CN103805661B - 一种富含玉米黄素的锦灯笼肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种富含玉米黄素的锦灯笼肽的制备方法及其抗氧化活性，具体地说利用锦灯笼果实制备具有抗氧化活性的富含玉米黄素的生物活性肽。利用本发明的方法不仅将锦灯笼果实的蛋白质制备成为小分子的肽，而且富集了锦灯笼中玉米黄素；所制备的产品不仅具有抗氧化活性，而且可缓解眼疲劳、对于老年性黄斑变性、白内障等眼疾具有很好的预防作用，可应用于食品保健品、药品、化妆品等领域，具有良好的应用前景。

Description

一种富含玉米黄素的锦灯笼肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种富含玉米黄素的锦灯笼肽制备方法及其抗氧化活性，具体地说利用锦灯笼果实制备具有抗氧化的富含玉米黄素的活性肽。利用本发明的方法不仅可将锦灯笼果实的蛋白质制备成为小分子的肽，而且保留了锦灯笼中玉米黄素；所制备的产品不仅具有抗氧化活性，而且对于老年性黄斑变性、白内障等眼疾具有很好的预防作用，可应用于食品保健品、药品、化妆品等领域，具有良好的应用前景。
背景技术
人体在氧的利用过程中，会因各种内因性和外因性因素而产生各种活性氧和自由基，这些自由基在维持机体正常代谢和疾病防治中起到积极的作用。但是过量的自由基可以攻击生物膜不饱和脂肪酸和蛋白质等，引发氧化损伤，使机体抵抗力下降，从而导致各种疾病发生，如癌症和老化等病理性变化。人体可通过补充外源性抗氧化物质消除过量自由基，从而达到增强身体抵抗力、促进机体健康的目的。不同的抗氧化物质可清除不同的自由基，机制和效果各不相同。目前有一些人工合成的抗氧化物质，但是长期服用会有一定副作用，因此从动植物中筛选的天然抗氧化物质更具有吸引力（FoodChemistry94(2006)550–557；ComprehensiveReviewsinFoodScienceandFoodSafety,10(2011)221-247）。生物活性肽是一类重要的抗氧化物质。
锦灯笼，为茄科植物酸浆(PhysalisalkekengL.var.franchetii)，又名酸浆草、灯笼草、红姑娘、挂金灯。果实味甘,微酸。其干燥宿存萼或带果实的宿存萼作为锦灯笼药用，具有清热解毒、利咽、化痰、利尿的功效。药材栽培或野生，广泛分布于全国各地，资源丰富。
锦灯笼果实中含有丰富的类胡萝卜素，以玉米黄素为主。玉米黄素（Zeaxanthin，3,3’-二羟基-β-胡萝卜素，C40H56O2），亦称玉米黄质，是带有羟基的类胡萝卜素黄质。锦灯笼果实中的玉米黄素是全反式（3R,3’R）-玉米黄素。从安全角度考虑从植物中直接提取的3R,3’R-玉米黄素是最安全可靠的。（FoodandChemicalToxicology49(2011)2841–2848）。人体无法自身合成玉米黄素，只能通过食物摄取，对于老年性黄斑变性（AMD）高风险人群仅依靠从食品中获取玉米黄素是非常有限的，需要额外补充剂补充玉米黄质。
玉米黄素与叶黄素是人体视网膜的黄斑部位唯一的类胡萝卜素，是黄斑色素的主要组成色素（ClinicsinDermatology(2009)27,195-201）。玉米黄素主要集中在视网膜的黄斑区中心，具有特异性的吸收紫外线中蓝光的作用，可避免蓝光对视网膜损伤。玉米黄素还具有抗氧化的作用，可防止视网膜、上皮细胞、脉络膜等由于氧化引起的眼损伤，因此玉米黄素对于人体视力和眼睛的营养保护具有重要的作用（BrJOphthalmol199983:867-877）。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的富含玉米黄素的锦灯笼肽的制备方法：本发明以锦灯笼果实为原料，通过提取、分离、酶解等方法制备富含玉米黄素的锦灯笼肽，锦灯笼肽具有抗氧化活性，可应用于食品、保健品、药品、化妆品等领域，具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
以锦灯笼果实为原料，通过提取、蛋白质沉淀、分离、酶解、干燥等步骤，获得富含玉米黄素的锦灯笼肽。
所述富含玉米黄素锦灯笼肽的制备方法：
1）锦灯笼果实干燥后磨碎，按照锦灯笼：水质量比=1：10~100的比例加入去离子水，用2MNaOH调节pH为7.0~10.0，20~60℃搅拌提取1~10小时，提取结束后静置沉淀分离；得提取液和滤渣；
2）步骤1）所得滤渣再次滤渣按照锦灯笼质量：水质量=1:10~100的比例加入去离子水进行第二次提取，用2MNaOH调节pH为7.0~10.0，20~60℃搅拌提取1~10小时，提取结束后静置沉淀分离；得提取液和滤渣；
3）步骤2）所得滤渣再次滤渣按照锦灯笼质量：水质量=1:10~100的比例加入去离子水进行第二次提取，用2MNaOH调节pH为7.0~10.0，20~60℃搅拌提取1~10小时，提取结束后静置沉淀分离；得提取液和滤渣；
提取共重复3次合并3次的提取液，用1mol/lHCl溶液调节pH为1.0~7.0，沉淀锦灯笼蛋白质；收集蛋白质，用pH2～9的磷酸缓冲液溶解成重量浓度1～50％的溶液，加入蛋白质水解酶，酶的加入量为酶：蛋白质重量比＝1：10～500，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时，再冷冻干燥得到富含玉米黄素的锦灯笼肽。
本发明的特点如下：
1锦灯笼是我国传统中药，本发明在传统中药基础上利用现代生物技术，提高了锦灯笼的生物功效。
2所制备的锦灯笼肽具有显著的抗氧化活性。本发明首次从锦灯笼果实中获得具有抗氧化活性的肽。
3锦灯笼肽富含玉米黄素，具有良好的应用前景。本发明所制备的锦灯笼肽不仅具有抗氧化活性，而且富含对视网膜色素——玉米黄素，因此在食品添加剂、保健品、药品、化妆品等领域有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1锦灯笼肽中玉米黄素的色谱图。
具体实施方式
实施例1
以锦灯笼果实为原料，按照以下工艺制备锦灯笼肽：
取1000克灯笼果实冷冻干燥、磨成粉末，按照锦灯笼：水质量比=1：10的比例加入去离子水，用2MNaOH调节pH为8.0，20℃搅拌提取10小时，提取结束后静置沉淀分离；滤渣按照以上步骤进行提取，重复三次；合并提取液，用1mol/lHCl溶液调节pH为1.0，沉淀锦灯笼蛋白质；收集蛋白质，用pH2的磷酸缓冲液溶解成重量浓度10％的溶液，加入木瓜蛋白酶，酶的加入量为酶：蛋白质重量比＝1：10，在20℃温度下酶解24小时，冷冻干燥得到锦灯笼肽；每克锦灯笼肽含有玉米黄素10.72毫克，锦灯笼肽中玉米黄素的色谱图见图1。通过铁还原能力、DPPH自由基清除能力、羟基自由基清除能力检测锦灯笼肽的抗氧化能力。
1.铁还原能力测定
取250uL样品加入到4mLTPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪）工作液中（工作液组成：25ml的0.3M、pH=3.6醋酸盐缓冲液，2.5ml的10mM的TPTZ溶液，2.5ml的20mM的FeCl3，混合均匀），于37°反应10min，在593nm处测定其吸光度
Vc标准曲线：配制不同浓度的Vc溶液，分别取100uL与TPTZ工作液按上述条件下反应，制作标准曲线。
样品铁还原能力以每毫克样品相当于ugVc的铁还原能力表示。2.DPPH自由基清除能力
配制不同浓度的样品溶液，取1ml样品+1ml，0.1mMDPPH（2,2-联苯基-1-苦基肼基,溶于95%乙醇）振荡混匀，室温放置30min，于517nm检测吸光度变化。
清除率%=（Acontrol-Asample-As）/Acontrol×100%；
Acontrol:1ml的乙醇溶液加1ml的，0.1mMDPPH按照上述反应后的吸光度值；
Asample：1ml的样品溶液加1ml的，0.1mMDPPH按照上述反应后的的吸光度值；
AB:1ml样品溶液加1ml水的吸光度值；
3.羟基自由基清除能力测定
样品溶液：1ml的0.2M，pH7.8磷酸盐缓冲液+0.75ml的7.5mM的邻二氮菲溶液+0.5ml的7.5mM的FeSO4溶液+0.5ml样品+0.5ml，30mMH2O2+1.75ml水。同时设置参比1（0.5ml水代替样品溶液）和参比2（用1.0ml水代替H2O2和样品溶液）。以上配好溶液于37°放置60min，再于510nm检测吸光度。
清除率%=（As-A损伤）/(A未损-A损)×100%；
A参比1：参比1的吸光度值；
A参比2：参比2的吸光度值；
As：样品溶液的吸光度值；
锦灯笼肽的抗氧化活性见表1。
表1锦灯笼肽的抗氧化活性
实施例2
取1000克灯笼果实冷冻干燥、磨成粉末，按照锦灯笼：水质量比=1：100的比例加入去离子水，用2MNaOH调节pH为10.0，60℃搅拌提取1小时，提取结束后静置沉淀分离；滤渣按照以上步骤进行提取，重复三次；合并提取液，用1mol/lHCl溶液调节pH为7.0，沉淀锦灯笼蛋白质；收集蛋白质，用pH9的磷酸缓冲液溶解成重量浓度50％的溶液，加入胰蛋白酶，酶的加入量为酶：蛋白质重量比＝1：500，在50℃温度下酶解4小时，再冷冻干燥得到锦灯笼肽；每克锦灯笼肽含有玉米黄素12.32毫克，锦灯笼肽的抗氧化活性与表1相同。

Claims (5)

1.一种富含玉米黄素的锦灯笼肽的制备方法，其特征在于：用水提取锦灯笼果实中的蛋白质并酶解为肽，所得到的产品富含玉米黄素；具体包括以下操作：
1)锦灯笼果实干燥后磨碎，进行提取操作；
提取操作过程为：按照锦灯笼：水质量比＝1：10～100的比例加入去离子水，用0.1-2MNaOH调节pH为7.0～10.0，20～60℃搅拌提取1～10小时，提取结束后静置沉淀分离；得提取液和滤渣；
滤渣重复进行上述提取操作过程1-3次；
2)合并上述1-4次的提取液，用0.1-1mol/lHCl溶液调节pH为1.0～7.0，沉淀锦灯笼蛋白质；收集蛋白质，用pH2～9的磷酸缓冲液溶解成重量浓度1～50％的溶液，加入蛋白质水解酶，酶的加入量为酶：蛋白质重量比＝1：10～500，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时，再冷冻干燥得到富含玉米黄素的锦灯笼肽；锦灯笼肽含有玉米黄素，活性检测显示具有抗氧化活性。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)过程如下，
A.锦灯笼果实干燥后磨碎，按照锦灯笼：水质量比＝1：10～100的比例加入去离子水，用0.1-2MNaOH调节pH为7.0～10.0，20～60℃搅拌提取1～10小时，提取结束后静置沉淀分离；得提取液和滤渣；
B.将步骤A)所得滤渣按照锦灯笼质量：水质量＝1:10～100的比例加入去离子水进行第二次提取，用0.1-2MNaOH调节pH为7.0～10.0，20～60℃搅拌提取1～10小时，提取结束后静置沉淀分离；得提取液和滤渣；
C.将步骤B)所得滤渣按照锦灯笼质量：水质量＝1:10～100的比例加入去离子水进行第二次提取，用0.1-2MNaOH调节pH为7.0～10.0，20～60℃搅拌提取1～10小时，提取结束后静置沉淀分离；得提取液和滤渣；
合并3次的提取液待用。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述富含玉米黄素的锦灯笼肽；所述富含是指锦灯笼肽中玉米黄素的含量≥5mg/g。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所得到的锦灯笼肽产品富含玉米黄素，活性检测显示具有抗氧化活性，而且是眼睛营养素。
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