CN103845273A - 一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用，制备方法为将蚯蚓样品液利用自有酶或加入蛋白酶水解，再将水解液采用膜过滤和膜截留，冷冻干燥得到地龙肽，得到的地龙肽应用在抗皮肤老化化妆品或保健品中。通过上述方式，本发明的方法绿色、简单，制备得到的地龙肽亲和性强、安全性高，具有明显的抗氧化活性，能有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，对细胞基质胶原蛋白的分泌合成有着显著的促进作用，具有明显的抗皮肤老化作用，可应用于抗皮肤老化化妆品和保健品的开发。

Description

一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用。

背景技术

肽是一类涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质，参与调控人体各种复杂的生理过程。肽具有活性高、亲和性强、安全性高等特点，且肽分子又是纳米级别的，很容易被人体的肠道吸收，或通过皮肤表层直接进入深层皮肤，快速被人体吸收发挥作用。现代药理学研究表明，一些活性肽不仅具有抗氧化活性，还可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，特别是可以通过增加皮肤成纤维细胞的活性，有效促进细胞基质尤其是胶原蛋白等基质的合成，发挥出显著的抗皮肤老化作用。因此，生物活性肽为抗皮肤老化化妆品和保健品行业的发展提供了全新的方向和思路，在抗皮肤老化产品中的应用也越来越普遍。

蚯蚓(Earthworm)是环节动物门寡毛纲类动物，是我国传统的一味中药，也称为地龙。蚯蚓具有广泛的药理作用，效果显著，如溶栓和抗栓、抗肿瘤、平喘、促进皮肤修复、抗菌等作用。蚯蚓体中富含蛋白质，蛋白质总量约占干重的45.90％～68.11％，包括蚓激酶、脂类蛋白、钙调素结合蛋白、蚯蚓新钙结合蛋白和蚓激酶等。目前，蚯蚓的应用主要包括传统中药煎服或制成蚯蚓粉直接服用的形式入药，以及生产制备天然的具有溶栓、抗栓和抗肿瘤等作用的大分子蛋白提取物。此外，蚯蚓还是一种良好的生产肽类物质的原料，如具有防治高血压和抗菌等方面应用的蚯蚓肽制品。但还未见报道采用蚯蚓制备活性肽应用于抗皮肤老化产品的开发，而且采用蚯蚓作为原料开发制备多肽的过程中，仍存在制备分离过程繁杂，制备目标肽分子量过大以及分布范围过广，针对性不强等问题。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用，所述地龙肽具有明显的抗皮肤老化作用，能应用于抗皮肤老化化妆品和保健品中。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种抗皮肤老化的地龙肽，所述地龙肽为分子量为300-3000道尔顿的地龙肽。

提供一种抗皮肤老化的地龙肽的制备方法，包括步骤为：

(1)将干净鲜蚯蚓搅碎得到蚯蚓样品液，或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯蚓样品液；

(2)所述蚯蚓样品液利用所述蚯蚓样品液中含有的酶或加入的蛋白酶水解，得到富含地龙肽的水解液；

(3)将所述水解液经截留分子量小于等于3000道尔顿的超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300道尔顿的纳滤膜进行截留，得到的截留液冷冻干燥，得到地龙肽。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蝈、湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、异毛环毛蚓、白颈环毛蚓、背暗异唇蚓或赤子爱胜蚓中的一种或多种。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述干净蚯蚓是将新鲜的蚯蚓洗净，置于水中1-48小时得到，所述捣碎的蚯蚓干品与水的比例为1g∶0-20ml，所述浸泡时间为0-48h。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述蚯蚓样品液与所述水的体积比为1∶1-10，所述水解的条件为pH值为2-10、温度为20-70℃、水解时间为0.5-10h。

提供一种抗皮肤老化的地龙肽在抗皮肤老化化妆品或保健品中的用途。

本发明的有益效果是：本发明的抗皮肤老化的地龙肽及其制备方法和应用，该方法绿色、简单，制备得到的地龙肽亲和性强、安全性高，具有明显的抗氧化活性，能有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，对细胞基质胶原蛋白的分泌合成有着显著的促进作用，具有明显的抗皮肤老化作用，可应用于抗皮肤老化化妆品和保健品的开发。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：

提供一种地龙肽的制备方法，包括步骤为：

(1)将新鲜的蚯蚓洗净，置于去离子水或纯净水中24h，使蚯蚓排尽体内的食物残渣，再用高速捣碎机将洗净的蚯蚓搅碎，蚯蚓搅碎液即为鲜蚯蚓样品液；其中所述新鲜蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓(P.aspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蚓(P.vulgaris Chen)、威廉环毛蚓(P.guillelmi(Michaelsen))、栉盲环毛蝈(P.pectinifera(Michaelsen))、湖北环毛蚓(P.hupeiensis)、直隶环毛蚓(P.tschiliensis)、异毛环毛蚓(P.diffringens)、白颈环毛蚓(P.californica)、背暗异唇蚓(Allolobophora caliginosa trapezoides)或赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)等中的一种或多种。

(2)向蚯蚓样品液中加入2倍体积的去离子水，利用自身酶进行水解，酶解条件为：pH值为6.5、温度为40℃、水解3h，即得富含地龙肽的水解液。

(3)将水解液经截留分子量为3000道尔顿超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300左右的纳滤膜进行截留，截留液冷冻干燥，即为地龙肽。

实施例二

提供一种地龙肽的制备方法，包括步骤为：

(1)将新鲜的蚯蚓洗净，置于去离子水或纯净水中36h，使蚯蚓排尽体内的食物残渣，再用高速捣碎机将洗净的蚯蚓搅碎，蚯蚓搅碎液即为鲜蚯蚓样品液；

将蚯蚓干品进行捣碎，然后用5倍质量体积去离子水或纯净水浸泡，浸泡液即为蚯蚓样品液；

(2)鲜蚯蚓样品液和干蚯蚓(地龙)样品液按照体积比2∶1进行混合，利用自身酶进行水解，酶解条件为：pH值为6.5、温度为45℃、水解6h，即得富含地龙肽的水解液。

(3)水解液经截留分子量为3000道尔顿超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300左右的纳滤膜进行截留，截留液冷冻干燥，即为地龙肽。

实施例三：

提供一种地龙肽的制备方法，包括步骤为：

(1)将蚯蚓干品进行捣碎，然后用5倍质量体积去离子水或纯净水浸泡，浸泡液即为蚯蚓样品液；

(2)干蚯蚓样品液50ml，添加0.5mg酶活力单位为12000U／mg的中性蛋白酶，进行酶解，酶解条件为：pH值为7.0、温度为40℃、水解2h，即得富含地龙肽的水解液。

(3)水解液经截留分子量为3000道尔顿超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300左右的纳滤膜进行截留，截留液冷冻干燥，即为地龙肽。

实施例四：

地龙肽的体外抗氧化活性实验：

(1)样品溶液配制：采用去离子水，将地龙肽配制成不同浓度的样品液。

(2)DPPH溶液的配制：将1，1-二苯基-2-三硝基苯肼即DPPH溶于无水乙醇中，配制成浓度为1mmol／L的母液，于4℃中避光存放，使用前稀释为100μmol／L的DPPH无水乙醇溶液。

(3)分别取2mL样品液及浓度为100μmol／L的DPPH溶液1mL，先后加入同一试管中，摇匀，室温下静置30分钟，于517nm波长下测定样品吸光度。

清除率：k％=[1-(Ai-Aj)／Ac]×100％，其中Ai为1ml DPPH溶液和2ml样品液的吸光度，Aj为1ml溶剂和2ml样品液的吸光度，Ac为1ml DPPH溶液和2ml溶剂的吸光度。

(4)实验结果：当地龙肽浓度为1mg／ml时，对DPPH自由基的清除率为22.69％，当浓度提高至5mg／ml时，清除率提高至48.16％，浓度为10mg／ml时，清除率达到了92.2％。

实施例五：

地龙肽的体外抗氧化活性实验：

(1)样品溶液配制：采用去离子水，将地龙肽配制成不同浓度的样品液。

(2)在试管中加入0.05mmol／L且pH值为8.2的Tris-HCl4mL，25℃下水浴预热20min，依次加入1mmol／L邻苯三酚0.5mL、待测样品0.5mL，25℃下反应4min，测定325nm的吸光度。各管加入的试剂如下表所示：

	药物组	对照组	标准组	空白组
					Tris-HCl(mL)	4	4	4	4
邻苯三酚(mL)	0.5	0	0.5	0
					样品液(mL)	0.5	0.5	0	0
H2O(mL)	0	0.5	0.5	1

清除率：k(％)=[1-(A药物-A对照)／(A标准-A空白)]*100％

(3)实验结果：地龙肽的浓度为2mg／ml时，对超氧阴离子的的清除率为34.31％，当浓度提高至20mg／ml时，清除率提高至96.23％。

实施例六：

地龙肽促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖实验：

(1)正常的人皮肤成纤维细胞分别以适宜的密度接种于细胞培养板，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，然后用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1X10⁵个接种于96孔板或细胞培养皿(30mm)中，加入含10％胎牛血清和高糖DMEM培养基，同步化处理各组细胞，于5％CO₂，37℃温箱中培养。

实验分未经处理的空白对照组和添加纯净水溶解的0.4mg／ml地龙肽溶液的药物组，分别孵育3～5天后，每孔加入适量MTT，继续培养4h，弃去上清。每孔加入DMSO，振摇，酶标仪检测各孔吸光度值。同样培养3～5天后的各组细胞，分别用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，以体积分数为80％的乙醇固定。PBS清洗细胞3次，分别加入4℃保存的含Triton的碘化丙啶(PI)，振荡成单细胞悬液，避光室温静置，用流式细胞仪检测，重复实验3次。

(2)实验结果：未添加地龙肽对照组的OD检测值为0.35±0.009，添加地龙肽实验组的OD检测值为0.64±0.013。经流式细胞仪检测，未添加地龙肽的结果为8.6，加药后为15.4。细胞流式仪检测结果和MTT检测结果都显示0.4mg／ml浓度的地龙肽能显著促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖。

实施例七：

地龙肽促进人皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白实验：

(1)按照实施例六中细胞培养的方法进行试验，实验分未经处理的空白对照组和添加纯净水溶解的0.4mg／ml地龙肽溶液的药物组，分别孵育3～5天。培养结束后，0.5ml细胞培养液离心，上清液采用人I型前胶原羧基端肽(PICP)ELISA试剂盒，根据说明书进行操作，检测I型前胶原蛋白(Type I procollagen)的分泌情况，试验平行进行三次。

(2)实验结果：基于定量结果，以空白对照组培养液中I型前胶原蛋白的含量定义为100％，添加0.4mg/ml地龙肽溶液进行细胞培养时，I型前胶原蛋白的含量提高至152.41±4.21％。与空白对照组相比，添加地龙肽实验组中的I型前胶原蛋白含量明显增加。

实施例八：

地龙肽在抗皮肤老化化妆品中的应用：

化妆品配方一：以质量百分比计，(A)辛酸／癸酸甘油三酯7.00％、环聚二甲基硅氧烷5.00％、鲸蜡硬脂醇5.00％、PEG-100硬脂酸酯3.80％、甘油硬脂酸酯2.50％、牛油果树(BUTYROSPERMUM PARKII)果脂3.50％、羟苯丙酯0.10％，(B)硬脂酰谷氨酸钠0.20％、去离子水余量、羟苯甲酯0.20％，(C)黄原胶0.50％、甘油6.00％，(D)双(羟甲基)咪唑烷基脲0.30％、羟苯甲酯0.20％、羟苯丙酯0.10％、地龙肽1.00％。

制备方法：分别将A、B相加热到80-85°使其完全溶解，然后A相加入B相进行均质，同时将混合均匀的C相加入，均质5-10min，均质结束后在水浴锅中边搅拌边保温30min，然后降温至50°以下时将D相加入，其中用少量灭菌去离子水溶解地龙肽成溶液再添加，搅拌均匀，冷却至室温即得。

化妆品配方二：以质量百分比计，磷酸氢二钾0.18％、磷酸二氢钾0.13％、甘油2.00％、1，3-丁二醇1.50％、双PEG-18甲基聚醚硅氧烷3.00％、氢化蓖麻油1.00％、苯氧乙醇0.30％、甲基异噻唑啉酮0.10％、地龙肽0.60％、灭菌去离子水余量。

制备方法：依次将上述原料加入到灭菌去离子水中，边加入边搅拌，直至透明即得。

化妆品配方三：以质量百分比计，(A)聚氧乙烯(21)硬脂醇醚1.20％、PEG-100硬脂酸酯1.50％、甘油硬脂酸酯1.00％、异硬脂酸异丙酯3.50％、辛酸／癸酸甘油三酯5.00％、鲸蜡酯2.00％、十六醇1.00％，(B)1，3-丁二醇3.00％、丙烯酸二甲基牛磺酸铵／vp共聚物0.50％，(C)聚二甲基硅氧烷交联聚合物1.00％、聚二甲基硅氧烷3.00％，(D)丙烯酰胺／丙烯酰基二甲基牛磺酸钠聚合物／异十六烷／聚山梨醇酯800.90％，(D)甘油3.00％、去离子水余量，(F)柠檬酸0.01％、柠檬酸钠0.05％、氢氧化钠0.04％，(G)苯氧乙醇0.80％、地龙肽0.90％。

制备方法：将A相和E相分别加热到80-90°，然后把A加入B中进行均质，同时将B、C和D加入，均质5-10min，均质完成后边搅拌边保温30min，降温至50°时分别将F相配制的水溶液和G相配制的水溶液加入，搅拌均匀，降温至室温即得。

化妆品配方四：以质量百分比计，(A)EDTA-2Na0.05％、聚乙二醇-4001.20％、去离子水余量、甘油5.00％，(B)1，3-丁二醇6.00％、聚丙烯酸钠0.80％、卡波姆0.60％，(C)KOH0.20％，(D)苯氧乙醇0.70％、地龙肽0.50％。

制备方法：将A相加热到85-90°，然后将混合均匀的B相加入并进行均质5-10min，降温，当温度为60°，将C相配制的水溶液加入并搅拌均匀，降温至50°以下时，加入D相水溶液，搅拌均匀，冷却至室温即得。

实施例九：

地龙肽在抗老化保健品中的应用：

胶囊配方：以质量百分比计，微晶纤维素79.98％、地龙肽20.00％、磷脂0.02％。

制备方法：上述各物质分别进行充分碾磨，过100目筛网，然后按照比例添加，进行充分混匀，灌装胶囊即得。

口服液配方：以质量百分比计，地龙肽1.20％、果汁粉3.00％、柠檬酸1.00％、三氯蔗糖0.05％、香精0.02％、去离子水余量。

制备方法：上述各物质按照比例依次加入去离子水中，搅拌均匀后，经300目筛网过滤后即得。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种抗皮肤老化的地龙肽，其特征在于，所述地龙肽为分子量为300-3000道尔顿的地龙肽。

2.根据权利要求1所述的抗皮肤老化的地龙肽的制备方法，其特征在于，包括步骤为：

(1)将干净鲜蚯蚓搅碎得到蚯蚓样品液，或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯蚓样品液；

(2)所述蚯蚓样品液利用所述蚯蚓样品液中含有的酶或加入的蛋白酶水解，得到富含地龙肽的水解液；

(3)将所述水解液经截留分子量小于等于3000道尔顿的超滤膜过滤，滤液再采用分子量为300道尔顿的纳滤膜进行截留，得到的截留液冷冻干燥，得到地龙肽。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述蚯蚓为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓、栉盲环毛蝈、湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、异毛环毛蚓、白颈环毛蚓、背暗异唇蚓或赤子爱胜蚓中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述干净蚯蚓是将新鲜的蚯蚓洗净，置于水中1-48小时得到，所述捣碎的蚯蚓干品与水的比例为1g∶0-20ml，所述浸泡时间为0-48h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述蚯蚓样品液与所述水的体积比为1∶1-10，所述水解的条件为pH值为2-10、温度为20-70℃、水解时间为0.5-10h。

6.根据权利要求1所述的抗皮肤老化的地龙肽，其特征在于，所述地龙肽在抗皮肤老化化妆品或保健品中的用途。