KR101943300B1 - 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 개선하기 위한 조성물 - Google Patents
포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 개선하기 위한 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 방지 또는 개선하기 위한 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 일 양상에 따른 포포나무 초음파 추출물은 활성산소 감소 효과, 섬유아세포 세포의 증식 증가 효과, 리폭시게네이스 활성 억제 효과 및 티로시네이스 활성 억제효과를 가진다. 따라서, 포포나무의 초음파 추출물은 자유 라디칼의 소거, 미백, 항산화 효과 및 항염증 효과를 가져 피부 손상을 개선하는데 유용하다.
Description
피부 손상을 방지 또는 개선하기 위한 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 과도한 자외선이나 오염물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부자극 및 염증반응이 유발되어 피부가 손상된다. 또한, 최근에는 피부 손상에 자유라디칼이 상당한 기여를 하는 것이 알려지고 있다.
자유라디칼은 세포를 파괴하거나 피부 진피층의 결합조직을 절단하거나 교차 결합을 일으키므로 주름형성, 피부암, 세포 살상, 류마티스성 관절염, 아토피성 피부염, 여드름 등 여러 가지 문제를 발생시킨다. 자유라디칼이 증가하면 진피의 결합조직인 콜라겐(Collagen), 엘라스틴 (Elastin), 히아루론산(Hyaluronic acid) 등을 파괴하여 피부의 일정 부위 침하 현상(즉, 주름)을 일으키며, 또한 세포막의 지질 부분을 산화시켜 세포의 파괴 현상을 일으켜 피부염, 여드름, 피부암 등의 질병을 유발하게 된다. 자유라디칼은 멜라닌 형성 과정 중 자발적인 산화반응(도파퀴논멜라닌)에 관여하여 기미, 주근깨 등의 원인 및 주름생성의 원인이 되기도 한다(대한 화장품학회지 23권 1호 75~132).
한편, 염증은 해로운 주위 환경, 즉 세균과 같은 외부 이물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하는 생리적인 반응인데, 과도한 염증 반응 또한 피부 손상의 주요 원인이다. 염증이 발생하면, 여러 종류의 다핵형 백혈구(PMNs)와 면역 물질의 증가를 초래하고, 이들 세포들은 염증성 세포 산물인 다양한 종류의 단백질 분해효소(엘라스테이스, 히알루리니데이스 및 리폭시게네이스 등)와 사이토카인(cytokine)을 분비하게 된다. 이후 이들의 작용은 인접해 있는 조직 세포와 비 조직세포 성분들에게도 해로운 손상을 일으키고, 만성염증의 심각한 조직 손상을 가져올 수 있다. 또한, 결합 조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라 나아가 세포의 재생 및 증식에도 나쁜 영향을 미치게 되어 빠른 피부노화를 초래하게 된다.
이러한 자유라디칼 또는 염증에 의한 피부 손상을 회복시키기 위해 여러 천연물 추출물 등이 개발되고 있다. 다만, 기존의 일반적인 천연물 추출 방법인 열수추출법은 에너지 소비가 많고, 열로 인한 많은 약효 성분의 파괴와 손실 등의 단점이 있었다. 따라서, 이러한 자유라디칼과 염증에 의한 피부 트러블의 개선을 위해효과가 우수하며, 부작용이 없는 천연 추출물의 개발 및 최적의 추출 방법에 대한 요구가 있었다.
일 양상은 포포나무 초음파 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 방지 또는 개선하기 위한 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 방지 또는 개선하기 위한 건강기능식품용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상은 포포나무 초음파 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 방지 또는 개선하기 위한 화장료 조성물을 제공한다. 다른 양상은 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 방지 또는 개선하기 위한 건강기능식품용 조성물을 제공한다. 다른 양상은 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
용어 "피부 손상"은 외부의 물리적 손상, 화학 물질, 세균, 곰팡이, 바이러스 등의 침투, 자외선에 대한 노출, 피부의 수분 손실, 노화 등에 의한 주름, 자유라디칼(활성산소) 등에 의한 산화, 피부 색소 침착, 피부 염증, 지루성 피부염, 붉어짐(발적, 홍반), 부종, 태선화, 습진, 소양감(가려움), 및 아토피 피부염 등을 포함하는 피부 조직 또는 세포의 임상적 및 미용적 관점에서의 손상을 포함한다. 상기 피부는 얼굴, 손, 팔, 다리, 발, 가슴, 배, 등, 엉덩이, 및 두피를 포함하는 신체의 모든 피부 부위를 포함한다.
포포나무는 목련목(Magnoliales) 포포나무과(Annonaceae)에 속하는 낙엽교목 또는 관목으로, papaw, pawpaw, paw paw 등 이라고도 쓰이며, 아시미나 트릴로바(Asimina triloba) 등의 학명을 갖는 식물을 포함한다. 미국이 원산지로 대서양 연안에서 북쪽으로 뉴욕 주까지, 서쪽으로 미시간과 캔자스 주에 이르는 지역에 주로 분포한다. 키가 12m까지 자라며, 늘어지는 잎은 넓고 긴 타원형으로 끝이 뾰족하고 길이가 30㎝에 이른다. 다른 아시미나속(Asimina)에 속하는 포포나무로는 아시미나 스페키오사(A. speciosa)와 아시미나 앙구스티폴리아(A. angustifolia) 등이 있다.
상기 포포나무 추출물은 그 수목의 지상부의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료로부터 용매에 의하여 추출된 추출물일 수 있다. 상기 일부분은 수목의 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 꽃잎, 종실(씨앗), 과육, 열매 껍질 또는 열매일 수 있다. 추출에 사용된 상기 수목의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료는 분쇄 또는 세절되거나 적당하게 건조된 것일 수 있다.
상기 추출물은 물, 아세톤, 알콜, 예를 들면, C1-C6 알콜, C3-C6의 다가 알콜 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출한 것일 수 있다. 상기 C1-C6 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1,3-프로판디올, 부탄올, 펜탄올, 또는 헥산올을 포함한다. 상기 용매는 예를 들면, 물과 알콜의 혼합물, 즉 알콜 수용액일 수 있다. 알콜 수용액의 알콜 농도는 1 내지 100(w/w)%, 예를 들면, 1 내지 99.5(w/w)%, 10 내지 90(w/w)%, 10 내지 80(w/w)%, 10 내지 70(w/w)%, 10 내지 60(w/w)%, 10 내지 50(w/w)%, 10 내지 40(w/w)%, 10 내지 30(w/w)%, 또는 20(w/w)%일 수 있다. 상기 알콜 수용액은 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올 수용액일 수 있다. 상기 알콜 수용액은 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올 수용액일 수 있다.
상기 추출물은 가온 추출, 가압 추출, 초음파 추출, 열수 추출, 환류 냉각 추출, 아임계 추출, 또는 초임계 추출 등 당업계에서 통상적인 방법으로 추출된 것일 수 있다. 상기 추출은 4 내지 70, 예를 들면, 4 내지 50, 4℃ 내지 40, 4℃ 내지 30, 10℃ 내지 70, 15℃ 내지 70, 20℃ 내지 70, 4℃ 내지 50, 10℃ 내지 50, 4℃ 내지 40, 4℃ 내지 30, 10℃ 내지 40, 10℃ 내지 35, 또는 10 내지 30, 또는 상온에서 수행하는 것일 수 있다. 상기 추출 시간은 선택된 온도 및 추출 방법에 따라 달라질 수 있는데 1시간 내지 3일, 1시간 내지 2일, 1시간 내지 1일, 5시간 내지 3일, 5시간 내지 2일, 5시간 내지 1일, 10시간 내지 3일, 15시간 내지 2일, 15시간 내지 36시간, 18시간 내지 30시간, 1일 내지 3일, 1일 내지 2일, 또는 24시간일 수 있다. 예를 들면, 식물체 건조물을 실온에서 추출 용매에 12시간 내지 48시간 동안 침적한 후 1시간 내지 8시간 초음파 추출할 수 있다.
초음파 추출하는 경우, 초음파 추출기에 식물체 건조 분쇄물을 투입하고 초음파를 가하여 추출할 수 있다. 이 때 초음파가 포포나무 분쇄물에 잘 전달될 수 있도록 위치를 조정하고 초음파를 작동하여 추출할 수 있다. 적용되는 초음파는 5 내지 60 kHz 또는 5 내지 30 kHz일 수 있으며, 초음파 추출기의 출력을 100 watt 내지 700 watt로 조정하여 추출할 수 있다.
상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1회 내지 5회 반복될 수 있으며, 각 추출은 동일한 방법으로 수행되거나, 다른 방법으로 수행될 수 있다. 상기 추출은 식물체 잔여물 및 추출액을 여과 등의 알려진 방법에 의하여 분리하는 과정을 더 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 질소 건조 또는 동결 건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출물은 농축액의 형태, 또는 건조된 이후 필요에 따라 DMSO 등 적절한 용매로 재용매화된 형태, 또는 동결 건조되어 분체화된 형태일 수 있다.
상기 조성물은 상기 추출물의 분획물을 더 포함할 수 있다. 분획물(fraction)은 상기 추출물이 그 일부의 성분으로 나누어진 물질, 즉 분획화(fractionation)되어진 물질을 의미하며, 당업계에 통상적으로 알려진 방법에 따라 분획화하여 얻을 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 포포나무 추출물을 포함할 수 있다. 상기 범위에서 0.01 중량% 미만일 경우 피부 손상 개선 효과가 미약하게 될 우려가 있어 바람직하지 못하며, 60 중량%를 초과하는 것은 경제성, 또는 제형 제조 측면에서 바람직하지 못할 수 있다.
상기 조성물은 그 용도에 따라 상기 추출물을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 추출물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 조성물이 화장료 조성물인 경우, 추출물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 유화제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
상기 추출물은 피부 손상 방지 또는 개선용 피부 외용제 조성물일 수 있다. 상기 피부 외용제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저의 제형을 포함한다.
상기 조성물이 건강기능식품용 조성물인 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품용 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
상기 건강기능식품용 조성물 중의 상기 추출물의 함량은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 함유할 수 있다.
상기 음료는 상기 추출물 이외의 다른 성분을 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 음료에 사용되는 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 단당류(예: 포도당, 과당 등), 이당류(예: 말토즈, 수크로즈 등), 다당류(예: 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 함유될 수 있다. 또한, 향미제로서 천연 향미제(예: 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예: 사카린, 아스파탐 등)를 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 음료 100 mL 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g으로 함유될 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물인 경우, 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미정질 셀룰로오스, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분 글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
본 발명자는 포포나무 추출물을 이용한 실험에서, 상기 추출물의 활성산소 감소 효과, 섬유아세포 세포의 증식 증가 효과, 리폭시게네이스 활성 억제 효과 및 티로시네이스 활성 억제효과를 확인하였다. 섬유아세포는 특히 피부의 진피에 주로 많이 분포하여, 섬유아세포의 증식을 증진시키면 피부 조직의 회복에 도움이 될 수 있다. 리폭시게네이스는 피부 염증 반응에 참여하는 지질 분해효소로서, 이의 활성을 저해시키는 것으로 피부 염증 반응을 감소시킬 수 있다. 티로시네이스는 멜라닌의 합성에 참여하는 효소로서, 이의 활성을 저해시키는 것으로 피부 색소 침착을 방지하고 피부 미백 효과를 나타낼 수 있다. 아울러, 포포나무 추출물을 이용한 in vitro 실험에서, 포포나무 추출물의 가려움증 인자(TSLP, TARC) 및 염증성 인자(IL-6, 8)의 발현 저해 효과와, 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였다. 따라서, 상기한 바와 같이 포포나무 추출물은 피부 손상을 방지, 예방, 개선 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
일 양상에 따른 포포나무 초음파 추출물은 활성산소 감소 효과, 섬유아세포 세포의 증식 증가 효과, 리폭시게네이스 활성 억제 효과 및 티로시네이스 활성 억제 효과, 가려움증 인자(TSLP, TARC) 및 염증성 인자(IL-6, 8)의 발현 저해 효과, 멜라닌 생성 억제 효과를 가져 피부 손상을 개선하는데 유용하다.
도 1은 포포나무 추출물의 DPPH를 이용한 항산화 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 포포나무 추출물이 멜라닌 생성을 저해하는 효과가 있는 것을 나타낸다.
도 3은 포포나무 추출물이 TSLP 및 TARC의 mRNA 수준을 낮추는 효과가 있는 것을 나타낸다.
도 4는 포포나무 추출물이 IL-6 및 IL-8의 mRNA 수준을 낮추는 효과가 있는 것을 나타낸다.
도 2는 포포나무 추출물이 멜라닌 생성을 저해하는 효과가 있는 것을 나타낸다.
도 3은 포포나무 추출물이 TSLP 및 TARC의 mRNA 수준을 낮추는 효과가 있는 것을 나타낸다.
도 4는 포포나무 추출물이 IL-6 및 IL-8의 mRNA 수준을 낮추는 효과가 있는 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
포포나무
초음파 추출물의 제조
건조한 포포나무 잎 100 g을 에탄올 1L(20(w/w)%)에 넣고 혼합하여 약 24시간 동안 침적하였다. 포포나무 잎은 마이산 농원에서 구매하여 사용하였다. 상기의 포포나무 침적물을 초음파 추출기(K-CORPORATION)에 넣고 초음파 추출을 진행하였다. 초음파가 고르게 전달될 수 있도록 포포나무 잎 추출물이 함유된 비커의 위치를 조정하고 추출기의 온도는 30로 유지하며 초음파의 출력을 100-500 watt까지 올려 약 2시간 추출하였다. 이 때 초음파의 진동수는 20 kHz였다.
추출액을 0.8 ㎛ 필터로 여과하여 포포나무 잎 추출물을 얻었다. 여과한 포포나무 잎 추출물을 1주일간 실온에서 방치하고 0.45㎛ 필터로 다시 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 60에서 완전히 농축하여 추출물을 수득하였다.
비교예
1.
포포나무
열 추출물의 제조
건조한 포포나무 잎 100 g을 에탄올 1L에 넣고 혼합하여 환류장치 하에서 3시간 끓여서 추출하였다. 300 메쉬 필터로 여과하고, 1주일간 방치하여 침전물을 얻은 뒤, 다시 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50에서 완전히 농축하여 추출물을 수득하였다.
실험예
1.
포포나무
잎 추출물에 의한 세포 증식 및 독성 확인
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 포포나무 잎 추출물의 건조분말을 이용하여 세포 증식에 미치는 영향과 독성을 확인하였다. 구체적인 방법은 아래와 같다.
섬유아세포 세포주 3T3 세포를 96 웰 마이크로플레이트에 5,000 세포/웰로 분주하여 30분간 항온조에서 배양하고, 시료를 농도별로 각각(10, 30, 50, 70, 90, 100 ppm) 투여하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후, 티아졸린 블루(Thiazoline blue)를 투여하고 4시간 동안 추가 배양을 하였다. 배양액을 모두 버리고 마이크로플레이트의 각 웰에 반응 정지액을 가하고 5분간 교반한 후, 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 주입량만큼 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 배지를 투여하여 세포 성장의 최적 조건으로 동시배양을 하였으며, 대조군의 세포증식을 100%로 하고 시료 투입 실험군의 세포 증식율을 상대적으로 계산하였다. 세포증식 효과는 아래 계산식 1에 의해 산출되었고, 그 결과는 아래 표 1에 나타내었다.
<계산식 1>
<표 1> 포포나무 잎 추출물에 의한 세포 증식 및 독성
표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 포포나무 잎 추출물은 모두 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한, 실시예 1의 추출물은 비교예 1의 추출물보다 월등한 세포 증식효과를 나타내었으며, 실시예 1의 추출물이 가장 우수한 세포 증식효과를 나타내었다.
실험예
2.
포포나무
잎 추출물에 의한
리폭시게네이스
활성 억제 효과 확인
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 포포나무 잎 추출물 건조분말을 이용하여 리폭시게네이스 활성 억제 효과를 확인하였다. 구체적인 방법은 아래와 같다.
TBAs(TNF-α blocking agents)법을 사용하여 실험을 수행하였으며, 실험에 사용하는 리놀레산(Linoleic acid)과 리폭시게네이스, 티오바르비투르산(Thiobarbituric acid)은 시그마(SIGMA) 사의 것을 사용하였다. 1 mM 리놀레산 1 ml에 여러 농도(10, 30, 50, 70, 90, 100 ppm)의 실시예 1과 비교예 1을 각각 0.05 ml씩 첨가하고 리폭시게네이스 0.95 ml를 투여 후 교반하여 25에서 10분간 반응시켰다.을 시킨다. 그리고 트리클로로아세트산을 0.5 ml, 티오바르비투르산을 1 ml 첨가한 후, 10분간 가열하고 얼음물에서 2~3분간 냉각시켜 반응을 종료시킨다. 반응이 종결된 반응액에 부탄올 2 ml를 넣고 4,000 g로 5분간 원심분리한 후 535 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 계산식 2를 이용하여 리폭시게네이스 활성억제 효과를 구하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
<계산식 2>
<표 2>
표 2에 나타낸 바와 같이 초음파 추출법으로 추출한 포포나무 잎 추출물인 실시예 1의 리폭시게네이스 활성억제효과가 비교예 1에서 제조된 포포나무 잎 추출물의 리폭시게네이스 활성억제 효과보다 우수한 것을 확인할 수 있었다
실험예
3.
포포나무
잎 추출물에 의한
티로시네이스
활성 억제 효과 실험
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 포포나무 잎 추출물 건조분말을 이용하여 티로시네이스(Tyrosinase) 활성 억제 효과를 확인하였다.
먼저 시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 ㎕와 상기 농도 별 시료액 20 ㎕ 그리고 머쉬룸타이로시네이스(1500 U/mL)액 20 ㎕를 순서대로 넣었다. 이 용액에 1.5 mM 타이로신액 40 ㎕를 넣고 37에서 10-15분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 알부틴을 사용하여 상기와 동일한 실험을 수행한 후, 아래 계산식 3에 의하여 티로시네이스 활성 저해도를 계산하였다. 그 결과는 표 3에 나타나있다.
<계산식 3>
<표 3>
표 3에 나타낸 바와 같이 초음파 추출법으로 추출한 포포나무 잎 추출물인 실시예 1의 티로시네이스 활성억제효과가 비교예 1에서 제조된 포포나무 잎 추출물의 티로시네이스 활성억제 효과보다 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한 양성 대조군으로 사용한 알부틴보다 티로시네이스 활성억제 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실험예
4.
포포나무
추출물의
DPPH
감소 효과 확인
실시예 1과 비교예 1에서 제조된 포포나무 추출물을 이용하여 활성 산소 감소 효과를 확인하였다. 구체적으로 메탄올에 녹인 DPPH(1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl radical) 용액 0.9 ml에 실시예 1 또는 비교예 1의 추출물 0.1 ml를 첨가하고, 실온에서 방치하였다. 이후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 상대적인 항산화 능력을 비교하였다. 양성 대조군으로는 아스코르브산 100 μg/ml를 이용하였으며, 무처리군에는 물 0.1 ml를 첨가하였다.
그 결과는 도 1과 같다. 실시예 1의 포포나무 초음파 추출물은 무처리군에 대비하여 65% 증가한 항산화 효과를 나타내었으며, 에탄올 추출물에 비하여도 약 20% 증가한 항산화 효과를 나타내었다(11%p 증가).
실험예
5.
포포나무
추출물의 색소 세포 내 멜라닌 생성 억제 효과 확인
쥐의 색소 세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 비교예 1 및 실시예 1의 추출물에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였으며, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴 (100 μM)에 의한 멜라닌 생성 억제효과와 비교하였다. 구체적으로는 아래와 같다.
B16 F10 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM에 현탁시켜 웰당 1 x 105 세포로 6-웰 플레이트에 접종하여 웰 바닥에 부착될 때까지 배양한다. 멜라닌 생성 유도를 위하여, 0.1 μM α-MSH를 처리하고, 이후 시료를 농도별로 첨가한 후 3일간 배양하였다. 물질 처리의 농도범위는 0.1%, 1% 로 설정하였다. 멜라닌 생성능 실험의 양성대조군으로 알부틴 100 ppm 을 처리하였다. 배양한 세포는 PBS으로 씻고 트립신으로 회수하였다. 회수한 세포를 혈구계(hematocytometer)로 계수하여 각 처리 그룹별로 1 x 106 cells/mL으로 동일한 세포수가 되도록 모아 1000rpm, 10분간 원심분리하여 세포만을 얻었다. 회수된 세포를 60에서 1시간 건조시켜 10% DMSO가 포함된 1M NaOH용액 100 ㎕을 넣어 세포내의 멜라닌을 얻었다. 이 멜라닌 액을 Microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 저해율을 평가하였다.
실험예
6.
포포나무
추출물을 이용한
TSLP
,
TARC
, 및
IL
-6, 8
저해능
시험
6.1. 세포 배양
사람 각질형성세포주인 HaCaT (ATCC, Rockville, MD, USA)를 10%의 소태아 혈청 (FBS, ATCC, Rockville, MD, USA)와 1%의 antibiotic/antimycotic (AA, ATCC, Rockville, MD, USA)을 첨가한 DMEM (HyClone, Logan, UT, USA)을 이용하여 37 , 5%, CO2조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 세포는 2-3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다
6.2.
mRNA
발현 조사(
Real
Time
RT-
PCR
)
사람 각질형성세포주인 HaCaT를 6-well plate에 5 × 105 cells/well접종하여 10%의 FBS와 1%의 AA가 첨가된 배지를 이용하여 24 시간 배양하였다. 그 후 Sporichthyaceae bacterium, Poly I:C, IL-4를 FBS가 첨가되지 않은 배지에 24 시간 동안 추가 배양하였다. Total RNA를 추출하기 위해 각 웰에 RNA iso (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) 1 mL을 첨가하여 세포를 용해시키고 클로로포름 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 200 μL를 첨가하여 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 취하여 새로운 튜브에 옮기고 같은 양의 이소프로판올 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 첨가한 후 14,000 rpm에서 10 분 원심 분리하여 RNA를 분리하였다. 99% 에탄올 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 7,500 rpm에서 원심 분리하여 2회 세척하고 건조시킨 후 DEPC 수 (Ambion, Austin, TX, USA)에 녹였다. Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용해 RNA를 정량 하였고, total RNA 2 μg을 DEPC와 함께 70에서 5분 동안 가열한 후 reverse transcription premix (ELPIS-Biotech, Daejeon, Korea)에 넣고 최종 부피가 20 μL가 되도록 하였다. 42 에서 55분, 70에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하여 PCR에 사용하였다. 얻어진 cDNA로부터 유전자들을 증폭시키기 위해 5배 희석시킨 cDNA 2 μL를 프라이머 1 μL, DEPC 7 μL, SYBR Green master mix (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 10 μL와 함께 StepOne Plus RT-PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 반응 조건은 50 2분, 95 10분에서 반응 후 95 10초와 60 1분을 40회 반복하여 증폭시켰다. 이용된 프라이머 서열은 아래 표 4와 같다.
<표 4> 프라이머 서열
6.3.
TSLP
,
TARC
,
IL
-6, 8
저해능
시험
포포나무 추출물이 인간 각질형성세포 HaCaT에서 발생하는 염증성 싸이토카인과 케모카인의 발현에 미치는 감소 효과를 확인하기 위하여, 흉선 기질상 림포포이에틴(Thymic stromal lymphopoietin: TSLP), 흉선 및 활성-조절 케모카인(Thymus- and activation-regulated chemokine: TARC), IL-6, 및 IL-8 각각의 유전자 발현 정도를 평가하였다.
세포를 6웰 플레이트에 분주하고 배양 24시간 후, 인산 완충 식염수 용액(PBS)로 세척하고, 각 웰에 FBS를 넣지 않은 DMEM 배지에 Poly I:C 및 IL-4을 넣어 염증을 유도시켰다. 이후, 실시예 1 및 비교예 1의 포포나무 추출물을 최종 농도가 10 ppm이 되도록 희석시켜 각 웰에 첨가하였다. 양성 대조군은 덱사메타손 1 μM을 처리하였다.
그 결과는 도 3 및 도 4와 같다. 도 3은 포포나무 추출물이 TSLP 및 TARC의 mRNA 수준을 낮추는 효과가 있는 것을 나타낸다. 도 4는 포포나무 추출물이 IL-6 및 IL-8의 mRNA 수준을 낮추는 효과가 있는 것을 나타낸다.
<110> Cosmax Co., Ltd.
KIM, EUN KYUNG
<120> Composition comprising ultrasonic extracts of papaw for improving
skin damage
<130> pn117316
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
cttaagggtt gcttgcttgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 2
gttcgtggga gatgaaggaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 3
tacccccagg agaagattcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 4
ttttctgcca gtgcctcttt 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 5
ccaacacaga aattattgta aagc 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 6
tgaattctca gccctcttca a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 7
gctatctggt gcccaggcta t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 8
cgacgccaca atccttgtaa t 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 9
cttctctgca gcacatcc 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 10
aagacctctc aaggctttg 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 11
ggccatctct tgctcgaagt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 12
gacaccttca acaccccagc 20
Claims (12)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 가려움증 또는 아토피 피부염을 방지 또는 개선하기 위한 화장료 조성물.
- 삭제
- 청구항 4에 있어서, 상기 추출물은 에탄올 추출물인 화장료 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 에탄올의 농도는 10 내지 30 (w/w)%인 화장료 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 초음파의 진동수는 5 내지 30 kHz인 화장료 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 추출물은 포포나무의 잎 추출물인 화장료 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 추출물은 리폭시게네이스, 티로시네이스, TSLP, TARC, IL-6 또는 IL-8 중 어느 하나 이상의 활성을 억제하는 것인 화장료 조성물.
- 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 가려움증 또는 아토피 피부염을 방지 또는 개선하기 위한 피부 외용제 조성물.
- 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 가려움증 또는 아토피 피부염을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170054508A KR101943300B1 (ko) | 2017-04-27 | 2017-04-27 | 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 개선하기 위한 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180120487A KR20180120487A (ko) | 2018-11-06 |
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Family Applications (1)
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| KR1020170054508A KR101943300B1 (ko) | 2017-04-27 | 2017-04-27 | 포포나무의 초음파 추출물을 포함하는 피부 손상을 개선하기 위한 조성물 |
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| KR102163865B1 (ko) | 2019-05-30 | 2020-10-12 | 칼리아코 주식회사 농업회사법인 | 가려움증 또는 피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물 |
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-
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