KR101653687B1 - 해삼을 이용한 기능성 원료 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 해삼 분쇄물에 세린 프로테아제를 처리하는 단계, (b) 상기 세린 프로테아제 처리된 해삼을 여과 및 농축하는 단계, 및 (c) 상기 여과 및 농축된 해삼을 동결 건조하는 단계를 포함하여 구성되는 해삼을 이용한 기능성 원료 제조 방법을 개시한다. 본 발명의 기능성 원료는 기존의 해삼 추출물보다 뛰어난 항염 활성, 미백 활성 및 주름개선 활성을 보였다.

Description

해삼을 이용한 기능성 원료 제조 방법{Method for Preparing Functional Raw Materials Using Stichopus japonicus}

본 발명은 해삼 효소처리물을 유효성분으로 하는 기능성 원료 제조 방법에 관한 것이다.

해삼(Stichopus japonicus )은 극피 동물에 속하며 전 세계적으로 1,500여 종 정도가 있으며 우리나라에는 4과 14종이 서식하고 있는 것으로 알려져 있다. 해삼은 우리나라 전 연안에 넓게 분포하고 있으며 이들 중 주로 식용으로 사용되는 돌기해삼은 색깔에 따라 청해삼, 홍해삼, 흑해삼으로 다르게 불리우고 있다. 해삼은 예로부터 “바다의 인삼”이라 하여 최고의 한약재로 사용되어 왔으며 최근 세계적으로 건강, 웰빙에 대한 관심이 높아지면서 자양강장효과, 항암효과, 비만예방, 고혈압 예방 등의 성분이 함유된 해삼의 소비가 중국, 일본을 비롯하여 우리나라에서도 급증하고 있는 실정이다. 이러한 이유로 해양 수산부에서는 우리나라 8대 웰빙 수산물의 하나로 해삼을 지정하고 있으며 지속적으로 그 중요성이 커지고 있다.

그러나 해삼은 점착성이 높은 당단백질로 구성되어 있으며 수분의 함량이 전체의 90%를 차지하고 있기 때문에 유통중에 쉽게 변성될 수 있다. 이에 따라 해삼은 그동안 생 것을 잡아 냉장보관한 후 며칠내로 먹거나 건조 또는 통조림 등의 형태로 가공하여 유통하였다. 그러나, 상기와 같이 건조할 경우 해삼 특유의 풍미를 유지하기 어렵고 육질이 두껍기 때문에 수분탈수 분량 등으로 인한 부패 촉진 현상이 초래되었으며 열건조시에는 영양가 파괴 등의 문제가 나타난다. 또한 통조림으로 가공되는 경우 통조림내의 용액 속에서 오랫동안 담겨져서 해삼 내 수분함량이 지나치게 많게 되고 따라서 씹힘성 등이 저하되며 신선한 맛을 맛볼 수 없을 뿐만 아니라 변성되기도 쉬운 단점이 있다.

따라서, 영양학적 기능 또는 생리학적 작용에서 활용 가치가 높은 해삼을 편리하게 활용하기 위한 가공 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 해삼을 이용한 기능성 원료의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 양태는 이하에서 제시될 것이다.

본 발명의 목적은 해삼을 이용한 기능성 원료의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 내장이 제거된 해삼 분쇄물에 단백질 분해효소를 처리하고 여과농축하여 얻어진 해삼을 동결 건조하여 획득한 원료가 일반 해삼 추출물보다 항염, 미백 및 주름개선 등의 기능성 활성이 현저히 우수함을 확인함으로써 완성된 것이다.

단백질 분해효소가 처리된 해삼 기능성 원료는 일반 해삼 추출물보다 생리학적 활성이 우수하며, 이것은 단백질 분해효소 처리 과정 중에서 여러 기능성 물질들이 새로 생성되거나 그러한 물질들의 생성이 증가, 보존력이 증가하였기 때문인 것으로 추정할 수 있다.

본 발명의 해삼을 이용한 기능성 원료의 제조 방법은, 일 측면에 있어서는 (a) 해삼 분쇄물에 세린 프로테아제를 처리하는 단계, (b) 상기 세린 프로테아제 처리된 해삼을 여과 및 농축하는 단계, 및 (c) 상기 여과 및 농축된 해삼을 동결 건조하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 명세서에서 해삼(Stichopus japonicus)은 외피의 색깔에 따라 홍해삼, 청해삼, 흑해삼, 해파리해삼 등으로 구분해 부르며, 이들은 모두 같은 종이다. 몸은 앞뒤로 긴 원통 모양이고 등에 혹 모양의 돌기가 여러개 나 있다. 해삼의 폴리씨낭(Polian vesicle)은 가늘고 길며 선단이 뾰족하고, 알에는 두께 25um 내외의 젤라틴 피물을 지닌다. 수축성이 크고 자생력이 매우 강해 상처 후 손상된 부분의 치유력이 높다.

본 명세서에서 "해삼 분쇄물"이란 해삼을 세척한 후 세린 프로테아제를 처리하기 위하여 적절한 크기로 분쇄한 것을 말한다. 그 크기는 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 결정될 수 있으며 한정되지 아니한다. 또한 해삼 분쇄물은 전체 해삼을 사용할 수 있으나 아래의 실시예와 같이 내장을 제거한 해삼을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로 내장 부위에는 효소를 포함하는 다량의 단백질들이 이미 존재하기 때문에 단백질 분해효소 처리시에 반응이 억제될 수 있으며 가공 시 오염의 가능성이 커진다.

본 명세서에서 "세린 프로테아제"(serine proteases)는 세린 아미노산 부위를 인지하여 펩타이드 간의 결합을 자르며 세린 엔도펩티다아제(serine endopeptidases)로도 알려져 있다(Hedstrom L. Chem Rev. 2002 Dec;102(12):4501-24.). 진핵생물과 원핵생물 모두에 존재하며 소화, 면역반응, 혈액 응고 작용 등 생체 내 다양한 생리활성에 관여한다. 세린 프로테아제는 계통학적, 구조학적 관점 등에 의하여 여러 분류로 나뉠 수 있으나 단백질 분해 활성을 보이기 위하여 세린을 인지하며 기능을 수행하는 공통점이 있다. 본 발명의 실시예에서는 subtilisin 계열의 세린 프로테아제를 사용하였으며 이는 비특이적인 단백질 분해효소이다(Ottesen Mm AND Svendsen I. Methods Enzymol.1970. 19: 199-215; Philipp M AND Bender ML. Mol. Cell. Biochem. 1983 51 (1): 5-32.). Subtilisin은 여러 알파 헬릭스(alpha0helix) 구조와 하나의 큰 베타 시트(beta-sheet)로 구성되어 있으며 chymotrypsin 계열 등의 다른 세린 프로테아제와는 구조적으로 차이를 보이나, 효소 촉매 부위 및 활성 부위(active site)에서는 유사성을 보인다. Subtilisin은 alcalase(알칼라아제), alcalase 0.6L, alcalase 2.5L, alcalase 2.4L ALK-enzyme, bacillopeptidase A, bacillopeptidase B, Bacillus subtilis alkaline proteinase bioprase, bioprase AL 15, bioprase APL 30, colistinase, subtilisin J, subtilisin S41, subtilisin Sendai, subtilisin GX, subtilisin E, subtilisin BL, genenase I, esperase, maxatase, thermoase PC 10, protease XXVII, thermoase, superase, subtilisin DY, subtilopeptidase, SP 266, savinase 8.0L, savinase 4.0T, kazusase, protease VIII, opticlean, Bacillus subtilis alkaline proteinase, protin A 3L, savinase, savinase 16.0L, savinase 32.0 L EX, rientase 10B, protease S, serine endopeptidase 등으로 불리우고 있다. Subtilisin은 여러 형태로 다양한 회사에서 상품화되어 판매되고 있다. Sigma 사의 Proteinase from Bacillus licheniformis Type VIII(P5380), Alcalase®(P4860), Proteinase bacterial Type XXIV(P8038) 제품, milipore사의 Subtilisin Carlsberg, Bacillus licheniformis(572909), novozyme 사의 Alcalase® 2.4 L 제품 등이 존재하며 일반적으로 효소가 활성을 나타내는 온도의 범위는 30℃ ~ 40℃ 정도이나 해당 효소들의 활성 범위는 20℃ ~ 80℃ 정도이다.

세린 프로테아제를 처리하기 위한 적정 효소 반응 조건은 효소의 농도와 온도 및 처리 시간 등이 있으며, 일반적으로 효소의 농도가 높은 경우 처리 시간이 짧아질 수 있으나 비용 및 제조기간이 고려되어야 한다. 본 발명의 실시예에서는 내장이 제거된 분쇄 해삼의 부피와 동량의 물을 첨가하였으며 노보자임(novozymes)의 알칼라아제 2.4L(Alcalase® 2.4 L, 2.4 AU-A/g)를 처리하였다. 첨가하는 알칼라아제의 양은 임의적으로 선택 가능하나 효소가 활성을 나타낼 수 있는 농도와 반응의 효율성을 고려할 때 총 부피의 0.01%(v/v) ~ 5%(v/v)의 농도 범위가 바람직할 수 있으며 0.1%(v/v) ~ 1%(v/v)의 농도 범위가 더욱 바람직하다. 상기 효소의 처리 온도의 범위는 20℃ ~ 80℃ 인 것이 바람직하며 55℃ ~ 70℃ 범위인 것이 더욱 바람직하다. 또한 적절한 효소 처리 시간은 처리 농도 및 온도에 의하여 결정될 수 있는데 너무 짧은 경우에는 효소의 반응이 충분하게 이루어지지 않을 수 있으며 너무 오래 처리할 경우에는 단백질 변성, 부패가 일어나며 제조기간이 오래 걸려 비효율적일 수 있다. 바람직하게는 30분 내지 12시간 동안 효소를 처리할 수 있으며 더욱 바람직하게는 1시간 내지 3시간 동안 처리할 수 있다. 효소처리 후 반응을 비활성화하기 위하여 고온 처리, 계면활성제 처리, 억제효소 처리 등을 수행할 수 있으며 본 발명의 실시예에서는 90℃에서 20분간 유지하였다.

본 명세서에서, "여과"는 고체와 액체 혼합물 중 일정 크기 이상의 물질을 분리시키는 작업으로, 중력여과, 감압여과, 가압여과 방식 등이 존재하며 여과체, 여과지, 여과포, 자동 흡입 여과기, 압착 여과기 등의 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 또한 여과를 용이하게 하기 위하여 식품 첨가물 공전에 수록된 이산화규소, 규산칼슘, 규조토, 벤토나이트, 활성탄 등의 여과 보조제를 1종 이상 첨가할 수 있다.

또한 본 명세서에서, "농축"이란 수분의 함량이 높은 물질에서 고형물의 농도를 높이는 작업으로 상압가열농축 및 진공농축 등의 증발농축, 물을 얼음 결정으로 석출시키는 냉동농축, 한외여과 및 역삼투를 사용한 막농축 등의 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 명세서에서, "동결 건조"란 예비 동결과정을 거칠 수 있으며 시중의 동결건조기 등 제품을 사용하여 기존의 식품 동결건조 조건과 동일하게 동결건조하여도 무방하다. 동결 건조 후 분쇄방법은 분쇄효율 및 분쇄입자의 고른 산포율을 높이기 위하여 동결건조물을 그대로 분쇄할 수 있는 시중의 냉동 파쇄 및 분쇄방식의 식품분쇄기를 사용할 수 있다. 또한 분쇄물을 망체에 통과시켜 통상 식품 및 화장품 원료로 사용하기에 적합한 크기의 분말을 획득할 수 있으며 그 크기는 한정되지 아니한다.

본 명세서에서, 상기 "기능성"이란 인체의 생리학적 작용에 있어서 유용한 효과를 말한다. 이러한 기능성으로서, 아래의 실험예에서 확인된 항염 활성, 미백 활성, 주름개선 활성 이외에, 예컨대 항암 활성(대한민국 공개특허공보 제 10-2011-0135908호), 피부 자극 완화 활성, 피부 보습 활성, 피부 상처 개선 효과(대한민국 공개특허공보 제 10-2011-0084132호), 항균 활성(대한민국 공개특허공보 제10-2012-0033535호) 등을 들 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) 해삼 분쇄물에 세린 프로테아제를 처리하는 단계, (b) 상기 세린 프로테아제 처리된 해삼을 여과 및 농축하는 단계, 및 (c) 상기 여과 및 농축된 해삼을 동결 건조하는 단계를 통하여 획득한 해삼을 이용한 기능성 원료를 유효성분으로 하는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 제공되는 식품 조성물은 항염증 활성을 지니는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 보조식품, 건강기능성식품, 특수 영양 보충용 식품, 기능성 음료 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 향미나 기호성을 향상시키고 기능성을 향상시키기 위하여 천연물 유래의 분말 또는 추출물을 포함할 수 있는데, 선지 분말 또는 추출물, 콩나물 분말 또는 추출물, 조개 분말 또는 추출물, 굴 분말 또는 추출물, 산미나리 분말 또는 추출물, 무 즙 또는 추출물, 오이 즙 또는 추출물, 부추 즙 또는 추출물, 시금치 즙 또는 추출물, 연근 즙 또는 추출물, 칡 즙 또는 추출물, 솔잎 즙 또는 추출물, 인삼 즙 또는 추출물, 백화사설초 분말 또는 추출물, 감초 분말 또는 추출물, 갈화 분말 또는 추출물, 갈근 분말 또는 추출물, 사인 분말 또는 추출물, 박 분말 또는 추출물, 생강 분말 또는 추출물, 대추 분말 또는 추출물, 인진 분말 또는 추출물, 지구자 분말 또는 추출물, 수비계 분말 또는 추출물, 백출 분말 또는 추출물, 저령 분말 또는 추출물, 진피(진귤의 껍질) 분말 또는 추출물, 구기자 분말 또는 추출물, 녹차 분말 또는 추출물, 오미자 분말 또는 추출물, 헛개나무 분말 또는 추출물, 지치 분말 또는 추출물, 노근 분말 또는 추출물, 계피 분말 또는 추출물, 데커시놀 등이 예시될 수 있다. 이러한 추출물은 추출 대상을 혼합하여 얻어질 수도 있다.

본 발명의 식품 조성물은 분말 자체, 착즙액 자체, 음료, 정제, 현탁액, 과립, 에멀젼, 캡슐, 시럽 등의 형태로 제형화될 수 있다.

또한 본 발명은 (a) 해삼 분쇄물에 세린 프로테아제를 처리하는 단계, (b) 상기 세린 프로테아제 처리된 해삼을 여과 및 농축하는 단계, 및 (c) 상기 여과 및 농축된 해삼을 동결 건조하는 단계를 통하여 획득한 해삼을 이용한 기능성 원료를 유효성분으로 하는 화장품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 제공되는 화장품 조성물은 항염증 활성, 미백 활성 및 주름개선 활성을 지니는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장품 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩 또는 분말 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 그 유효성분 이외에 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다.

여기서 "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 0.1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량 %로 포함될 수 있다.

그러나 상기 비율은 본 발명의 화장품의 제조되는 전술한 바의 형태에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다.

상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료의 성분들은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 아니한 용어는 국어사전적 의미나 당업계에서 일반적으로 통용되는 의미를 따른다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 해삼을 이용한 기능성 원료 제조 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 기능성 원료는 식품이나 화장품으로 제품화될 수 있다.

본 발명의 해삼 효소처리물을 이용한 기능성 원료는 일반 해삼 추출물보다 생리학적 활성이 우수하며, 이것은 단백질 분해효소 처리 과정 중에서 여러 기능성 물질들이 새로 생성되거나 그러한 물질들의 생성이 증가, 보존력이 증가하였기 때문인 것으로 보인다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 해삼을 이용한 기능성 원료 제조 방법

해삼의 내장을 제거 후 분쇄기를 사용하여 분쇄물을 수득한 후에 물을 1.0배 첨가하여 반응액을 준비하였다.

그 후 세린 프로테아제(serine proteases)인 알칼라아제 2.4L(novozymes)을 총 부피의 0.5%(v/v)를 첨가하여 온도 60±5℃에서 2시간-3시간을 유지하면 용액 상태로 변환되었다. 이어서 효소의 비활성화를 시키기 위하여 온도 90℃에서 20분간 교반하였다.

반응이 끝난 다음 여과성을 개선하기 위해서 여과보조제를 0.5%~1.0%(w/v) 첨가하였으며 이취와 탈색효과를 지닌 활성탄(A.C)을 0.1%(w/v)를 첨가하였다. 용액을 여과하기 위해 필터프레스(압착여과기)를 통과하여 여액을 수득하였다. 용액의 고형분 함량은 5~6%선이며, 진공농축기를 사용하여 농축액(고형분 30%정도)을 조정하여 획득하였다.

동결건조 과정을 하기 위해서 예비동결(-70~-80℃) 상태에서 하룻밤 동안 방치하여 두었다. 동결된 해삼 엑기스 분말액을 동결건조기(-70~-80℃)에서 48~72시간 동안 건조 공정을 거쳤다.

동결건조분을 분쇄기 및 mesh(망체)를 통과시켜서 해삼을 이용한 기능성 원료를 엑기스 분말 형태로 획득하였다.

< 비교예 > 해삼 추출물 제조방법

해삼에 70%(v/v) 에탄올을 첨가한 후 24시간 동안 추출하였다

상기 추출물을 필터프레스를 통과하도록 하여 여과하였으며 동결건조 과정을 하기 위해서 동결건조 과정을 하기 위해서 예비동결(-70~-80℃) 상태에서 하룻밤 동안 방치하여 두었다.

동결된 해삼 추축물을 동결건조기(-70~-80℃)에서 48~72시간 동안 건조 공정을 거쳤다.

동결건조분을 분쇄기 및 mesh(망체)를 통과시켜서 추출물 분말을 획득하였다.

< 실험예 > 해삼을 이용한 기능성 원료의 활성 확인

< 실험예 1> 항염 활성

상기 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료 및 비교예의 해삼 추출물을 사용하여 항염 활성 확인 실험을 수행하였다.

<1-1> 세포 독성 실험

상기 실시예를 통하여 제조한 원료의 세포 독성 여부를 확인하기 위하여 RAW 264.7 대식세포주를 배양하여 사용하였다. RAW 264.7 대식세포주는 면역에 관여하는 세포로, 통상적으로 염증 반응과 관련된 물질의 활성을 측정하기 위하여 사용하는 세포이다. 우태아혈청(fetal bovine serum)이 10% 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지에서 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 4.0X10^4 로 분주하고 5% 이산화탄소, 37℃ 항온기에서 12시간 동안 배양하였다.

세포가 안정화된 후에 각 시료를 0, 10, 50, 100ug/ml의 농도로 처리하고 24시간 동안 배양한 후, WST-1 assay kit를 사용하여 반응시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하였으며 아무것도 처리하지 않은 군(0ug/ml)에 대한 백분율로 세포 생존율을 [표 1]에 나타내었다.

	0ug/ml	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
비교예	100	102.2	104.5	106.9
실시예	100	97.9	106.0	121.1

상기 [표 1]에서 확인할 수 있듯이, 실시예의 해삼 효소처리물과 비교예의 해삼 추출물은 세포 독성을 10 ~ 100ug/ml 농도 범위 내에서 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다.

<1-2> NO 생성 억제 효과 확인

LPS(lipopolysaccharide)는 대식세포에서 염증반응을 일으키며 이에 따라 과산화질소 및 NF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-6(Interleukin-6), IL-1β(Interleukin-1β) 등과 같은 염증성 사이토카인을 생성하는 작용이 알려져 있다.

상기 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료의 항염효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 대식세포주를 사용하여 NO 생성을 확인하는 실험을 수행하였다. RAW 264.7 세포를 1.0 X 10^4 으로 96웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양한 후 각 시료를 0, 10, 50, 100ug/ml의 농도로 처리하였다. 동시에 LPS를 1ug/ml의 농도로 처리하였으며 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양액으로 유리되는 NO의 양을 확인하기 위하여 50ul의 배양액을 동량의 그리스 시약(Griess reagent, Sigma사)과 혼합하였으며 15분간 상온에서 반응시킨 후 ELISA를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 검량선은 NaNO3를 사용하여 작성하였다. 아무것도 처리하지 않은 군(0ug/ml)에 대한 백분율로 NO 생성율을 하기의 [표 2]에 나타내었다.

	0ug/ml	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
비교예	100	92.1	71.5	56.7
실시예	100	88.6	49.2	35.3

상기 [표 2]에 나타나듯이, 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료를 사용하였을 경우 대식세포의 NO 생성이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

<1-3> 염증성 사이토카인 분비 억제효과 확인

상기 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료가 염증성 사이토카인 분비에 끼치는 영향을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에서 IL-6 및 IL-8의 생성량을 확인하였다. RAW 264.7 세포를 2.0 X 10^5 으로 24웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양한 후 각 시료를 0, 10, 50, 100ug/ml의 농도로 처리하였다. 동시에 LPS를 1ug/ml의 농도로 처리하였으며 24시간 동안 추가로 배양한 후 ELISA 방법(R&D systems)을 이용하여 450nm에서 IL-6 및 IL-8의 농도를 측정하였다. 해당 결과를 아무것도 처리하지 않은 군(0ug/ml)에 대한 백분율로 하기의 [표 3] 및 [표 4]에 나타내었다.

IL-6 생성량(%)

	0ug/ml	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
비교예	100	83.1	69.4	49.2
실시예	100	82.6	48.6	32.0

IL-8 생성량(%)

	0ug/ml	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
비교예	100	94.3	80.2	72.7
실시예	100	92.1	74.6	63.1

상기 [표 4] 및 [표 5]에서 나타나듯이, IL-6 및 IL-8 염증성 사이토카인의 분비가 실시예의 해삼 기능성 원료를 사용하였을 경우에 비교예에 비하여 확연하게 감소하였다.

따라서, 본 발명의 해삼 기능성 원료를 사용하는 경우, 해삼 일반 추출물보다 뛰어난 항염 활성을 보이는 것을 확인할 수 있다.

< 실험예 2> 피부 미백 활성

상기 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료 및 비교예의 해삼 추출물을 사용하여 피부 미백 활성 확인 실험을 수행하였다.

피부의 색은 혈관 분포와 혈색소, 각질층의 두께 및 카로틴, 멜라닌(melanin) 등 여러가지에 의하여 좌우되는데 멜라닌의 분포상태 및 양이 주된 영향을 끼친다. 따라서 미백 효과를 검증하기 위해서는 멜라닌 생성 억제 여부를 증명하는 것이 중요하다.

B16F10 마우스 멜라노마(melanoma) 세포를 6웰 플레이트에 5.0×10^4 cell/㎖씩 분주하였으며 10 % FBS와 1 %의 항생제를 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2로 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 배양했다. 다음날, 기존의 배지를 제거하고 새로운 배지에 시료를 농도별(0, 10, 50, 100ug/ml)로 멜라닌 생성 반응을 유도하는 α-MSH(200nM)와 함께 처리하였다. 2일간 배양 후 새 배지로 교체하여 2일간 더 배양하였다. 배양액을 제거한 후 인산완충용액(PBS)로 2회 세척하였으며 10% 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO)가 포함된 1 N 수산화나트륨(NaOH)을 처리하여 80℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 그런 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 합성한 멜라닌 용액을 이용하여 스탠다드 곡선을 그린 후, 측정값을 대입하여 멜라닌 생성량을 계산하였으며 아무것도 처리하지 않은 군(0ug/ml)에 대한 백분율 평균값을 [표 6]에 나타내었다. α-MSH을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

	대조군	0ug/ml	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
비교예	14.2	100	90.1	67.4	38.1
실시예	14.0	100	89.3	43.9	21.5

상기 [표 6]의 결과에 나타나듯이, 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료를 사용할 경우 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 비교예의 해삼 추출물보다 높았으며 농도 의존적으로 활성이 증가하는 경향을 나타내었다.

< 실험예 3> 주름 개선 활성

상기 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료 및 비교예의 해삼 추출물을 사용하여 피부 주름 개선 활성 확인 실험을 수행하였다.

<3-1> 엘라스타제 활성 저해 효과 확인

피부에서 엘라스틴(elastin)은 콜라겐(collagen)과 함께 주요한 탄력 섬유 구성성분 중 하나이다. 따라서 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스타제(elastase)의 억제 활성을 통하여 피부 주름 개선 효과를 확인할 수 있다.

엘라스타제를 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹여 2.5 unit/ml의 용액을 만들었다. N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide 5 mg을 50 mM tris-HCl buffer 1 ml에 녹여 스탁 용액(stock solution)을 만들고, N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(0.5 mg/ml)로 희석하여 사용하였다. 96 웰 플레이트에 시료를 농도별(0, 10, 50, 100ug/ml)로 첨가한 후 엘라스타제를 가하고 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 100ul씩 첨가했다. 반응액은 37℃에서 20분간 배양한 후에 410 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기의 식과 같이 엘라스타제 저해율을 계산하였다. 그 결과는 [표 7]에 나타내었다.

엘라스타제 저해율(%) = (1-시료 농도별 흡광도/무첨가군(0ug/ml)의 흡광도) × 100

	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
비교예	17.2	28.7	49.1
실시예	18.4	52.6	73.3

상기 [표 7]에 나타난 바와 같이, 실시예를 통하여 제조한 해삼 기능성 원료를 사용할 경우 엘라스타제 활성을 억제하는 효과가 비교예의 해삼 추출물보다 높았으며 농도 의존적인 결과를 나타내었다.

<3-2> 세포내 콜라게나제 활성 억제 효과 확인

피부의 탄력을 부여하는데 주요하게 작용하는 콜라겐을 분해하는 콜라게나제(collagenase)의 활성 억제 효과를 세포 실험을 통하여 확인하였다.

인간 정상섬유아세포(Human normal fibroblast)를 DMEM 배지가 들어있는 6웰 플레이트에 2.0 x 10^5 세포로 분주하고 5% 농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 각 웰에서 배지를 제거하고 농도별(0, 10, 50, 100ug/ml)로 시료를 처리하였으며 콜라게나제 활성 유도 물질인 phorbol myristate acetate(PMA,Sigma)도 함께 처리하였다. 추가적으로 24시간 동안 배양한 후, 세포 배지를 수집하여 샘플을 제조하였다. 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게나제의 활성 정도를 측정하기 위하여 콜라게나제에 대한 항체를 사용하여 실험을 수행하였다. Biotrak™ MMP-1 활성 어세이 키트(GE healthcare)의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였으며, 405nm의 흡광도로 측정하였다. 콜라게나제의 활성을 해당 결과를 아무것도 처리하지 않은 군(0ug/ml)에 대한 백분율로 하기의 [표 8]에 나타내었다.

	0ug/ml	10ug/ml	50ug/ml	100ug/ml
비교예	100	87.2	74.1	59.7
실시예	100	86.5	63.7	37.6

상기 [표 8]의 결과에 나타나듯이, 실시예와 같이 제조한 해삼 기능성 원료를 처리했을 경우 일반 해삼 추출물을 처리했을 때보다 콜라게나제 활성이 큰 폭으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 해삼 기능성 원료를 사용하는 경우, 해삼 일반 추출물보다 뛰어난 주름 개선 효과를 보일 수 있다.

Claims (7)

1. 담체와, 해삼의 세린 프로테아제 처리물로 구성된 유효 성분을 포함하고,
   상기 세린 프로테아제 처리물은,
   (a) 해삼의 내장을 제거하고 세척하여 분쇄한 해삼 분쇄물에 물을 첨가하여 반응액을 형성하는 단계,
   (b) 상기 반응액에 세린 프로테아제를 처리하는 단계,
   (b) 상기 세린 프로테아제 처리된 해삼을 여과 및 농축하는 단계, 및
   (c) 상기 여과 및 농축된 해삼을 동결건조하는 단계
   에 의하여 얻어지고,
   상기 프로테아제를 처리하는 단계 이전에 상기 해삼 및 상기 해삼 분쇄물에 열처리, 추출 및 침전 공정을 수행하지 않고,
   상기 프로테아제를 처리하는 단계는 상기 세린 프로테아제를 총 부피의 0.01%(v/v) ~ 5%(v/v)의 농도로 20℃ ~ 80℃의 온도에서 30분 ~ 12시간 동안 처리하고,
   상기 해삼을 여과하는 단계에서는 활성탄을 첨가하여 여과하며,
   상기 담체는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 중 적어도 하나를 포함하는 미백용 화장품 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 세린 프로테아제를 처리하는 단계는 상기 세린 프로테아제를 총 부피의 0.1%(v/v) ~ 1%(v/v)의 농도로 55℃ ~ 70℃의 온도에서 1시간 ~ 3시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장품 조성물.
   
4. 담체와, 해삼의 세린 프로테아제 처리물로 구성된 유효 성분을 포함하고,
   상기 세린 프로테아제 처리물은,
   (a) 해삼의 내장을 제거하고 세척하여 분쇄한 해삼 분쇄물에 물을 첨가하여 반응액을 형성하는 단계,
   (b) 상기 반응액에 세린 프로테아제를 처리하는 단계,
   (b) 상기 세린 프로테아제 처리된 해삼을 여과 및 농축하는 단계, 및
   (c) 상기 여과 및 농축된 해삼을 동결건조하는 단계
   에 의하여 얻어지고,
   상기 프로테아제를 처리하는 단계 이전에 상기 해삼 및 상기 해삼 분쇄물에 열처리, 추출 및 침전 공정을 수행하지 않고,
   상기 프로테아제를 처리하는 단계는 상기 세린 프로테아제를 총 부피의 0.01%(v/v) ~ 5%(v/v)의 농도로 20℃ ~ 80℃의 온도에서 30분 ~ 12시간 동안 처리하고,
   상기 해삼을 여과하는 단계에서는 활성탄을 첨가하여 여과하며,
   상기 담체는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 중 적어도 하나를 포함하는 주름 개선용 화장품 조성물.
   
5. 삭제
6. 제 4항에 있어서,
   상기 세린 프로테아제를 처리하는 단계는 상기 세린 프로테아제를 총 부피의 0.1%(v/v) ~ 1%(v/v)의 농도로 55℃ ~ 70℃의 온도에서 1시간 ~ 3시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장품 조성물.
   
7. 삭제