CN104151425A - 一种天然水蛭素的规模化生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然水蛭素的规模化生产方法，就是先将吸饱诱导液后的吸血水蛭活体置于容器中，加入一定量的催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，催吐剂为硫酸锌溶液或硫酸锌与乙醇的混合液；然后取出吸血水蛭活体并用干净水将其冲洗后继续饲养，以便下一次提取；收集容器内的天然水蛭素粗品液体；加入适量填充剂混合后进行干燥得到的粉末成品即为天然水蛭素产品。本发明可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分的含量，使质量稳定，产品疗效有保证。该方法具有可进行规模化生产、工艺简单、提取率高、生产成本低等特点，可为食品、保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料。

Description

一种天然水蛭素的规模化生产方法

技术领域

本发明涉及有效活性成分提取方法，具体是涉及天然水蛭素的生产方法。

背景技术

天然水蛭素是由65～66氨基酸组成的低分子多肽，其分子量仅为7000道尔顿，极易溶于水和生理盐水，在常温下非常稳定，单纯的温度升高（100℃水浴），或pH改变（1～13）均不影响其活性。天然水蛭素是迄今为止世界上所发现的最强的天然抗凝血酶物质，对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病有特效，其防治效果是任何物质所不能比拟的。同时相关研究还表明，天然水蛭素是一种直接凝血酶抑制剂，其抗凝作用非常专一，抗凝效果比肝素强，且天然水蛭素在抑制凝血酶活性时不依赖于ATⅢ和肝素辅助因子Ⅱ的参与。

天然水蛭素与其他抗凝药如肝素相比, 其抗凝效果更可靠，这是因为: ①天然水蛭素不与血浆蛋白结合，血浆蛋白的种类、浓度不影响它的活性，抗凝效果一般不会因患者的不同发生变化,对凝血功能的监测要求不高。②天然水蛭素不但灭活游离的凝血酶，还可灭活与纤维蛋白结合的凝血酶，所以抑制血栓生长的作用比肝素明显。③天然水蛭素不与血小板因子Ⅵ结合，在栓子附近仍然有良好的抗凝作用，不会引起血小板减少。④天然水蛭素抗凝作用与维生素K无关，且不受食物的影响，药物之间互相影响小。由于上述这些优点，作为直接凝血酶抑制剂的天然水蛭素，目前，在欧洲及北美地区，已经被推荐取代传统肝素，常规用于心血管疾病的抗凝防治。

亦有研究，水蛭的药理活性强弱取决于其体内活性成分的抗凝血酶活性强度即天然水蛭素（英文名为：Hirudin）含量，也就是说水蛭的抗凝血酶活性强即天然水蛭素含量高，其药理活性就强，反之就弱。这是因为天然水蛭素是一种分泌型生物活性物质，仅存在于吸血水蛭（如吸血水蛭）头部的唾液腺及其所分泌的唾液中，只有当水蛭在吸血时才分泌出来并混于唾液中起防止血液凝固的作用，其身体的其它部位是不含天然水蛭素的，这种现象与蛇毒仅存在于蛇头部的毒腺中而身体的其它部位如蛇肉是不含蛇毒一样，非吸血类水蛭如宽体金线蛭体内是不含天然水蛭素的。

对现有技术中天然水蛭素的生产方法检索如下：

1、中国专利：03113566.8，发明名称：吸血水蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术。该发明是通过引进优良种源或野外捕捉到健壮的吸血水蛭，进行人工分级分段驯、喂养，进行人工繁殖，待饲养到一定程度，采用化学物质刺激鲜活吸血水蛭使其分泌出唾液，然后对其唾液进一步分离过滤得到水蛭素粗品，再将水蛭素粗品进行深加工得到符合医用的水蛭素，该吸血水蛭含抗凝血物质比其它品种吸血水蛭含量高，药用效果好，提取水蛭素方法简单，提取水蛭素后将吸血水蛭放回水池养殖，相隔一周或10天又可以再提取，每条鲜活吸血水蛭可以反复提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右，产品质量好，又节约资源，提高了吸血水蛭的利用价值。但该发明的缺点是：所采用化学物质刺激鲜活吸血水蛭使其分泌出唾液即天然水蛭素粗品自行吐出的量较小，还需要采用人工挤压的方法才能收集到较多的唾液即天然水蛭素粗品，其生产效率较低，且常引起吸血水蛭的口腔损伤，一方面可直接影响到后续的再次提取（因为口腔损伤很难吸吮诱导液），更重量的是另一方面造成口腔损伤，致使大批吸血水蛭死亡，明显增加成本，经济效益较差，无法进行规模化生产。

2、中国专利：200610019531.0 ，发明名称：一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用。该发明制备方法的特征在于包括吸血水蛭制浆、配制悬浊液和干燥三个步骤，所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。该发明具有工艺简单、生产成本较低、产品保存期长、并可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭素含量，从而使质量稳定，产品疗效有保证等特点。水蛭素应用范围广泛，可通过常规的方法单独做成胶囊、软胶囊、颗粒剂、片剂使用，或与其它动、植物药制成复方制剂，用于防治脑中风、高血压、高脂血症、冠心病等心脑血管疾病。

3、中国专利：200710066096.1 ，发明名称：一种天然水蛭素有效成分的提取方法。该发明公开了一种天然水蛭素有效成分的提取方法，是用水清洗吸血水蛭干净后加入含量15～25％的乙醇水溶液浸泡30-50小时后，过滤，得滤液和药渣；将吸血水蛭药渣绞碎，再加含量15～25％的丙酮水溶液浸泡，滤过，得滤液，分别将两次滤液真空回收乙醇和丙酮后，合并滤液，常规真空冷冻干燥，得到产品。该发明工艺简单、成本低廉，收率较高、产品质量好、保存期长，整个生产过程无“三废”排放，产品作为医药、美容、保健食品三大领域的原料。但在天然水蛭素提取过程中，要使用到乙醇、丙酮，而乙醇和丙酮为易燃品，存在着安全隐患。

4、中国专利：200710026462.0，发明名称：一种以吸血水蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺。该发明属于中药制药领域，涉及动物有效成分的提取，目的是解决传统水蛭素提取工艺难以工业化生产的问题。该工艺采用从整体吸血水蛭中提取水蛭素，可以工业化生产。先把吸血水蛭匀浆，浆状物用生理盐水提取三次，过滤。滤液煮沸、过滤除杂蛋白。收集滤液，经冷冻浓缩，醇沉后得水蛭素粗品。再用生理盐水洗涤水蛭素粗品，然后浓缩洗涤液，最后冷冻干燥得到产品。该水蛭素生产工艺方法简单，成品质量合格，药理实验结果表明，用该工艺提取的水蛭素有很好的药理作用。但在天然水蛭素提取过程中，要使用到乙醇，而乙醇为易燃品，存在着安全隐患。

5、中国专利：200710026461.6，发明名称：一种以吸血水蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺。该发明属于中药制药领域，涉及动物有效成分的提取。目的是解决传统水蛭素提取工艺难以工业化生产的问题。该工艺用吸血水蛭唾液提取水蛭素，可以工业化生产。吸血水蛭唾液用生理盐水提取，提取液煮沸、过滤、取滤液。固形物用生理盐水提取，过滤，取滤液。合并前后的全部滤液，加入Lyphgel处理两次，过滤，去滤液。固形物用生理盐水提取，过滤。滤液煮沸后迅速冷却，冷藏过夜。离心，取上清液减压浓缩后再冷冻干燥成冻干粉。该生产工艺简单，产品活力高，有很强的溶血栓作用。但该发明提取到的天然水蛭素，其杂质较多，纯度较低。

6、中国专利：201110237495.6，发明名称：一种天然水蛭素的生产方法。该发明它包括含天然水蛭素液体的提取、酸沉、加热、脱水和干燥的工艺，其中含天然水蛭素液体的提取是选取吸血水蛭，经除杂、洗净、晾干后直接放入磨浆机内磨浆，制得浆液，备用；

在上述的六个国家发明专利中，除第一个国家发明专利即本申请人的专利能进行活体多次提取天然水蛭素外，其它的发明专利都是分离纯化天然水蛭素的或对水蛭进行处死后一次性提取天然水蛭素（如上述的第6个国家发明专利），这样其生产天然水蛭素的成本过高，经济效益较差，无法进行规模化生产。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明将使用催吐剂替代人工挤压方法进行收集天然水蛭素粗品液体，从而克服目前吸血水蛭活体多次提取中所存在的缺点，进而提高生产效率，减少吸血水蛭死亡率，降低成本，以实现天然水蛭素的规模化生产。

本发明是这样实现的：

一种天然水蛭素的规模化生产方法，它包括对吸饱诱导液后的吸血水蛭活体进行催吐和

干燥，便可得到天然水蛭素粉末；具体步骤如下：

（1）催吐：将吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体置于容器中，加入一定量的催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并用干净水将其冲洗后继续饲养、以备下一次提取天然水蛭素粗品用；同时收集容器内的天然水蛭素粗品液体；所述的催吐剂为硫酸锌溶液或硫酸锌与乙醇的混合液，催吐剂的用量与吸饱诱导物质后吸血水蛭活体之间的重量比为1:1～10。

（2）干燥：将天然水蛭素粗品液体过滤除杂，加入适量填充剂混合，然后进行干燥得到的粉末成品即为天然水蛭素产品。

作为进一步优选，本发明的催吐剂为0.05～1.0%的硫酸锌溶液。

作为再进一步优选，所述催吐剂为0.05～1.0%的硫酸锌与5～10%的乙醇的混合液，它们的重量比为1:1～2。

加入催吐剂使吸血水蛭不由自主地将其体内的唾液吐出体外，并且对其本身无损伤和毒害作用。同时要控制催吐剂的用量和浓度，浓度不能过高，否则会对吸血水蛭本身有一定的影响。

本发明中加入催吐剂后，通常将吸血水蛭静置10～45分钟，使其吐出体内的唾液。

本发明中采用的填充剂为淀粉、蔗糖、可溶性纤维素、甘露醇、麦芽糊精和乳糖中一种或者一种以上的混合物，天然水蛭素粗品溶液与填充剂的重量比为1:0.1～1.0。

本发明中所采用的常规干燥方法可优选冷冻干燥或喷雾干燥。

本发明的吸血水蛭包括环节动物门蛭纲所有的吸血水蛭，其中包括医蛭科和山蛭科的水蛭如菲牛蛭（俗称：金边蚂蟥）、日本医蛭、棒纹牛蛭、湖北牛蛭和海南山蛭等。

本发明中所用的诱导液是按本申请人的专利（专利号：ZL03113566.8）中的方法进行配制和投喂。

本发明所得到的天然水蛭素产品可作为食品、保健食品、药品或化妆品的原料，具有抗凝溶栓、改善血液循环、促进新陈代谢等作用，在临床上用于防治心脑血管疾病如中风、冠心病、高血脂等。

采用本发明中的生产方法，每天可提取天然水蛭素粗品液体200千克，比人工挤压的5千克生产效率提高40倍,其死亡率比人工挤压的降低72%，同时，还能缩短提取周期，由原来的7～10天缩短为4～6天。

本发明所得到的天然水蛭素产品，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分的含量，其天然水蛭素的含量为100～10000国际单位/克。

根据水蛭素能与凝血酶特异性结合，使凝血酶失活，其结合比例为1：1的原理，用Markwardt凝血酶直接滴定法可检测天然水蛭素的含量。

水蛭素的计量单位为国际单位，以ATU表示，凝血酶活性的国际单位为NIH，即1个ATU等于中和1个NIH凝血酶的水蛭素量。

天然水蛭素含量检测方法：

取本品粉末约1g，精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl，置试管（10mm×100ml）中，加入0.5％（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液约40ml，加水至100 ml，调节pH值至7.4）200μl，摇匀，置水浴（37℃±0.5℃）中缓缓滴加每1ml(中)含40 U（单位）的凝血酶溶液（每分钟5μl，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算：

U＝C₁V₁/C₂V₂W

式中：U---每1g含凝血酶活性单位，即水蛭素含量，ATU/g；

C₁---凝血酶溶液的浓度，μ/ ml； 

C₂---供试品溶液的浓度，g / ml；

V₁--消耗凝血酶溶液的体积，μl；

V₂ ---供试品溶液的加入量，μl；

W---取样量。

上述天然水蛭素含量检测方法均适用于以天然水蛭素为主要原料所制成的各种产品的质量监测。

本发明的有益效果是：

（1）本发明中通过使用催吐剂对吸饱诱导液后的吸血水蛭活体进行催吐以获得天然水蛭素粗品，就可避免目前通常采用的人工挤压法所引起的吸血水蛭口腔损伤、感染而造成死亡率高，进而影响下一次提取的现象。

（2）在本发明所使用的催吐剂中，其中硫酸锌极易溶于水，是人体的补锌剂，亦可作为动物微量元素添加剂，能有效促进动物的生长、发育；乙醇极易溶于水，为无色透明液体，它具有特殊的、令人愉快的香味等。它们能够刺激吸血水蛭使其吐出体内的唾液，且在一定浓度范围内均对人和吸血水蛭均无毒、无害。

（3）采用本发明中的生产方法，每人每天可提取天然水蛭素粗品液体200千克，比人工挤压的5千克生产效率提高40倍,其死亡率比人工挤压的降低72%，同时，还能缩短提取周期，由原来的7～10天缩短为4～6天，每条鲜活吸血水蛭可反复提取6～7次，每次能提取水蛭素粗品液体10毫升左右，杂质少，产品质量好，这样提高了吸血水蛭的利用价值，达到了节约资源的目的。 

（4）本发明的生产方法简单、生产周期短，成本低廉，适合规模化生产，同时，产品保存期长、可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其活性成分含量，从而保证了产品的质量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明，但这种说明不作为对本发明的限制。

实施例1

一种天然水蛭素的规模化生产方法，包括如下步骤：

1、诱导物质的制备和投喂：按本发明人所发明的中国发明专利：03113566.8的方法进行配制和投喂。用乙酸、柠檬酸、氯化钠、碳酸钠溶解于蒸馏水中，控制浓度为0.1～0.5%，pH为4.5左右即可得到诱导物质。然后投入到清洗干净的吸血水蛭活体中，让吸血水蛭充分吸饱，便可得到吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体，备用。

2、催吐：取上述吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体52千克置于容器中，然后加入0.08%的硫酸锌溶液52千克，静置10分钟，待吸血水蛭活体吐出其体内的唾液即天然水蛭素粗品液体后，取出吸血水蛭活体并用干净的水冲洗后放回原池继续饲养，以备下一次提取用；共得到天然水蛭素粗品液体83.9千克（含硫酸锌溶液）。

3、干燥：在上述天然水蛭素粗品液体进行过滤，除去其中的杂质，然后加入甘露醇4.39千克后进行喷雾干燥，得到天然水蛭素产品4.1千克，经检测，其天然水蛭素含量为1268ATU（国际单位）/克。

采用这样的方法，每条鲜活吸血水蛭可反复提取6～7次，提取周期为4~6天，每次每条能提取水蛭素粗品液体10毫升左右。

 

实施例2

一种天然水蛭素的规模化生产方法，包括如下步骤：

1、诱导物质的制备和投喂：按本发明人所发明的中国发明专利：03113566.8的方法进行配制和投喂。用精氨酸、胱氨酸、磷酸钠混合物的水溶液，控制浓度为0.5～1%，pH为4.5～6.8，溶解于蒸馏水中即可得到诱导物质。然后投入到清洗干净的吸血水蛭活体中，让吸血水蛭充分吸饱，便可得到吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体，备用。

2、催吐： 

（1）先配制催吐剂：将1.0%的硫酸锌溶液1.7千克与10%的乙醇1.7千克充分混合后即得到所要的催吐剂，备用。

（2）催吐：取上述吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体34千克置于容器中，然后加入上述配制好的催吐剂，静置45分钟，待吸血水蛭活体吐出其体内的唾液即天然水蛭素粗品液体后，取出吸血水蛭活体并用干净的水冲洗后放回原池继续饲养，以备下一次提取用；共得到天然水蛭素粗品液体24.2千克（含催吐剂）。

3、干燥：在上述天然水蛭素粗品液体进行过滤，除去其中的杂质，然后中加入食用木薯淀粉14.9千克后进行冷冻干燥，得到天然水蛭素产品14.1千克，经检测，其天然水蛭素含量为409ATU（国际单位）/克。

采用这样的方法，每条鲜活吸血水蛭可反复提取6～7次，提取周期为4~6天，每次每条能提取水蛭素粗品液体10毫升左右。

 

实施例3

一种天然水蛭素的规模化生产方法，包括如下步骤：

1、诱导物质的制备和投喂：按本发明人所发明的中国发明专利：03113566.8的方法进行配制和投喂。用盐酸、碳酸钠、磷酸二氢钾混合物的水溶液，控制浓度为3～5%，pH为6左右，溶解于蒸馏水中即可得到诱导物质。然后投入到清洗干净的吸血水蛭活体中，让吸血水蛭充分吸饱，便可得到吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体，备用。

2、催吐： 

（1）先配制催吐剂：将0.5%的硫酸锌溶液2千克与5%的乙醇4千克充分混合后即得到所要的催吐剂，备用。

（2）催吐：取上述吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体30千克置于容器中，然后加入上述配制好的催吐剂，静置30分钟，待吸血水蛭活体吐出其体内的唾液即天然水蛭素粗品液体后，取出吸血水蛭活体并用干净的水冲洗后放回原池继续饲养，以备下一次提取用；共得到天然水蛭素粗品液体24.4千克（含催吐剂）。

3、干燥：在上述天然水蛭素粗品液体进行过滤，除去其中的杂质，然后加入甘露醇和麦芽糖糊精按照3：1的混合物34.4千克后进行冷冻干燥，得到天然水蛭素产品34.6千克，经检测，其天然水蛭素含量为100ATU（国际单位）/克。

采用这样的方法，每条鲜活吸血水蛭可反复提取6～7次，提取周期为4~6天，每次每条能提取水蛭素粗品液体10毫升左右。

 

实施例4

一种天然水蛭素的规模化生产方法，包括如下步骤：

1、诱导物质的制备和投喂：按本发明人所发明的中国发明专利：03113566.8的方法进行配制和投喂。用抗坏血酸、胱氨酸、氯化钠混合物溶解于蒸馏水中，控制浓度为0.5～1%，pH为5.5左右即可得到诱导物质。然后投入到清洗干净的吸血水蛭活体中，让吸血水蛭充分吸饱，便可得到吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体，备用。

2、催吐：取上述吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体100千克置于容器中，然后加入0.05%的硫酸锌溶液14.3千克，静置17分钟，待吸血水蛭活体吐出其体内的唾液即天然水蛭素粗品液体后，取出吸血水蛭活体并用干净的水冲洗后放回原池继续饲养，以备下一次提取用；共得到天然水蛭素粗品液体89.6千克（含硫酸锌溶液）。

3、干燥：在上述天然水蛭素粗品液体进行过滤，除去其中的杂质，然后加入玉米淀粉1.8千克后进行喷雾干燥，得到天然水蛭素产品1.5千克，经检测，其天然水蛭素含量为10000ATU（国际单位）/克。

采用这样的方法，每条鲜活吸血水蛭可反复提取6～7次，提取周期为4~6天，每次每条能提取水蛭素粗品液体10毫升左右。

 

实施例5

一种天然水蛭素的规模化生产方法，包括如下步骤：

1、诱导物质的制备和投喂：按本发明人所发明的中国发明专利：03113566.8的方法进行配制和投喂。用磷酸、赖氨酸、碳酸钠、氯化钠、氯化钾混合物的水溶液，控制浓度为1～1.5%，pH为5.0左右，溶解于蒸馏水中即可得到诱导物质。然后投入到清洗干净的吸血水蛭活体中，让吸血水蛭充分吸饱，便可得到吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体，备用。

2、催吐： 

（1）先配制催吐剂：将0.1%的硫酸锌溶液3千克与10%的乙醇4.5千克充分混合后即得到所要的催吐剂，备用。

（2）催吐：取上述吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体60千克置于容器中，然后加入上述配制好的催吐剂，静置34分钟，待吸血水蛭活体吐出其体内的唾液即天然水蛭素粗品液体后，取出吸血水蛭活体并用干净的水冲洗后放回原池继续饲养，以备下一次提取用；共得到天然水蛭素粗品液体44.1千克（含催吐剂）。

3、干燥：在上述天然水蛭素粗品液体进行过滤，除去其中的杂质，然后加入甘露醇和蔗糖按照6：1的混合物5.3千克后进行冷冻干燥，得到天然水蛭素产品4.8千克，经检测，其天然水蛭素含量为5056ATU（国际单位）/克。

采用这样的方法，每条鲜活吸血水蛭可反复提取6～7次，提取周期为4~6天，每次每条能提取水蛭素粗品液体10毫升左右。

Claims (6)

1.一种天然水蛭素的规模化生产方法，其特征在于：它包括对吸饱诱导液后的吸血水蛭活体进行催吐和干燥，便可得到天然水蛭素粉末；具体步骤如下：

（1）催吐：将吸饱诱导物质后的吸血水蛭活体置于容器中，加入一定量的催吐剂使其吐出体内的唾液即天然水蛭素粗品液体，然后取出吸血水蛭活体并将其冲洗干净后继续饲养、以备下一次提取天然水蛭素粗品用；同时收集容器内的天然水蛭素粗品液体；所述的催吐剂为硫酸锌溶液或硫酸锌与乙醇的混合液，催吐剂的用量与吸饱诱导物质后吸血水蛭活体之间的重量比为1:1～10；

（2）干燥：将天然水蛭素粗品液体过滤除杂，加入适量填充剂混合，然后进行干燥所得到的粉末成品即为天然水蛭素产品。

2.根据权利要求1所述的天然水蛭素的规模化生产方法，其特征在于：所述催吐剂为0.05～1.0%的硫酸锌溶液。

3.根据权利要求1所述的天然水蛭素的规模化生产方法，其特征在于：所述催吐剂为0.05～1.0%的硫酸锌与5～10%的乙醇的混合液，它们的重量比为1:1～2。

4.根据权利要求1所述的天然水蛭素的规模化生产方法，其特征在于：加入催吐剂后，将吸血水蛭静置10～45分钟，使其吐出体内的唾液。

5.根据权利要求1所述的天然水蛭素的规模化生产方法，其特征在于：所述填充剂为淀粉、蔗糖、可溶性纤维素、甘露醇、麦芽糊精和乳糖中一种或者一种以上的混合物，天然水蛭素粗品溶液与填充剂的重量比为1:0.1～1.0。

6.根据权利要求1所述的天然水蛭素的规模化生产方法，其特征在于：所述干燥可采用冷冻干燥或喷雾干燥。