KR102057376B1 - 홍해삼 추출물을 포함하는 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍해삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장품 조성물 및 미백용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 홍해삼 추출물은 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생합성 저해 활성이 뛰어나며, 또한 항산화 활성을 가지고 있어, 피부 미백 용도로 사용하기 위한 화장품, 식품 등으로 활용도가 높다.

Description

홍해삼 추출물을 포함하는 미백용 조성물{COMPOSITION FOR SKIN WHITENING COMPRISING EXTRACT OF STICHOPUS JAPONICAS RED}

본 발명은 홍해삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장품 조성물 및 미백용 식품 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드와 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다. 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다. 신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 자외선을 흡수하여 자외선에 의한 손상으로부터 피부 기관을 보호하며, 피부 내에 발생하는 유해산소나 라디칼 등의 유해 물질을 제거하는 역할을 수행하여 피부를 보호해주는 역할을 한다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다. 따라서, 멜라닌 색소 합성을 억제하기 위해, 멜라노사이트 세포에 대해 특이적으로 작용하는 독성 물질이나, 멜라닌 색소 대사합성 과정에 핵심적으로 관여하는 타이로시나아제 유전자의 발현을 조절하여 피부 미백 및 피부 색소 침착 질환의 치료를 달성하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 현재까지 개발된 피부 색소 침착 질환의 치료제로 파라-메톡시페놀(p-methoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소 세포의 변성 또는 치사를 일으킬 수 있으며, 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 단점이 있다. 또한 멜라닌 생성 억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 저해활성이 낮다는 단점을 가지고 있다. 이에 따라, 소량으로도 멜라닌 생합성 저해활성이 우수하고 부작용이 적은, 피부 미백 용도로 사용하기 위한 천연물의 소재 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 일 목적은 홍해삼 추출물을 포함하는 미백용 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 홍해삼 추출물을 포함하는 미백용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 홍해삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, 용어 "홍해삼"은 학명이 Stichopus japonicus Red 또는 Stichopus japonicus Orange인 해삼을 의미하는 것으로, 순수목(Aspiodchirotida), 돌기해삼과(Stichopodidae), 돌기해삼속(Stichopus)에 속한다. 구체적으로는, 체색(體色)이 적색에 황갈색 또는 암적갈색의 반문이 있고 복부는 적색이며, 폴리씨낭(Polian vesicle)이 가늘고 길며 선단이 뾰족하고, 수축성이 심해서 체형이 구형과 비슷하며, 알에 두께 25㎛ 내외의 젤라틴 피물을 가진 해삼으로 정의될 수 있다. 상기 홍해삼은 일반적으로 암반, 자갈지역(온대성, 제주, 울릉, 추자도 등)에 주로 서식한다.

용어 "추출물"이란, 적절한 추출용매로 추출하여 수득한 결과물을 의미하는데, 상기 결과물은 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액의 분획물, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 등을 모두 포함한다.

용어 "홍해삼 추출물"은 홍해삼으로부터 수득한 추출물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 홍해삼 전체 또는 내장 등의 일부를 제거한 홍해삼으로부터 유래한 추출물일 수 있다.

용어 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

상기 홍해삼 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법을 통해 제조할 수 있으며, 예를 들면 침지, 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 증기 증류 추출, 알콜 추출, 가압 추출, 주정 추출 및/또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게, 상기 홍해삼 추출물은 침지, 열탕 추출, 알콜 추출로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출 방법에 의해 제조될 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 홍해삼 추출물은 침지 추출에 의해 제조될 수 있다. 또한 가장 바람직하게 상기 홍해삼 추출물은 침지 후 가열에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 홍해삼 추출물은 홍해삼을 용매에 침지하는 단계, 상기 침지물을 가열하는 단계; 및 상기 가열 단계로부터 수득된 결과물을 냉각시키는 단계를 포함하는 추출방법에 의해 제조되는 것일 수 있다

상기 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 등), 유기용매(헥산, 아세톤, 클로로포름, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트 등) 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게 상기 추출 용매는 물과 에탄올의 혼합 용매일 수 있다. 또한 상기 추출용매는 보다 바람직하게 50~80%, 55~80%, 60~80%, 60~75%, 55~75%, 또는 60~75%의 에탄올일 수 있으며, 가장 바람직하게 60~75%의 에탄올일 수 있다.

본 발명의 홍해삼 추출물은 보다 바람직하게 홍해삼을 에탄올로 추출한 후 에틸아세테이트로 더 추출한 것일 수 있다. 상기 에틸아세테이트 추출은, 예를 들면 홍해삼의 에탄올 추출물에 에틸아세테이트를 가해 교반하여 상층액 및 남은 에틸아세테이트를 제거하는 방법에 의할 수 있다. 상기 에탄올로 추출된 후 에틸아세테이트로 더 추출된 홍해삼 추출물은 일 실시예에서 열안정성이 높았으며, 홍해삼의 지표물질인 아닐리노 아세트산(anilino acetic acid)의 함유량이 가장 높은 것을 확인하였다.

상기 추출방법에서 상기 침지는 바람직하게 실온에서 24시간 이상 수행될 수 있다. 보다 바람직하게 상기 침지 단계는 분쇄된 홍해삼을 50~80% 알코올 용매에 실온에서 24시간 이상 48시간 이하 동안 침지시키는 것일 수 있다. 상기 추출방법에서 상기 가열 단계는 바람직하게 100℃ 이상의 온도에서 3시간 이상 가열하는 것일 수 있다. 상기 추출방법에서 상기 냉각은 바람직하게 60℃ 이하의 온도에서 3시간 이상 냉각하는 것일 수 있다.

상기 추출방법은 홍해삼을 용매에 침지하는 단계 전에 홍해삼의 내장을 제거하고 세척하는 단계; 세척된 홍해삼을 급속 동결하는 단계; 동결된 홍해삼을 냉장 해동하는 단계 및 홍해삼을 분쇄하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 추출방법은 냉각 단계 이후에 냉각 결과물을 여과하는 단계 및/또는 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 여과는 바람직하게 10㎛의 여과포를 이용하여 여과할 수 있다. 상기 농축 단계는 바람직하게 60℃ 이하의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 농축 단계는 고형분이 20% 이상 40% 미만, 25% 이상 40% 미만, 25% 이상 35% 미만, 또는 30% 이상 40% 미만의 농도를 갖도록 농축할 수 있으며, 바람직하게 고형분이 30% 내외의 농도, 예를 들면 28% 이상 32% 이하의 농도를 갖도록 농축할 수 있다.

상기 홍해삼 추출물은 우수한 티로시나제 활성 저해 활성 및/또는 멜라닌 생합성 저해 활성을 갖는다. 이에 의해 본 발명의 조성물은 피부 미백에 탁월한 효능을 가져 피부 미백용 화장품 조성물로 사용하기 적합하다.

본 발명의 화장품 조성물은 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 더 포함할 수 있다.

상기 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물은 각각 녹차씨, 병풀, 알로에베라잎을 건조 및 파쇄하여 분말한 것을 적용한 추출물일 수 있다. 상기 병풀은 병풀의 종자, 꽃, 잎, 줄기, 및/또는 뿌리로부터 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게, 병풀의 잎 및/또는 줄기로부터 추출한 것일 수 있다. 상기 추출물들은 각각 탄소수 1 내지 4의 알콜, 물, 유기 용매를 이용하여 당업자가 통상의 추출방법을 이용하여 추출한 것일 수 있다. 바람직하게 상기 추출물은 각각 메탄올을 이용하여 추출한 것일 수 있다.

상기 홍해삼 추출물, 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물은 홍해삼 단독 추출물을 포함하는 조성물 또는 2 이상의 조합 추출물과 대비하였을 때, 홍해삼 추출물, 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물의 구성 성분 간 조합에 따른 시너지 효과 때문에 더욱 우수한 피부 미백 효과를 가진다. 또한 본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 각각의 추출물은 모두 천연물로부터 유래된 성분으로 피부 적용시 부작용이 없다.

상기 조성물은 바람직하게 홍해삼 추출물, 녹차씨추출물, 병풀추출물 및 알로에베라잎 추출물을 1 : 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 1.5 : 1 내지 2의 중량비로 포함할 수 있다. 상기 각 추출물 중량비의 조합은 피부 미백 효과에 최적화된 것으로 우수한 피부미백 효과를 갖는다.

본 발명의 화장품 조성물은 유효 성분으로서 홍해삼 추출물이나, 또는 홍해삼 추출물, 녹차씨추출물, 병풀추출물 및 알로에베라잎 추출물의 조합을 포함하는 것 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 들 수 있다.

상기 화장품 조성물은 유효성분인 추출물을 조성물 총 중량에 대해 0.0001 내지 70 중량%, 0.1 내지 60 중량%, 1 내지 50 중량%, 1 내지 40 중량%, 또는 1 내지 30 중량%으로 포함할 수 있으며, 바람직하게 유효성분인 추출물을 1 내지 30 중량%으로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 보다 상세하게는, 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 글리세롤, 글리세린, 지방족 에스테르, 페녹시에탄올, 트리에탄올아민, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 폴리솔베이트 60, 솔비탄세스퀴오레이드, 파라핀, 소르비탄 스테아레이트, 친유형 모노스테아린산 글리세린, 스테아린산, 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트, 카르복시폴리머, 시토스테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 콜레스테롤, 스테아레스-4, 디세틸포스페이트, 마카다미아 오일, 카르복시비닐폴리머, 산탄검 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오즈, 소디움히아루로네이트, 페녹시에탄올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

다른 양태는 홍해삼 추출물을 포함하는 미백용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 홍해삼 추출물은 특별한 언급이 없는 한, 상기 화장품 조성물에서 언급한 바와 같다.

상기 식품은 건강기능성 식품일 수 있다. 용어 "건강기능성 식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

상기 식품 조성물은 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 더 포함할 수 있다. 상기 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물은 상기 화장품 조성물에서 각각 상기한 바와 같다. 바람직하게 상기 조성물은 홍해삼 추출물, 녹차씨추출물, 병풀추출물 및 알로에베라잎 추출물을 1 : 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 1.5 : 1 내지 2의 중량비로 포함할 수 있다. 상기 각 추출물 중량비의 조합은 추출물 조성간에 시너지효과와 함께 피부 미백 효과에 최적화된 중량비로 구성된 것으로 우수한 피부 미백 효과를 갖는다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품 조성물은 피부미백 효과를 증진 또는 피부색소 침착 관련 질환을 개선시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

일 양태에 따른 식품 조성물에 유효성분으로서 포함되는 홍해삼 추출물 또는 혼합 추출물의 양은 사용 목적 (예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 상기 추출물은 원료 조성물 중 0.001 내지 20 중량%, 0.001 내지 15 중량% 또는 0.001 내지 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 건강음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.01 내지 2 g, 구체적으로 0.02 내지 2 g, 보다 구체적으로 0.3 내지 1 g을 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다. 상기 식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품 조성물에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

상기 식품 조성물은 환제, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상의 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명에 따른 해삼 추출물을 함유하는 조성물은 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생합성 저해 활성이 뛰어나며, 또한 항산화 활성을 가지고 있어, 피부 미백 용도로 사용하기 위한 화장품, 식품 등으로 활용도가 높다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 홍해삼 추출물의 세포 생존율을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 홍해삼 추출물 처리 농도에 따른 티로시나제 활성 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 홍해삼 추출물의 티로시나제의 DOPA 산화반응에 대한 활성저해 정도를 측정한 결과이다.
도 4는 RT-PCR을 이용하여 홍해삼 추출물 처리에 따른 B16F10 흑색 종양 세포 내에서의 피부 미백 관련 유전자 발현의 차이를 보여준다.
도 5는 단일 추출물 및 혼합 추출물의 티로시나제 활성 억제율을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 홍해삼 추출물의 제조 및 추출 용매에 따른 티로시나제 활성 저해 효과 확인

우선 원료인 홍해삼의 내장을 제거한 후 세척하였다. 그 후 초파기를 이용하여 홍해삼을 분쇄하였다. 분쇄된 홍해삼 800g을 3.2kg의 추출 용매 4종(증류수, 20% 에탄올, 50% 에탄올 및 70%의 에탄올)에 각각 36시간 동안 침지시켰다. 그 다음 각각의 침지물을 100℃에서 3시간 동안 가열한 후, 60℃ 이하의 온도에서 3시간 동안 냉각시켰다. 냉각된 결과물을 필터프레스를 이용하여, 10㎛ 여과지(ADVANTEC No. 2)로 여과함으로써 부유물을 제거하였다. 이 때, 여과보조제로 규조토를 0.1% 첨가하였다. 여과된 추출용액은 50℃에서 Rotary evaporator를 이용하여 고형분이 약 30%의 농도가 되도록 농축하고, 95℃에서 5분간 살균하였다. 수득된 농축물은 냉장 저장한 후 추출물의 미백 활성 분석을 위한 시료로 사용하였다.

4종의 추출 용매에 따른 홍해삼 추출물의 미백 효과 정도를 평가하기 위해, 각 홍해삼 추출물의 시험관 내 티로시나제 활성 저해 실험을 수행하였다. 구체적으로 0.45μm 필터를 이용하여 추출물의 부유물을 걸러낸 후, DMSO를 용매로 하여 각각 50㎍/㎕, 100㎍/㎕, 및 150㎍/㎕ 농도로 희석하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액 (pH 7.0) 220㎕와 시료액 20㎕, 그리고 머쉬룸 타이로시나제(1,500~2,000 U/ml) 20㎕를 순서대로 넣었다. 이 용액에 1.5 mM 타이로신 액 40㎕를 넣고 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨 다음, ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액을 넣었으며, 활성저해율이 50%일때의 시료의 농도(IC₅₀)를 적절한 프로그램을 이용하여 산출하였다. 그 결과, 70% 에탄올을 이용한 홍해삼 추출물이 다른 용매를 이용한 추출과 비교했을 때, 가장 높은 버섯 티로시나제 활성 감소 효과를 나타냈다. 이에 따라, 70% 에탄올을 추출용매로 이용했을 때 홍해삼 추출물이 가장 높은 미백 효과를 갖는 것을 확인하였다.

홍해삼 추출물의 추가적인 미백 효과를 분석하기 위해 이후 하기 실험에서는 70% 에탄올을 이용한 홍해삼 추출물을 시료로 사용하였다.

실시예 2. 홍해삼 추출물의 세포 독성 분석

홍해삼 추출물의 안전성 평가를 위해 MTT 분석을 통해 인간상피세포의 추출물에 따른 세포 생존율을 확인하였다. 구체적으로, 피부 각질형성 세포주인 HaCaT 세포를 12-웰 플레이트에 1×10⁴cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양한 후, PBS로 세척하였다. 그리고 나서 각 농도별(50, 100, 150, 200 ㎍/㎖)로 희석한 70% 에탄올 홍해삼 추출물의 시료를 각 웰에 첨가한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 0.5% MTT 용액을 각 웰에 20㎕씩 첨가하여, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO를 150㎕씩을 넣고 10분간 흔들어 준 다음, ELISA plate reader를 이용하여 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군과 홍해삼 추출물 처리군 모두에서 세포 증식에 별다른 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다. 특히, 홍해삼 추출물은 200㎍/㎕의 고농도에서도 독성이 없는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 홍해삼 추출물의 처리가 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 홍해삼 추출물의 인간 티로시나제 활성 억제 효과 검증

티로시나제는 인체 내 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정 단계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 홍해삼 추출물의 미백 활성을 확인하기 위해 홍해삼 추출물의 인비트로 인간 타이로시나제 활성저해시험(In vitro tyrosinase inhibition assay)을 실시하였다. 홍해삼 추출물을 0.1M 인산염완충액(pH 6.5)에 녹인 후, 4개의 농도로 희석하였다(50, 100, 150, 200 및 300 ㎍/ml). 시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 6.5) 220㎕및 각 시료액 20㎕을 넣고, 그 다음 인간 티로시나제(1500 U/ml~2000 U/ml) 20㎕를 첨가하였다. 이어서 1.5 mM 티로신액 40㎕를 첨가한 후, 37℃에서 10~15분 동안 반응시킨 다음, ELISA 리더기를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH 6.5)을 첨가하였으며, 양성 대조군으로 비타민 C를 사용하였다. 활성저해율이 50%일 때의 시료의 농도(IC₅₀)를 산출하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 홍해삼 추출물의 농도가 증가함에 따라 인간 티로시나제 활성을 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 4. 홍해삼 추출물의 DOPA 산화활성 저해 활성 확인

홍해삼 추출물의 미백 효과를 평가하기 위해, 멜라닌 합성과정의 속도결정 단계를 촉매하는 티로시나제의 DOPA 산화반응에 대한 활성저해 정도를 측정하였다. 구체적으로, 홍해삼 추출물을 용매에 녹인 후 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)으로 희석하였다 (50, 100, 150 및 200 ㎍/ml). 시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 7.0) 850㎕, 홍해삼 추출물 시료액 50㎕, 및 머쉬룸 타이로시나제(1,500~2,000 U/ml) 50㎕를 순서대로 넣고 37℃에서 6분 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 0.06 mM L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine)액 50㎕를 넣은 다음 37℃에서 1분 동안 반응시켰다. 그 후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)을 첨가하였으며, 양성 대조군으로 비타민 C를 사용하였다. 활성저해율이 50%일 때의 시료 농도(IC₅₀)를 산출하였다.

그 결과, 홍해삼 추출물의 농도가 증가함에 따라 머쉬룸 티로시나제의 활성이 감소하여 DOPA의 산화반응 억제율이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 200㎍/㎕의 농도에서 양성대조군인 비타민 C 대비 약 49%의 활성저해 효과를 보여 홍해삼 추출물의 미백효과를 입증하였다 (도 3).

실시예 5. 추출물 처리에 따른 피부미백 관련 표지인자 발현 변화 분석

RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 홍해삼 추출물 처리에 따른 B16F10 흑색 종양 세포 내에서의 피부 미백 관련 유전자 발현의 차이를 정량적으로 확인하였다. 피부 미백 관련된 인자로 멜라닌 생성에 관여하는 유전자로는 TRP-1, TRP-2, MITF 및 TYR(Tyrosinase)이 있다. 구체적으로, B16F10 흑색 종양 세포에 RicoEX RNA purification 용액을 첨가하여 뉴클레오티드를 분리하였다. 그리고 나서 클로르포름 및 이소프로판올을 첨가하여 원심 분리한 후, RNA 만을 단리하였다. 추출한 RNA는 정량 후, 역전사 PCR 과정을 통해 cDNA를 합성하였다. 그 후, 표 1의 프라이머를 이용하여 멜라닌 생성 유전자를 증폭시킨 다음, 2% 아가로스 겔을 이용하여 분리하였다. 분리한 겔을 EtBR로 염색하여 UV 일루미네이터를 통해 유전자 발현 여부를 확인하였다.

유전자	프라이머 서열(5'->3')	증폭 크기(bp)	어닐링 온도(℃)
TRP-1	정방향: GCTCCAGACAACCTGGGATA	185	59.5
	역방향: TCAGTGAGGAGAGGCTGGTT
TRP-2	정방향: GAAGGATGGACCAGGCAGTA	165	60
	역방향: CCTCACCCATCAATCTGTT
MITF	정방향: CAACTCATGCGTGAGAT	203	60.5
	역방향: TACTTGGTGGGGTTTTCGAG
Tyrosinase	정방향: TTTTGTACTGCCTGCTGTGG	151	60
	역방향: CAGGAACCTCTGCCTGAAAG

그 결과, 홍해삼 추출물이 피부색소인 멜라닌을 생성하는 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 발현을 억제하여, 우수한 미백 효과를 나타내는 것으로 확인되었다 (도 4).

실시예 6. 혼합 추출물 제조 및 혼합 추출물 처리에 따른 티로시나제 활성 억제 효과 확인

녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 다음과 같이 준비하였다.

먼저 녹차씨 추출물을 제조하기 위해, 녹차씨를 구입하여 외피를 제거하고 세척한 다음, 약 60℃의 열풍 건조기에서 건조하였다. 그 후 약 40~50 메쉬의 입자 크기로 분쇄한 다음, 분쇄된 녹차씨 가루 100g을 메탄올 용매에 넣고, 25℃에서 6시간 환류 추출하여 활성 성분들을 추출하였다. 추출액을 여과지로 여과한 후 회전 감압농축기로 감압농축하고 동결건조하여 녹차씨 추출물 13.1g을 얻었다.

병풀과 알로에베라잎을 각각 깨끗이 세척한 후, 상기 녹차씨 추출물과 동일한 방법으로 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 제조하였다. 최종적으로 병풀 추출물 24.3g을 수득하였고, 알로베라잎 추출물은 27.5g을 수득하였다.

제조된 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 하기 티로시나제 활성 저해 실험에 사용하였다.

실시예 1에서 제조한 홍해삼 추출물 및 상기에서 제조한 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 하기 표 2에 제시된 것과 같은 중량으로(단위: ㎍/ml) 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였다.

번호	홍해삼 추출물	녹차씨 추출물	병풀 추출물	알로에베라잎 추출물
1	200	-	-	-
2	-	200	-	-
3	-	-	200	-
4	-	-	-	300
5	200	200
6	200		200
7	200		200	300
8	200	200		300
9	200	200	200	300

상기에서 제조된 각각 추출물을 이용하여 인비트로 타이로시나제 활성저해시험(In vitro tyrosinase inhibition assay)을 실시하였다. 구체적인 실험 방법은 실시예 3과 동일하다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 홍해삼 추출물, 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물이 모두 포함된 혼합 추출물이 단일 추출물 및 2종 또는 3종 혼합 추출물보다 월등히 뛰어난 티로시나제 저해 활성을 나타냈다. 이를 통해 4종의 혼합 추출물이 현저히 우수한 미백 효능을 갖는 것을 확인하였다.

Claims (10)

1. 홍해삼 추출물, 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 1 : 1 : 1 : 1.5의 중량비로 포함하는, 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생합성 저해 활성을 갖는 미백용 화장품 조성물로서,
   상기 홍해삼 추출물은
   (a) 분쇄된 홍해삼을 물과 에탄올의 혼합 용매에 36시간 침지하는 단계;
   (b) 상기 침지물을 100℃의 온도에서 3시간 동안 가열하는 단계;
   (c) 상기 가열 단계로부터 수득된 결과물을 30℃내지 60℃의 온도에서 3시간 동안 냉각시키는 단계;
   (d) 상기 (c) 단계에서 냉각된 결과물을 고형분이 30% 농도가 되도록 농축하는 단계; 및
   (e) 상기 냉각된 결과물을 에틸아세테이트를 이용하여 추출하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 미백용 화장품 조성물.
2. 홍해삼 추출물, 녹차씨 추출물, 병풀 추출물 및 알로에베라잎 추출물을 1 : 1 : 1 : 1.5의 중량비로 포함하는, 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 생합성 저해 활성을 갖는 미백용 식품 조성물로서,
   상기 홍해삼 추출물은
   (a) 분쇄된 홍해삼을 물과 에탄올의 혼합 용매에 36시간 침지하는 단계;
   (b) 상기 침지물을 100℃의 온도에서 3시간 동안 가열하는 단계;
   (c) 상기 가열 단계로부터 수득된 결과물을 30℃내지 60℃의 온도에서 3시간 동안 냉각시키는 단계;
   (d) 상기 (c) 단계에서 냉각된 결과물을 고형분이 30% 농도가 되도록 농축하는 단계; 및
   (e) 상기 냉각된 결과물을 에틸아세테이트를 이용하여 추출하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 미백용 식품 조성물.
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