌操作。

六使用方法及添加量

直接与水混合：打开密封包装，将活性物质取出用水润湿后直接敷于面部，水与活性物质干品的重量比为10-20∶1。

七保存

本活性物质需低温(1-4℃)密封避光保存。保质期为3个月。

实施例2面膜制备

一细胞培养液余液的收集

收集大鼠成纤维细胞原代培养过程中更换新鲜完全培养基时所更换下来的未经微生物污染的培养液，无菌操作除去细胞碎片，置于经灭菌处理的容器中，低温(1-4℃)密封保存备用。

二丝素蛋白获得

解剖得到5龄家蚕后部丝腺，放入蒸馏水中，4℃、72小时摇床处理，并将丝素蛋白溶液经湿热灭菌处理。

三丝素蛋白的降解

称取2g经湿热灭菌处理的家蚕后部丝腺来源丝素蛋白，置于50mL上述细胞培养液余液中，37℃孵育24小时，即得丝素蛋白降解液，在孵育中或孵育后添加链霉素和青霉素各200个活性单位/ml。经检测，本方法获得的丝素蛋白中不含丝胶蛋白。

四面膜活性成分的制备

将上述丝素蛋白降解液置于摇床，60℃处理24h，，所述丝素蛋白降解液中丝素蛋白的用量(以质量体积百分比计)为80％后置于培养皿中，滤去没有完全水解的固体物质及杂质，滤液冷冻干燥处理，即得面膜活性物质。

五包装

将制备好的活性物质，抽真空避光密封包装，无菌操作。

六使用方法及添加量

与其他面膜基质材料混合：本活性物质应用在其他面膜基质材料中的比例范围为10％-90％。

七保存

本活性物质需低温(1-4℃)密封避光保存。保质期为3个月。

实施例3面膜复合活性物的制备

分别收集大鼠和兔的上皮细胞、神经外胚层细胞、造血细胞、干细胞和生殖腺细胞在原代培养过程中更换新鲜完全培养基时所更换下来的未经微生物污染的培养液，无菌操作除去细胞碎片，置于经灭菌处理的容器中，低温(1-4℃)密封保存备用。

并分别按照实施例1或2的方法制备面膜活性物质。

实施例4降解丝素蛋白的方法

将丝素蛋白置于兔上皮细胞的原代培养余液中，37±2℃孵育12小时，得丝素蛋白降解液。

将丝素蛋白置于兔神经外胚层细胞的原代培养余液中，37±2℃孵育24小时，得丝素蛋白降解液。

实施例5面膜的使用效果评定

睡前用实施例1(水与活性物质干品的重量比为18∶1)的面膜敷涂面部，半小时后用清水洗去。

一补水保湿

用皮肤水分测试笔分别对5人的面部肌肤的含水量进行了测试，测试部位是女性冬季最容易出现缺水干燥情况的脸颊、鼻翼、眼角和额头。首先将脸洗净。

1李某，29岁，女，属于干性皮肤。使用面膜前后，测试结果如下。

使用前：脸颊29％；鼻翼18％；眼角28％；额头22％。

使用后：脸颊72％；鼻翼30％；眼角67％；额头65％。

2陈某，30岁，男，属于干性皮肤。使用面膜前后，测试结果如下。

使用前：脸颊23％；鼻翼27％；眼角46％；额头20％。

使用后：脸颊81％；鼻翼74％；眼角80％；额头77％。

3周某，32岁，女，属中性皮肤。使用面膜前后，测试结果如下。

使用前：脸颊50％；鼻翼30％；眼角36％；额头38％。

使用后：脸颊81％；鼻翼68％；眼角81％；额头88％。

4程某，21，女，属于中性皮肤。使用面膜前后，测试结果如下。

使用前：脸颊43％；鼻翼33％；眼角51％；额头39％。

使用后：脸颊64％；鼻翼58％；眼角68％；额头64％。

5黎某，29岁，女，皮肤属于油性皮肤。使用面膜前后，测试结果如下。

使用前：脸颊32％；鼻翼16％；眼角32％；额头22％。

使用后：脸颊72％；鼻翼55％；眼角49％；额头67％。

补水效果固然重要，但补水后依然要面对冬季室内外环境干燥和风吹的影响，没有优良的锁水效果，皮肤水分很快就会枯竭。

为了模拟干燥的冬季天气，我们使用了1600W功率的电吹风机，对5名测试人员的面部测试区进行3分钟的风吹烘干，而后再用皮肤水分测试笔对其烘干后的面部肌肤，进行测试。

李某，脸颊68％；鼻翼28％；眼角63％；额头62％。

陈某，脸颊79％；鼻翼70％；眼角75％；额头75％。

周某，脸颊76％；鼻翼63％；眼角75％；额头81％。

程某，脸颊59％；鼻翼49％；眼角61％；额头60％。

黎某，脸颊63％；鼻翼49％；眼角40％；额头62％。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.哺乳动物细胞的原代培养余液在制备面膜活性物质中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为所述原代培养余液与丝素蛋白联合在制备面膜活性物质中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括上皮细胞、间充质细胞、神经外胚层细胞、造血细胞、干细胞和生殖腺细胞中的任一种或多种。

4.面膜复合活性物的原料物，其特征在于，由哺乳动物细胞的原代培养余液和丝素蛋白组成，所述哺乳动物细胞包括上皮细胞、间充质细胞、神经外胚层细胞、造血细胞、干细胞和生殖腺细胞中的任一种或多种。

5.根据权利要求4所述的原料物，其特征在于，由所述原代培养余液和丝素蛋白组成，所述丝素蛋白来源于家蚕后部丝腺，所述面膜复合活性物中的所述丝素蛋白的质量体积百分含量为60-80％。

6.由权利要求4所述的原料物制备面膜活性物质的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)将所述哺乳动物细胞在哺乳动物细胞原代培养基中培养不少于8小时，得哺乳动物细胞的原代培养余液；将丝素蛋白置于所述哺乳动物细胞原代培养余液中降解，得丝素蛋白降解液，所述丝素蛋白降解液中丝素蛋白的用量以质量体积百分比计为60-80％；

2)冷冻干燥处理，即得面膜活性物质。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述哺乳动物细胞在培养基中培养12-24小时，所述哺乳动物细胞原代培养基为MEM、DMEM、F12、M199、L15、RPMI1640、McCoys5A、Fischer和CMRL1066。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，丝素蛋白的获得的具体步骤为：将家蚕后部丝腺放入蒸馏水中，在3-6℃条件下摇床处理48-80小时，开灭菌，得丝素蛋白。

9.应用面膜活性物质制备面膜的方法，其特征在于：将所述面膜活性物质与水介质按照1∶5-25的重量比充分混合，或将所述面膜活性物质与面膜基质按照1∶9-10的重量比充分混合，得面膜。

10.降解丝素蛋白的方法，其特征在于：将丝素蛋白置于哺乳动物细胞的原代培养余液中，37±2℃孵育不少于12小时，得丝素蛋白降解液。