CN109400669B - 核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核桃蛋白质技术领域，具体涉及核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用。本发明提供的小分子蛋白提取方法是利用葡聚糖凝胶层析原理将核桃仁皮蛋白按照分子量大小进行初步分离，选取分子量最小的蛋白组分进行活性研究。通过抑菌试验和细胞增殖试验发现核桃仁皮的小分子蛋白具有抑菌和抗癌的作用，所述小分子蛋白对绿脓杆菌和粪肠球菌的抑制活性最好，MIC(最小抑菌浓度)值分别为14.5、7.5μg/mL；在作用浓度为120μg/mL时，Huh7(人肝癌细胞)的存活率为50％、SGC(人胃腺癌细胞)的存活率仅为10％。本发明提供的核桃仁皮小分子蛋白可以应用于抗菌药物和抗癌药物中。

Description

核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用

技术领域

本发明涉及核桃蛋白质技术领域，具体涉及核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用。

背景技术

核桃仁的皮营养丰富，含有丰富的矿物质和维生素。含有碳水化物，钙，磷，铁，硫胺素，核黄素，尼克酸，这些营养价值较高，而且这些在常见食物中很难补充。核桃的皮含有丰富的维生素B和E，可防止细胞老化，具有健脑、增强记忆力及延缓衰老的功效。核桃中还含有特殊的维生素成分，不但不升高胆固醇，还能减少肠道对胆固醇的吸收，适合动脉硬化、高血压和冠心病人食用。核桃仁的皮含有亚麻油酸及钙、磷、铁，是人体理想的肌肤美容剂，经常食用有润肌肤、乌须发，及具有防治头发过早变白和脱落的功能。现有的关于核桃营养研究多是关于核桃仁的，核桃内种皮相关研究少，特别是关于小分子蛋白提取及应用。

现有的获得小分子蛋白的方法多是化学水解和酶水解，所得小肽是大分子蛋白水解而得，直接分离纯化获得小分子蛋白的方法亟待开发。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供核桃仁皮的小分子蛋白质提取方法及应用。通过凝胶层析原理，按照分子质量分离大小不同的核桃仁皮中的蛋白质，取分子量最小的蛋白混合物进行活性检测，所得小分子蛋白对绿脓杆菌和粪肠球菌有较好的抑菌效果，可以应用于相关抗菌药物中；所得小分子蛋白对Huh7和SGC细胞的增殖有抑制效果，但对正常细胞并没有影响，具有应用于抗癌治疗的前景。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是：

一种提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)获得核桃仁皮总蛋白

将核桃仁皮剪碎，加入0.1M PB溶液(Na₂HPO₄-NaH₂PO4，pH6.0)和蛋白酶抑制剂，低温研磨，直至核桃仁皮被磨成均匀的糊状；对上述研磨液进行超声波破碎，离心，吸取上清液，核桃仁皮总蛋白溶解于上清液中；

(2)分离核桃仁皮小分子蛋白

将步骤(1)得到的蛋白上清液进行凝胶过滤层析，用PB溶液进行洗脱，根据吸收值收集整合各峰组分。

进一步，上述方法所用的核桃是新鲜采摘的，所述核桃仁皮是湿润的。

优选的，步骤(1)中，进行研磨时，每1mg核桃仁皮加入300μLPB溶液。

优选的，上述步骤(2)进行凝胶过滤层析的方法是：选用SephadexG-50凝胶过滤柱(100×2.6cm，GE Health)进行分离，用PB溶液进行洗脱，连接全自动部分收集器进行样品收集，设置流速为0.3mL/min，每10min收集一管。使用分光光度计每隔一管测定280nm和215nm吸光度值。根据吸收值收集整合各峰组分。

上述提取的核桃仁皮小分子蛋白在制备抑制绿脓杆菌和粪肠球菌的抑菌剂中的应用。

上述应用中核桃仁皮小分子蛋白对绿脓杆菌的MIC值是14.5μg/mL；核桃仁皮小分子蛋白对粪肠球菌的MIC值是7.5μg/mL。

上述提取的核桃仁皮小分子蛋白在制备抗癌和抑菌制剂中的应用。

一种抑菌药物，所述药物包含核桃仁皮小分子蛋白。

进一步，上述抑菌药物可以抑制绿脓杆菌和粪肠球菌的生长。

一种抗癌制剂，所述制剂包含有治疗效果剂量的核桃仁皮小分子蛋白。

进一步，所述抗癌制剂用于治疗人胃腺癌或人肝癌。

有益效果：

本发明利用葡聚糖凝胶层析原理，按照分子量大小将核桃仁皮中的蛋白进行初步分离，将核桃仁皮中的小分子蛋白作为活性研究对象。提取小分子蛋白的方法简单易实施，且提取的是核桃仁皮中含有的天然的小分子蛋白。

通过抑菌试验和细胞增殖试验发现，核桃仁皮中的小分子蛋白具有抑制微生物和癌细胞生长的活性。所述小分子蛋白对绿脓杆菌和粪肠球菌的抑制活性最好，MIC(最小抑菌浓度)值分别为14.5、7.5μg/mL；在作用浓度为120μg/mL时，Huh7(人肝癌细胞)的存活率为50％、SGC(人胃腺癌细胞)的存活率仅为10％。

本发明所提供的核桃仁皮小分子蛋白来源于天然的可食用的核桃，相对于现有的化合药物更为健康，具有开发成药物的潜能。

附图说明

图1是细胞增殖实验细胞存活率统计结果

图中，横坐标表示所提取的核桃仁皮小分子蛋白的作用浓度，纵坐标表示存活率；图中相关英文解释：Huh7，人肝癌细胞；SGC，人胃腺癌细胞；macrophage，巨噬细胞；HEK293，人胚肾细胞；splenocyte，脾细胞。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一：核桃仁皮小分子蛋白的提取分离

1、核桃仁皮的获得

购买新鲜的核桃，撕下湿润的核桃仁皮，清水冲洗干净。

2、获得核桃仁皮水溶蛋白

将核桃仁皮剪碎，加入0.1M PB溶液(Na₂HPO₄-NaH₂PO4，pH6.0)和蛋白酶抑制剂，在研钹中进行研磨，研磨过程在冰上保持低温进行，每1mg核桃仁皮加入300μLPB溶液。将核桃仁皮研磨成均匀的糊状后，用PB溶液稀释一倍。用超声波细胞破碎仪对所得核桃仁皮研磨液进行超声破碎(超声3sec，暂停3sec，每10min为一个循环，每个循环间隔20min，共三个循环)，超声前在超声溶液中加入玻璃砂以使细胞壁充分破裂，超声过程中核桃仁皮研磨液在冰上保持低温状态，超声后进行离心(4℃，12000×g，2h)，小心吸取上层清液。核桃仁皮中的水溶性蛋白在所得上清液中。

3、获得核桃仁皮中的小分子蛋白

将上一步得到的蛋白上清液经0.22μm滤器过滤后取5mL(蛋白量约为100mg)按照使用说明上样于已用缓冲液平衡好的SephadexG-50凝胶过滤柱(100×2.6cm，GE Health)中。用相同PB进行洗脱，连接全自动部分收集器进行样品收集，设置流速为0.3mL/min，每10min收集一管。使用分光光度计每隔一管测定280nm和215nm吸光度值。根据吸收值收集整合各峰组分。将所得到的每个蛋白峰样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，所用蛋白胶浓度为12％。

实验通过Sephadex G-50葡聚糖凝胶过滤层析从核桃仁皮中分离得到三个蛋白峰，经蛋白电泳检测，最小的蛋白峰的蛋白分子量都在10kD以下。

实施例二：核桃仁皮小分子蛋白的抗菌作用

1透析处理

对实施例一提取分离得到的核桃仁皮小分子蛋白溶液进行透析，降低其中的盐浓度。透析袋有一定的截留分子量，高于此分子量的大分子物质比如蛋白质不能通过，而一些小分子物质比如无机盐、单糖可以通过半透膜，这样可以使得蛋白质分子和小分子物质分开。透析时把核桃仁皮小分子蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液蒸馏水中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质逐渐降低到最小值为止。透析完成后对蛋白液进行低温冷冻干燥，得到蛋白干粉。

2抗菌实验

2.1MIC值检测

实验检测的细菌和真菌标准菌株包括革兰氏阳性菌：松鼠葡萄球菌(staphylococcus sciuri)、溶血性葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)、表皮葡萄球菌(stagphylococcus epidermidis)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtitles)、金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcus aureus)；革兰氏阴性菌：伤寒沙门氏杆菌(salmonella typhi)、克雷伯氏肺炎菌(klebsiellapneumoniae)、绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(AcinetobacterBaumannii)、大肠埃希氏菌(escherichia coli)；真菌：粘液菌(slime-fungi)、白念珠菌(Candida albicans)。以上微生物菌株均购买自北纳创联生物科技有限公司。

用无菌96孔板对上述微生物进行抑菌试验，微生物培养在LB培养基中，浓度是2×10⁵CFU/mL，每孔加入100μL菌液。将上述核桃仁皮小分子蛋白粉用PBS溶液溶解稀释后，0.22μm滤器过滤除菌。将所得核桃仁皮小分子蛋白PBS溶液加入到96孔板的菌液中，使小分子蛋白的终浓度分别为：500，250，110，60.5，30.75，15.62，7.81μg/mL，对每种实验微生物做相同实验处理。将处理好的96孔板放入摇床中摇晃培养，37℃条件下培养12小时，检测OD620，计算培养后微生物数量。最小抑制浓度(MIC)用导致100％抑制生长的最小浓度表示。每种处理进行三个重复。实验结果如表1所示：

表1核桃仁皮抑菌试验

根据实验结果可知，实验所提取的核桃仁皮小分子蛋白对部分微生物有抑菌活性。在所测微生物中，对粪肠球菌和绿脓杆菌的抑菌MIC值最低，抑菌效果最好，对粘液菌和大肠埃希氏菌的抑菌效果次之。

绿脓杆菌是临床上较常见的条件致病菌，常发生于免疫功能低下或有严重基础疾病患者，特别是老年患者；粪肠球菌是肠球菌中常见的一种，这种病菌会寄生在人或动物的肠道中，当机体免疫力突然下降时，这种病菌会导致严重的感染，粪肠球菌很容易引起尿路感染。本发明所提取得到的核桃仁皮小分子蛋白是天然来源的蛋白混合物，相对于现有的抑菌剂更为健康，利用本发明的小分子蛋白对绿脓杆菌和粪肠球菌的抑制活性，可以将本发明的小分子蛋白混合物开发成安全健康的抑菌药物。

实施例三：核桃仁皮小分子蛋白的抗癌作用

1实验材料

SGC(人胃腺癌细胞)、HEK293(人胚肾细胞)、Huh7(人肝癌细胞)、大鼠脾细胞和大鼠巨噬细胞，以上细胞均购买自北纳创联生物科技有限公司；噻唑蓝(MTT)；二甲基亚砜(DMSO)。

2实验方法

无菌操作，将细胞分别接种到96孔板中，每孔的接种量是5×10³个细胞；细胞培养12小时后加入不同浓度梯度的核桃仁皮小分子蛋白；共培养26小时后，加入0.5mg/mL的MTT，继续培养4小时；MTT与活细胞中的线粒体反应形成蓝紫色的甲臜，反应结束后，小心吸出细胞上清液，加入DMSO溶解沉在孔底的甲臜，摇晃10min，使甲臜充分溶解；波长550nm检测所得溶液的OD值。设置PBS加样组为空白对照，无细胞的培养基为调零组。每个处理孔进行6个重复。

细胞存活率计算公式：

细胞存活率＝(OD实验组-OD调零组)/(OD对照组-OD调零组)

3实验结果

图1展示了核桃仁皮小分子蛋白对癌细胞和正常细胞增殖的影响，横坐标是所提取小分子蛋白的作用浓度，纵坐标是细胞存活率。由结果可知，核桃仁皮的小分子蛋白对所检测的Huh7和SGC有抑制作用，抑制效果随浓度增加而增强；核桃仁皮的小分子蛋白对HEK293、大鼠肾细胞和巨噬细胞的抑制生长作用相对较弱，甚至500μg/mL的高浓度对巨噬细胞的生长没有抑制作用。

实施例三通过细胞增殖实验证明了核桃仁皮的小分子蛋白对正常细胞的生长并无影响，但对检测的Huh7和SGC有抑制生长作用。现有的一些研究表明，核桃中含有抗癌的成分，但是抗癌机理多是提高人体免疫力，从而增强自身抵抗能力。本实施例进行的细胞增殖实验证明了核桃仁皮中含有抑制癌症细胞生长的蛋白成分。

本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用于说明解释本发明的技术方案而非限制，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)获得核桃仁皮总蛋白

将核桃仁皮剪碎，加入0.1M PB溶液和蛋白酶抑制剂，低温研磨，直至核桃仁皮被磨成均匀的糊状；对上述研磨液进行超声波破碎，离心，吸取上清液，核桃仁皮总蛋白溶解于上清液中；

(2)分离核桃仁皮小分子蛋白

将步骤(1)得到的蛋白上清液进行葡聚糖凝胶过滤层析，用0.1MPB溶液进行洗脱，根据吸收值收集整合各峰组分；

所述步骤(2)进行葡聚糖凝胶过滤层析的方法是：选用Sephadex G-50凝胶过滤柱进行蛋白分离，用0.1M PB溶液进行洗脱，连接全自动部分收集器进行样品收集，设置流速为0.3mL/min，每10min收集一管；使用分光光度计每隔一管测定280nm和215nm吸光度值。

2.根据权利要求1所述的提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：所述核桃仁皮取自新鲜采摘的核桃，核桃仁皮是湿润的。

3.根据权利要求1所述的提取核桃仁皮小分子蛋白的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，进行研磨时，每1mg核桃仁皮中加入PB溶液的体积是300μL。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的提取核桃仁皮小分子蛋白的方法提取的核桃仁皮小分子蛋白在制备抑制绿脓杆菌和粪肠球菌的抑菌剂中的应用，其特征在于：核桃仁皮小分子蛋白对绿脓杆菌的MIC值是14.5μg/mL；核桃仁皮小分子蛋白对粪肠球菌的MIC值是7.5μg/mL。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的提取核桃仁皮小分子蛋白的方法提取的核桃仁皮小分子蛋白在制备抗人胃腺癌和抑绿脓杆菌、粪肠球菌制剂中的应用。

6.一种抑菌药物，其特征在于：所述药物包含权利要求1所述提取核桃仁皮小分子蛋白的方法获得的核桃仁皮小分子蛋白。

7.根据权利要求6所述的抑菌药物，其特征在于：所述抑菌药物可以抑制绿脓杆菌和粪肠球菌的生长。

8.一种抗癌制剂，其特征在于：所述制剂包含权利要求1所述提取核桃仁皮小分子蛋白的方法获得的核桃仁皮小分子蛋白。

9.根据权利要求8所述的抗癌制剂，其特征在于：所述抗癌制剂用于治疗人胃腺癌或人肝癌。

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