CN102920738A

CN102920738A - 一种活性地龙蛋白的生产方法

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Publication number: CN102920738A
Application number: CN2012105110028A
Authority: CN
Inventors: 周维官
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN102920738B

Abstract

本发明公开了一种活性地龙蛋白的生产方法，它包括对活体地龙催吐、地龙自溶、磨浆、过滤和离心、膜分离和干燥得到活性地龙蛋白产品。活性地龙蛋白具有溶解血栓、改善全身微循环、软化血管，稳定斑块、建立侧枝循环，改善心脑供血供氧、双向调节血压、降低血粘等功效；本发明的方法具有工艺简单、提取率高、生产成本低、产品纯度高，可为食品、保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料。

Description

一种活性地龙蛋白的生产方法

技术领域

本发明涉及一种从动物体中提取有效活性成分的生产方法，特别是以地龙为原料生产活性地龙蛋白的方法。

背景技术

地龙(拉丁文名：Pheretima)，又称蚯蚓，它是我国重要的中药材之一。最早的中药学专著《神农本草经》中收载的67种动物药中就有蚯蚓。李时珍在《本草纲目》称之为具有通经活络、活血化瘀、防治心脑血管疾病等作用，在《本草纲目》虫部中有40多种药用作用。

活性地龙蛋白含有胶原酶、纤溶酶和蚓激酶等多种成分，其分子量在1000～10000道尔顿，属于短链小分子物质，它具有如下特性：

1、溶解新鲜及陈旧性血栓：血栓是血管中的“定时炸弹”，堵在脑部导致脑梗，堵在心脏，导致心梗、心绞痛。活性地龙蛋白富含纤溶酶、纤溶酶原激活物和胶原酶，不仅能溶解新鲜血栓，还能溶解陈旧性血栓，对心脑血管病的预防，中风后遗症的康复意义重大。

2、改善全身微循环：活性地龙蛋白能溶解微血管内的微栓，让硬化的微血管恢复弹性，从而解除微血管的堵塞、扭曲变形情况，改善微循环。

3、软化血管，稳定斑块：活性地龙蛋白所含的纤维蛋白溶解酶和其它活性物质，能溶解粥样硬化管壁上纤维蛋白网状物，促进血管内皮细胞DNA的合成，使损伤的血管壁得以修复，恢复血管弹性，在一定程度上改变和阻止动脉硬化的病程。

4、建立侧枝循环，改善心脑供血供氧：活性地龙蛋白是地龙中的再生物质，能激活血管内皮细胞的分化特性，促进微血管再生，为病灶区的心脑组织开辟新的血液通路，建立侧枝循环。

5、双向调节血压：通过恢复血管弹性、溶解血栓、改善微循环，即可降低血流外周阻力，从而具有双向的稳定血压的作用。

6、降低血粘：活性地龙蛋白可减少血红细胞与白细胞的粘附，从而降低血液粘稠度。

由于上述这些优点，目前活性地龙蛋白主要用于防治脑血管和心脏等疾病以及高血压、高血脂及血脂异常、糖尿病等疾病。

对现有技术中活性地龙蛋白的生产方法检索如下：

1、中国专利：申请号 200710013786.0，发明名称：具有降血压作用的地龙蛋白质及其制备方法。该发明是将地龙的40℃-100℃的热水浸取液经过凝胶过滤、层析制得的分子量为2000-24000的蛋白质(肽)。具体包括以下的步骤：制备地龙的水提取液、验证地龙的水提取液中含有蛋白质、从地龙的水提取液中提取蛋白质、提纯蛋白质。虽然该方法简便、快速，所提取的蛋白质具有显著的降血压作用，无毒副作用。但该发明只是利用浸取液，未对地龙整体进行利用，因此提取到的地龙蛋白的含量就低。

2、中国专利：申请号200910033499.5，发明名称：一种地龙蛋白多肽制剂。该发明公开了一种地龙蛋白多肽制剂及其制备方法和应用，通过对地龙在低温下匀浆粗提液进行酶水解得到水解的蛋白多肽，或者把地龙匀浆粗提液先通过酶水解得到水解的蛋白多肽，水解产物再通过采用不同孔径的超滤膜分离，得到不同分子量的蛋白多肽类成分。该发明得到的产品能够有效地防治高血压。该发明的制备方法复杂，酶解过程难于控制，而且匀浆过程需要在低温下进行，生产成本偏高。

3、中国专利：申请号 200910033500.4，发明名称：一种红地龙精制蛋白多肽制剂。该发明公开了一种红地龙精制蛋白多肽制剂及其制备方法和应用，通过采用不同孔径的超滤膜分离技术对红地龙蛋白多肽类活性成分进行分离，其主要活性成分为分子量在十万以下五万以上的蛋白类成分，由于其分子量较大，因此活性偏低。

4、中国专利：申请号 200910201857.9，发明名称：含地龙蛋白口含速溶制剂及其制备方法和应用。该发明公开了地龙蛋白的提取纯化过程均需要在低温下进行，因此对生产设备的要求比较高。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术中存在的不足，提供一种活性地龙蛋白的生产方法，该制备方法简单可行，整个生产过程能够在常温下进行，同时得到的活性地龙蛋白产品具有纯度高，提取率高，质量好的特点。

本发明技术方案如下：

一种活性地龙蛋白的生产方法，它包括对活体地龙催吐、地龙自溶、磨浆、过滤和离心、膜分离和干燥得到活性地龙蛋白产品，具体步骤如下：

（1）催吐：活体地龙置于容器中，使其吐出体内的食料，然后将地龙冲洗干净，备用；

（2）地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有40～50℃温水的容器中浸泡使其全部致死后，及时取出置于另一容器中，再加入保护剂，地龙与保护剂的重量比为1: 1~10；拌匀后，置于25～35℃的室温下10～48小时让地龙自溶，备用；所述保护剂为亚硫酸氢钠或L-半胱氨酸溶液；

（3）磨浆：将经步骤（2）自溶后带有残余地龙尸体的液体磨浆，制得浆液；

（4）过滤和离心：将步骤（3）得到的浆液先用60～300目筛网过滤，取其滤液，再用离心机在转速为5000～15000r/min下进行离心5～30分钟，去渣，得滤液；

（5）膜分离：先利用超滤装置采用截留分子量为9000~10000道尔顿的超滤膜对步骤（4）滤液进行膜分离，得滤液，然后再利用超滤装置采用截留分子量为2000~1000道尔顿的超滤膜进行膜分离，去除滤液，得浓缩液，备用；

（6）干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品。

所述催吐为在装有活体地龙的容器中加入体积浓度为5～10%的乙醇液体浸泡5～30分钟加速地龙吐出体内的食料，活体地龙与5～10%乙醇溶液的重量比为1 : 1～10。

所述亚硫酸氢钠重量浓度为0.1～5%。所述L-半胱氨酸溶液重量浓度为0.1～5%。本发明加入保护剂的目的是为了使得自溶能够在常温下进行，同时不破坏地龙自身的物质，起到抑制细菌色生长的作用。

以上所述的活体地龙是指环节动物门寡毛纲的动物，主要是指后孔寡毛目的陆栖动物，如如参环毛蚓（Pheretima aspergillum(E.Perrier)）、通俗环毛蚓（Pheretima vulgaris Clen）、赤子爱胜蚓（Eisenia Foetida）、红色爱胜蚓(Eisenia rosea savigny)等。

本发明所得到的活性地龙蛋白可以用于食品、保健食品、药品或化妆品的原料，它具有溶解血栓、改善全身微循环、软化血管，稳定斑块、建立侧枝循环，改善心脑供血供氧、双向调节血压、降低血粘等功效。

所得到的粉末成品（活性地龙蛋白产品），可采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量。

原理：蛋白质在酸性条件下易被沉淀，较低分子量的物质（分子量在10000道尔顿以下）即酸溶性蛋白质可溶于三氯乙酸（TCA）溶液。样品经酸化后，滤液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为活性地龙蛋白的含量。

具体分析步骤为：

1、酸溶蛋白质含量测定

取1g样品，加入15%的TCA溶液5ml，混合均匀，静置10min，将溶液全部移入离心管中，4000转/分，离心10min，取全部上清液，按GB/T5009.5-2003规定的方法测定，蛋白质换算系数为6.25，检验结果根据样品的干燥失重，折算为干基。得酸溶蛋白质的含量为P1。

2、游离氨基酸含量测定

取1g样品，加入15%的TCA溶液5ml，混合均匀，静置10min，将溶液全部移入离心管中，4000转/分，离心10min，取全部上清液，按GB/T5009.124-2003规定的方法测定。得游离氨基酸含量为P2。

3、结果计算：

活性地龙蛋白的含量P等于酸溶性蛋白质的测定含量减去游离氨基酸的测定含量，即： P=P1-P2 。

上述活性地龙蛋白含量检测方法均适用于以地龙为主要原料所制成的各种产品的质量监测。

本发明的有益效果：

1、本发明生产工艺简单、生产成本低、保存期长，整个生产过程能够在常温下进行，对设备要求低，能够有效降低生产成本，减免由于需要低温生产所产生的能耗。

2、本发明采用了与现有技术不同的催吐、加入保护剂、自溶、膜分离等工艺，生产得到的活性地龙蛋白产品的提取率高，产品纯度高，蛋白质含量能够达到80%以上，质量稳定。

3、本发明的产品可为食品、保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，在临床应用中，根据不同的需要，可以将本发明制成具有针对性的产品。

具体实施方式

下面采用实施例对本发明做进一步说明，其中乙醇浓度均为体积浓度，亚硫酸氢钠和L-半胱氨酸溶液浓度为重量浓度。

实施例1

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的参环毛蚓活体5千克，置于容器中，接着加入5%乙醇的液体5千克，浸泡30分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有40℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入0.1%的亚硫酸氢钠液体5千克，置于25℃的环境条件下48小时让其自溶，备用；

3、磨浆：将上述带有残余地龙尸体的溶液放入胶体磨内磨浆，制得浆液；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用60目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为5000转/分钟下进行离心30分钟，去渣，得滤液；

5、膜分离：先利用超滤装置采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜对步骤（4）滤液进行膜分离，得滤液，然后再利用超滤装置采用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行膜分离，去除滤液，得浓缩液，备用；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末2.11千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为81.3%。

实施例2

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的通俗环毛蚓活体17千克，置于容器中，接着加入10%乙醇的液体170千克，浸泡5分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有50℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入5%的亚硫酸氢钠液体17千克，置于35℃的环境条件下10小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用300目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为10000转/分钟下进行离心15分钟，去渣，得滤液；

5、膜分离：先利用超滤装置采用截留分子量为9000道尔顿的超滤膜对步骤（4）滤液进行膜分离，得滤液，然后再利用超滤装置采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜进行膜分离，去除滤液，得浓缩液，备用；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末10.52千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为74.9%。

实施例3

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的赤子爱胜蚓活体30千克，置于容器中，接着加入7%乙醇的液体150千克，浸泡16分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有46℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入3%的L-半胱氨酸液体90千克，置于32℃的环境条件下21小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用250目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为15000转/分钟下进行离心5分钟，去渣，得滤液；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末18.76千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为79.3%。

实施例4

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的红色爱胜蚓活体1千克，置于容器中，接着加入8%乙醇的液体5千克，浸泡11分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有45℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入4%的亚硫酸氢钠液体9千克，置于35℃的环境条件下15小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用100目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为8000转/分钟下进行离心22分钟，去渣，得滤液；

5、膜分离：先利用超滤装置采用截留分子量为9000道尔顿的超滤膜对步骤（4）滤液进行膜分离，得滤液，然后再利用超滤装置采用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行膜分离，去除滤液，得浓缩液，备用；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末0.47千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为77.8%。

实施例5

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的通俗环毛蚓活体100千克，置于容器中，接着加入9%乙醇的液体150千克，浸泡8分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有48℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入1.5%的L-半胱氨酸液体320千克，置于33℃的环境条件下27小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用100目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为7000转/分钟下进行离心30分钟，去渣，得滤液；

5、膜分离：先用分子量为10000道尔顿的超滤装置对步骤（4）滤液进行膜分离，得滤液，然后再用分子量为2000道尔顿的超滤装置进行膜分离，去除滤液，保留浓缩液，备用；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末51.81千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为80.7%。

实施例6

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的参环毛蚓活体12千克，置于容器中，接着加入5%乙醇的液体80千克，浸泡13分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有42℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入3.5%的亚硫酸氢钠液体20千克，置于26℃的环境条件下48小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用150目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为10000转/分钟下进行离心14分钟，去渣，得滤液；

5、膜分离：先用分子量为9000道尔顿的超滤装置对步骤（4）滤液进行膜分离，得滤液，然后再用分子量为1000道尔顿的超滤装置进行膜分离，去除滤液，保留浓缩液，备用；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末7.08千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为76.3%。

实施例7

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的赤子爱胜蚓活体46千克，置于容器中，接着加入10%乙醇的液体300千克，浸泡27分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有44℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入4%的L-半胱氨酸液体126千克，置于35℃的环境条件下19小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用250目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为9000转/分钟下进行离心24分钟，去渣，得滤液；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末20.92千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为80.7%。

实施例8

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的通俗环毛蚓活体77千克，置于容器中，接着加入7%乙醇的液体150千克，浸泡13分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有49℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入0.3%的L-半胱氨酸液体105千克，置于31℃的环境条件下35小时让其自溶，备用；

3、磨浆：将上述带有残余地龙尸体的液体放入胶体磨内磨浆，制得浆液；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用100目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为6000转/分钟下进行离心27分钟，去渣，得滤液；

5、膜分离：先利用超滤装置采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜对步骤（4）滤液进行膜分离，得滤液，然后再利用超滤装置采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜进行膜分离，去除滤液，得浓缩液，备用；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末37.08千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为76.9%。

实施例9

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的红色爱胜蚓活体7.6千克，置于容器中，接着加入8.8%乙醇的液体23.3千克，浸泡23分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有43℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入3.7%的亚硫酸氢钠液体35千克，置于26℃的环境条件下44小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用100目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为10000转/分钟下进行离心17分钟，去渣，得滤液；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末2.88千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为82.7%。

实施例10

本发明活性地龙蛋白的生产方法包括如下步骤：

1、催吐：取干净的参环毛蚓蚓活体38千克，置于容器中，接着加入9%乙醇的液体100千克，浸泡17分钟，使其充分吐出其体内的泥土等杂物；经搅动后、取出地龙用清水冲洗干净后，备用；

2、地龙自溶：将经催吐的活体地龙放入装有48℃温水的容器中浸泡使其致死后，及时取出置于另一容器中，再加入1.9%的亚硫酸氢钠液体88千克，置于29℃的环境条件下41小时让其自溶，备用；

4、过滤和离心：将步骤（3）制得的浆液用300目筛网进行过滤，取其滤液，再用离心机在转速为50000转/分钟下进行离心30分钟，去渣，得滤液；

6、干燥：将浓缩液直接进行干燥，得到粉末成品即为活性地龙蛋白产品，得到的活性地龙蛋白粉末20.35千克，经采用测定其酸溶蛋白质的含量及其游离氨基酸含量求出活性地龙蛋白的含量为78.2%。

Claims

1.一种活性地龙蛋白的生产方法，其特征在于：它包括对活体地龙催吐地龙催吐、地龙自溶、磨浆、过滤和离心、膜分离和干燥得到活性地龙蛋白产品，具体步骤如下：

（1）催吐：将活体地龙置于容器中，使其吐出体内的食料，然后取出地龙并将其冲洗干净，备用；

2.根据权利要求1所述的活性地龙蛋白的生产方法，其特征在于：所述催吐为在装有活体地龙的容器中加入体积浓度为5～10%的乙醇液体浸泡5～30分钟加速地龙吐出体内的食料，活体地龙与5～10%乙醇溶液的重量比为1 : 1～10。

3.根据权利要求1所述的活性地龙蛋白的生产方法，其特征在于：所述亚硫酸氢钠重量浓度为0.1～5%。

4.根据权利要求1所述的活性地龙蛋白的生产方法，其特征在于：所述L-半胱氨酸溶液重量浓度为0.1～5%。