KR101599763B1

KR101599763B1 - 여드름 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101599763B1
Application number: KR1020140080086A
Authority: KR
Inventors: 박경목; 조은지; 장경주; 이진경
Original assignee: 동신대학교산학협력단
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2016-03-04
Also published as: KR20160001478A

Abstract

본 발명은 강황 뿌리, 목련 수피, 고삼 뿌리 및 병풀 전초의 혼합 추출물을 이용한 여드름 개선용 조성물을 개시한다.

Description

여드름 개선용 조성물{Composition for Improving Acne}

본 발명은 강황, 목련, 고삼, 병풀 또는 이들의 혼합 추출물을 이용한 여드름 개선용 조성물에 관한 것이다.

여드름은 얼굴, 가슴, 어깨 부위 등에 면모, 농포, 구진, 결절 등의 형태로 나타나는 다형성 피부질환으로, 2차 성숙이 있는 청소년기에 주로 발병한다. 11세에서 30세 사이에 약 80%가 발병하고, 30대 이후에서도 약 6%의 환자가 있는 것으로 보고되었으나 최근 들어 스트레스에 의한 성인 여드름의 발병 비율이 높아지고 있다. 이 질환은 환자에게 불쾌감을 주며 흉터 및 피부착색으로 인한 미관 손상을 일으킬 수 있다. 이에 따라 여드름 예방 및 치료에 대한 관심이 고조되고 있다.

여드름의 발생의 정확한 원인은 밝혀지지 않았으며 생리적 및 환경적 측면에서 다양한 병인을 가지고 있기 때문에, 다양한 유형으로 발병하는 여드름에 대한 알맞은 치료에는 어려움이 있다. 일반적으로 피지선에서의 과도한 피지분비, 호르몬 불균형, 유전적 소질, 비정상적인 모낭 내 이상 각화 및 Propionibacterium acnes의 증식 및 염증 반응 등에 의한 복합적인 요인들이 원인으로 알려져 있으며(Farrar, M. D. and Ingham, E. Acne: Clin. Dermatol. 2004. 22: 380-384; Kligman, A. M. J. Invest. Dermatol. 1974. 62: 268-287) 이에 따라 여드름을 치료하기 위한 기본적인 방법으로 모낭 각화로 인한 형질 변화 교정, 피지선의 활동성을 감소, 여드름 유발 주요 균주에 대한 항균작용, 피부 항염작용 등이 적용되고 있다.

정상 피부에는 호기성 세균인 Staphylococci, Micrococci 와 혐기성 세균인 Propionibacterium 속에 속하는 균 등이 상주하고 있으며 이들 균주들의 활성에 의하여 여드름이 발생하게 될 수 있다. 특히 지방 친화를 지니는 혐기성 균주인 Propionibacterium acnes가 여드름의 주요 원인균으로 지목되고 있다(Burkhart CG et al., Postgrad. Med. J. 1999 75: 328). P. acnes는 남성호르몬인 androgen이나 다른 요인에 의해 생성된 피지의 트리글리세라이드(triglycerides)를 가수분해한 후 지방분해효소 (lipase)와 화학주성인자의 분비를 통해 유리지방산을 생성하며 염증 반응을 일으킨다. 염증 반응이 진행됨에 따라 모낭 세포의 파괴가 나타나며 최종적으로 진피까지 염증 반응이 진행되게 된다. 또한 염증이 생긴 이후에 다른 균에 의한 2차 감염이 일어날 수 있다.

여드름의 또다른 원인 중 하나인 피지선의 발달은 제 2차 성징의 시기에 급속하게 이루어진다. 피지선의 발달로 인하여 분비 기능이 왕성해지면 모낭 내에 피지가 고여 발진이 원인이 되며 된다. 또한 정체된 피지가 모낭을 막아 공기의 순환을 차단하여 P. acnes 등 혐기성 세균의 증식을 돕게 된다.

모낭 각화는 모낭의 끝쪽인 모유두에서 일어나기 쉬우며 두꺼워진 각층이 모낭 내에 박리되어 모유두의 폐쇄가 일어나고 이것이 면포를 형성하게 된다. 모낭공이나 피지선의 개구부가 각질에서 막히거나 좁아지게 되면 정상적인 피지의 배출이 억제되고 모유두에서 피지가 정체하게 된다. 그 결과로서 여드름 관련 혐기성 세균의 증식이 증가하고, 그 생산물질이 모유두의 상피세포를 자극하여 더욱 각질이 항진된다(백혜연, 숙명여자대학교 석사학위 논문 ,향장미용, 2009. pp 7).

현재까지 제안된 여드름 치료 방법으로는 남성호르몬 억제제인 에스트로겐 등의 여성호르몬이나 항남성 호르몬제를 사용하여 피지분비를 조절하는 방법, 살리실산이나 비타민A 유도체인 레티노익산 제제를 이용한 모공의 각질을 제거하는 방법 등이 있으나 염증을 억제하기 위한 항염제 또는 세균감염을 억제하기 위한 항생물질 적용 방법이 가장 보편적으로 사용되고 있다. 그러나 테트라사이클린(tetracycline), 에리스로마이신(erythromycin), 크린다마이신(clindamycin) 등 기존의 항생물질을 사용하는 경우 내성균의 출현이나 조직, 장기 손상, 과민반응 등과 같은 부작용이 큰 문제로 대두되고 있다. 이에 따라 독성이 적어 부작용을 줄일 수 있는 천연 유래 물질을 사용하여, 여드름 치료를 위한 항균 및 항염증에 대한 연구가 필요한 실정이다.

본 발명의 이러한 배경 하에서 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 여드름 개선용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 강황, 목련, 고삼, 병풀 또는 이들의 혼합물을 70% 에탄올을 이용하여 추출하고 그 추출물의 여드름균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 측정한 결과 항균 활성을 보인 목련 추출물에 비해서 혼합 추출물의 항균 활성이 더 높았으며, 이는 항산화 활성에 있어서도 혼합 추출물의 항산화 활성이 더 높음을 확인하였다. 또한 상기 혼합 추출물을 인간섬유아세포의 증식을 촉진할 뿐만 아니라 항염증 인자인 COX-2의 발현을 억제함도 확인하였다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 일 측면에 있어서는 강황 뿌리, 목련 수피, 고삼 뿌리 및 병풀 전초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선용 조성물로 파악할 수 있고, 다른 측면에 있어서는 강황 뿌리 추출물, 목련 수피 추출물, 고삼 뿌리 추출물, 병풀 전초 추출물 또는 이들의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물로 파악할 수 있으며, 또 다른 측면에 있어서는 강황 뿌리, 목련 수피, 고삼 뿌리 및 병풀 전초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물 파악할 수 있다.

본 명세서에서, "추출물"이란 추출 대상을 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방식을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 상기 조추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물을 포함하고, 상기 조추출물을 상기 용매들을 극성이 증가 또는 감소하는 순으로 사용하여 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물을 포함하며, 나아가 크기, 전하, 소수성, 친화성 등의 성질을 이용한 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획물을 포함한다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상 또는 고형상의 추출물이 포함된다.

또 본 명세서에서, 상기 "유효성분"의 의미는 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 명세서에서 특별히 정의되지 아니한 용어는 당업계에서 통용되고 있는 의미나 사전적 의미를 따른다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 여드름 개선 활성, 항산화 활성 또는 항염증 활성을 나타낼 수 있는 한 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 15 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게서, 여드름 개선 활성, 항산화 활성 또는 항염증 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분을 포함하는 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 구체적으로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 들 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분과 전술한 바의 담체 성분을 포함시켜 당업계에 공지된 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등을 포함하여, 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로로에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS)(예컨대 패치제, 붕대 등) 등으로 제조될 수 있다.

상기에서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

약제학적으로 허용되는 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 전분(예컨대 옥수수 전분, 감자 전분 등), 셀룰로오스, 그것의 유도체(예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 등), 맥아, 젤라틴, 탈크, 고체 윤활제(예컨대 스테아르산, 스테아르산 마그네슘 등), 황산 칼슘, 식물성 기름(예컨대 땅콩 기름, 면실유, 참기름, 올리브유 등), 폴리올(예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린 등), 알긴산 등을 들 수 있으며 이러한 담체는 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적당한 것을 하나 이상 선택하여 사용할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 적합한 담체와 제제에 대해서는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)]을 참조할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 유화제(예컨대 TWEENS), 습윤제(예컨대 라우릴 황산 나트륨), 착색제, 풍미제, 안정화제, 보존제, 물, 식염수, 인산염 완충 용액 등을 추가로 포함할 수 있다.

부형제도 본 발명의 약제학적 조성물의 제형에 따라 적합한 것을 선택하여 사용할 수 있는데, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 알긴산 나트륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 현탁제나 분산제 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 감미제, 풍미제, 생리활성 성분, 미네랄 등이 포함될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

생리 활성 물질로서는 카테킨, 에피카테킨, 갈로가테킨, 에피갈로카테킨 등의 카테킨류나, 레티놀, 아스코르브산, 토코페롤, 칼시페롤, 티아민, 리보플라빈 등의 비타민류 등이 사용될 수 있다.

미네랄로서는 칼슘, 마그네슘, 크롬, 코발트, 구리, 불소화물, 게르마늄, 요오드, 철, 리튬, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 규소, 나트륨, 황, 바나듐, 아연 등이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 식품 조성물은 상기 감미제 등 이외에도 필요에 따라 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등을 포함할 수 있다.

이러한 보존제, 유화제 등은 그것이 첨가되는 용도를 달성할 수 있는 한 극미량으로 첨가되어 사용되는 것이 바람직하다. 극미량이란 수치적으로 표현할 때 식품 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.0005중량％ 내지 약 0.5중량％ 범위를 의미한다.

사용될 수 있는 보존제로서는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

사용될 수 있는 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등을 들 수 있다. 이러한 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등을 들 수 있다.

또한 향미나 기호성을 향상시키고 다른 기능성을 추가하기 위하여 한약재가 추가될 수 있는데, 추가될 수 있는 한약재로서는 두충 추출물, 속단 추출물, 녹용 추출물, 홍화인 추출물, 토사자 추출물, 숙지황 추출물, 별갑 추출물, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 감초 추출물, 당귀 추출물, 갈근 추출물, 강진향 추출물, 합환피 추출물, 산두근 추출물, 괴화 추출물 등이 예시될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 여드름 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 약품, 화장품 또는 식품으로 제품화될 수 있다.

도 1은 섬유아세포증식 촉진 활성 실험 결과이다.
도 2는 항염증 활성 실험 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 추출물의 제조

추출 원료로서 강황(Curcuma longa, 뿌리), 목련(Magnolia Kobus, 나무 껍질), 고삼(Sophora flavescens, 뿌리), 병풀(Centella Asiatica, 전초) 및 이들의 동량의 혼합물을 사용하였다.

멘틀 추출기에 70% 에탄올 2ℓ와 원료 100g을 넣어 70℃에서 3시간 동안 2회 추출한 후, 그 추출액을 감압여과하고 그 여과액을 70℃ 감압 농축하여 고형상의 추출물을 얻었다.

< 실험예 > 항산화 활성, 여드름 개선 활성, 섬유아세포 증식 촉진 활성 및 항염증 활성 실험

< 실험예 1> 항산화 활성 - DPPH radical 소거능 측정

(1)DPPH 제작

100% 메탄올에 DPPH를 0.1mM이 되도록 첨가하여 DPPH 용액을 제조한 후 실시예의 각 시료를 2%(w/v), 1%(w/v), 0.5%(w/v), 0.1%(w/v) 및 0.01%(w/v)이 되도록 첨가하였다. 다음 10초간 강하게 vortexing 하고 암소에서 30분간 방치한 후에 ELISA를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정한다. 항산화 활성은 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 DPPH radical 소거능을 백분율로 나타내었다.

결과는 아래의 [표 1]과 같다.

상기 [표 1]의 결과는 강황, 목련, 고삼 및 병출 단일 추출물보다 이들의 혼합 추출물이 항산화 활성이 높음을 보여준다. 특히 혼합 추출물은 0.1%(w/v)의 저농도에서도 80%의 높은 항산화 활성을 보였다.

< 실험예 2> 여드름 개선 활성 - 여드름 균(P. acnes )에 대한 항균 활성 측정

<실험예 2-1> 원판 확산법에 의한 실험

항균력 측정은 Disc diffusion assay 방법을 사용하였으며, 시험 균주인 여드름 균(Propionibacterium acnes) 10㎖의 액체배지(GAM Broth)에 접종하고 37℃에서 24시간씩 3회 계대배양하여 항균 활성 시험 균주로 사용하였다.

항균 활성 실험은 상기 시험 균주가 배양된 액체배지(GAM Broth)에 Paper Disc를 삽입한 후 꺼내어 시험 균주가 배양된 액체배지로 Paper Disc를 충분히 적신 후, 증류수를 이용하여 상기 실시예의 각 시료를 2%(w/v), 1%(w/v), 0.5%(w/v) 및 0.25%(w/v) 및 0.01%(w/v)의 농도로 제작하여 상기 Paper Disc 20㎕씩 적하하였다. 다음 37℃에서 24시간 배양하고 disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 항균활성을 분석하였다. 음성대조군으로는 추출물 희석시 사용한 증류수를 사용하였다.

결과를 아래의 [표 2]에 나타내었다.

상기 [표 2]의 결과에 있어서도 단일 추출물보다 혼합 추출물의 항균 활성이 우수하였다.

<실험예 2-2> 최소저해농도( Minimum inhibitory concentration , MIC )의 측정

최소 저해 농도는 시험관에 액체배지 각 5㎖씩 넣고 상기 실시예의 혼합 추출물 시료는 액체배지로 0.0625%(w/v), 0.03125%(w/v), 0.0156%(w/v), 0.0078%(w/v) 및 0.0039%(w/v)의 농도로 제작한 후 상기 시험관에 5㎖씩 넣고 액체배지에서 배양된 시험 균주(Propionibacterium acnes)를 50㎕씩 접종하였다. 그 다음 37℃에서 24시간 배양하고 균의 증식이 더 이상 이루어지지 않는 농도를 결정하였다.

그 결과 최소저해농도는 0.0156%로 나타났다.

< 실험예 3> 섬유아세포 증식 촉진 활성 실험 - MTT assay

섬유아세포주를 0% FBS를 함유하는 DMEM 배지가 포함된 96 well plate에 1 × 10⁴ cells/well 씩 동일하게 hemocytometer를 이용하여 계수한 후 분주하고 48시간 배양하였다. 다음 실시예의 시료(혼합 추출물임)를 0.1%(w/v), 0.05%(w/v), 0.01%(w/v), 0.005%(w/v), 0.001%(w/v)로 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양(시료 희석은 배양배지로 희석) 하였다. 배양 후 3-,4,5-di methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide용액 (2.5 mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간 추가 배양하고 세포 배양액을 전부 제거하였다. 200㎕의 dimethyl sulfoxide를 각 well 당 1ml씩 처리하여 교반한 후 100㎕씩을 96 well에서 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과를 시료 무처리군 대비 백분율로 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과를 참조하여 보면 대체로 처리 농도에 비례하여 섬유아세포가 증식함을 알 수 있다.

< 실험예 4> 항염증 활성 실험 - COX -2 발현 영향 측정

<1> 세포 배양

본 시험에서는 인간각질형성세포주(HaCaT)에서 염증을 유발하는 효소인 COX-2의 발현 정도를 mRNA 수준에서 확인하였다. 구체적으로는 인간각질형성세포주(HaCaT)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat No. 15240-062)과 함께 75 Cm² flask에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 이 인간각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 6 well plate에 110⁵ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달될 때까지 배양하였다. 이 후 배지를 제거한 다음 100ppm 농도로 시료(혼합 추출물임)가 포함된 새 배지로 교환 후 48시간 세포배양 조건에서 추가 배양하였다.

<2> RNA Isolation

RNA는 QiAzol Lysis Reagent(QIAGEN)을 이용한 total RNA isolation 방법으로 RNA를 분리하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 1ml의 QIAzol Lysis Reagent을 첨가하여 실온에서 10분간 처리하였다. 이후 새로운 E-tube에 옮긴 후 200ul의 chloroform(Amresco)을 첨가하여 잘 섞은 후 실온에서 5분간 반응시킨 다음 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리 하여 mRNA층과 단백질 DNA층으로 분리시켰다. mRNA가 포함되어 있는 상등액 부분인 500ul을 새로운 E-tube에 옮기고 여기에 500ul의 Isopropanol(MERCK KGaA)을 첨가하여 상온에서 4~5회 inverting 해 준 다음 상온에서 7분간 추가로 반응시켰다. 이를 다시 4, 13,000rpm으로 30분간 원심분리 하여 mRNA pellet을 침전시켰다. 상등액을 제거하여 pellet을 1ml의 75% Ethanol로 세척한 후 건조하여 20ul의 RNA Free Water(WelGENE Inc.)에 녹여 NanoDrop^R Spectrophotometer(ND-1000, UV/VIS)을 사용하여 Total RNA량을 5ug/ml로 정량하였다.

<3> cDNA 합성

cDNA합성은 PrimeScript^TM reagent Kit(TaKaRa, RR037A)를 이용하여 합성하였다. 자세하게는 total RNA 20ul에 50uM의 oligo-dT primer 1ul, 100uM의 Random Primer 4ul, 5X primeScript Buffer 4ul, PrimeScript RT enzyme Mix 1ul를 섞은 후 37℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였고, RTase를 불활성화시키기 위해 85℃에서 5초간 반응하였다.

<4> Real-time PCR

각각의 유전자를 분석하기 위해여 합성된 cDNA로 Real-time PCR을 실시하였다. cDNA와 probe(GAPDH, COX-2), TaqMan Gene expression master mix(AB, Pro. No.4369016)을 혼합한 후 7500 Real time PCR system(applied biosystems)을 이용하여 수행하였다. 모든 유전자에 대하여 50℃에서 2분 1회, 95℃에서 10분 1회, 95℃에서 15초 동안 60회로 실시하였다. 실험에 사용한 primer들의 Applied Biosystems (USA)의 inventoried primers를 사용하였다. 발현율은 각각의 GAPDH를 보정하여 나타내었다.

<5> 결과

[도 2]에서 보여지는 바와 같이 0.01%(w/v), 0.05%(w/v), 0.1%(w/v) 세 농도에서 시험하였으며, 그 결과 0.1%에서 대조군 대비 COX-2의 발현을 2배 정도 발현을 저해하였다.

Claims

강황 뿌리, 목련 수피, 고삼 뿌리 및 병풀 전초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균용 조성물.
강황 뿌리, 목련 수피, 고삼 뿌리 및 병풀 전초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물.
강황 뿌리, 목련 수피, 고삼 뿌리 및 병풀 전초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 화장품 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 화장품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.