CN103262939A - 一种源自鸡胚的抗氧化活性混合肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种源自鸡胚的抗氧化活性混合肽的制备方法，属于活性肽的提取技术领域。本发明工艺：收集孵化至一定天数的健康鸡胚，通过组织匀浆、冷冻干燥、与无菌水复溶、低温离心、过超滤膜、冷冻干燥等加工手段，从鸡胚中提取出具有抗氧化活性的混合肽成品。该成品可作为功能因子添加在食品或化妆品中，或作为一种新型的天然高效抗氧化药物的成分进行开发。本发明方法简单、成本低廉，得到的产品具有天然、健康、高活性等优点，尤其对于处于亚健康的中年人或年轻人具有潜在的开发价值。同时，将天然抗氧化肽应用于保健品与化妆品中，回归本源、纯天然，符合现今大众的消费要求。本发明也是一种对鸡胚的高附加值加工方法，是传统中医药食同源理论在保健领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从鸡胚中提取具有抗氧化活性混合肽的方法，属于活性肽的提取技术领域。
背景技术
自Harman于1956年提出自由基理论以来，人们逐渐认识到人体内氧化反应产生的自由基与人体的衰老以及关节炎、糖尿病、高血压、高血脂等慢性疾病有密切关系。而在当今社会，随着人们生活水平的日益提高，由自由基导致的各种威胁人类健康的慢性疾病越来越引起关注。为了预防这些慢性疾病并达到延缓衰老的目的，人们需要采取有效的方法去除体内过多的活性氧与自由基。而抗氧化剂可以通过清除体内自由基，防止细胞氧化从而达到预防慢性疾病并延缓衰老的目的。
目前，市面上已有化学合成类抗氧化剂，如BHA、BHT等，尽管这些化学类药物具有很强的抗氧化功效，但因其具有一定的不安全性及副作用，各国政府纷纷对其强制规定了 ADI 值， 控制其用量。另一类是化妆品中常见的天然抗氧化剂，如维生素C、维生素E及SOD等，其抗氧化活性有限，并且成本偏高，一定程度上限制了其广泛应用。因此，中外学者不断尝试从天然来源的材料中提取成本低廉的抗氧化剂，以期望开发出安全的具有预防慢性疾病的药物。另一方面，随着社会竞争日趋激烈，人们的工作压力增大，出现血压血脂偏高、细胞衰老过快等亚健康状况的人群不断增加，尤其是越来越多的年轻人面临这种压力。对于这部分人群来说，根据中医药食同源的理论，从日常食物中提取出具有抗氧化功效的成分加以开发作为功能性食品或化妆品是很有市场前景的。
近年来，由各种原料得到的抗氧化肽因具有活性强、安全性高的优点，成为国内外研究的热点。对于肽类抗氧化剂，除了具有抗氧化活性以外，还往往具有一定的抗菌、免疫等生理功效以及丰富的氨基酸。目前，人们已经通过利用蛋白酶水解的手段从各种天然材料中得到抗氧化肽，这些材料包括大豆、小麦等植物蛋白，以及鱼类、猪肉、蛋类等动物蛋白。但是，从这些来源中获得抗氧化肽的方法都需要对源蛋白进行初步的纯化，并需要用蛋白酶在一定的条件下反应，这样就增加了工艺的复杂性以及最终产品的开发成本。
鸡胚蛋是指受精鸡蛋孵化至一定天数尚未破壳，可食用的鸡蛋。鸡胚蛋在短短的21天内，与外界环境仅有气体交换，在合适的温度下便可利用自身的蛋白质、脂肪等生物大分子从一个单细胞发育成为一个成熟的生命个体并破壳而出。由于鸡胚蛋的生长发育吸收利用了鸡蛋中的营养物质，并进行了一系列复杂的生化反应，其营养价值和生物活性与未受精的鸡蛋相比发生了巨大的变化。而尚未发育完全的雏鸡因故夭折不再继续吸收蛋白养分，从而用于滋长生命的剩余营养物就留在蛋内。基于其丰富的营养价值，鸡胚深得广大群众的喜爱，尤其在中国南方及东南亚地区有很多人食用，并有不少关于将鸡胚加工成为营养品的发明专利。但是，之前人们更多关注的是其营养价值，而忽视了更有研发价值的生物活性因子，这些小分子在生命形成过程中对内环境平衡的维持起到了重要作用。例如，在鸡胚利用自身脂肪酸进行β-氧化途径为其新陈代谢提供能量的同时，也会产生许多对机体有害的活性氧或自由基，在此过程中，必然有一些蛋白质水解得到的小分子肽类参与到清除自由基的生物活动中。而当前，还没有利用简单的分离方法从鸡胚中提取抗氧化肽的相关技术报道。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种利用人工控制孵化时间，得到抗氧化活性最高的孵化天数的鸡胚，然后利用简便的分离方法，从鸡胚中提取含有抗氧化肽的组分。
本发明的技术方案：一种鸡胚抗氧化活性混合肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）孵化鸡胚：精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.8℃，相对湿度60%，每2小时翻蛋一次，待孵化至第3-15天，胚胎处于营养成分增长的高峰期，各种器官基本形成，此时取出受精鸡蛋，放入4℃的冰柜中停止孵化并保存，以备加工用；
（2）匀浆，冻干：对步骤（1）孵化鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4℃下将鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入-30℃冰箱内低温保存，以备加工用；
（3）无菌水复溶：将步骤（2）所得的鸡胚粉末中加入无菌水，按照5g鸡胚粉末加100mL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；
（4）离心：将鸡胚浆液在4℃，5000×g条件下离心20min，收集离心后的上清液；
（5）超滤：收集步骤（4）离心后的上清液，将其通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有抗氧化肽的混合液；
（6）冻干：将步骤（5）所得的混合液进行冷冻干燥，得到含有抗氧化活性混合肽的粉末状产品，密封后放在4℃下低温保存，为具有抗氧化活性的小分子肽，其分子量小于3000道尔顿。
一种鸡胚抗氧化活性混合肽的制备方法，步骤（1）中孵化时间为15天。
用所述方法制备得到的抗氧化活性混合肽的用途，将其加工成为具有抗氧化功效的食品或药物，或作为功能因子添加到功能性食品或化妆品中。
本发明的有益效果：
第一、本发明提供了一种来源于鸡胚的抗氧化肽的加工方法，该方法不需要借助于蛋白酶的水解作用，仅仅通过冷冻干燥、复溶、离心、超滤、色谱分离等手段即可制得含有抗氧化肽的产品。因而其产品具有安全性高、成本低廉、天然健康、无副作用等优点，尤其对于处于亚健康的中年人或年轻人具有潜在的开发价值。
第二、经过液质联用等分析手段分析，最终得到的混合肽组分的分子量小于3000道尔顿，这样的小分子更有利于其在人体内被吸收并发挥生理功效。
第三、该方法的整个过程采用低温粉碎、冷冻干燥、低温保藏等低温手段，最大限度地保存了生物活性肽的生理功效。
第四、经过多种抗氧化评价手段证明，制得的混合肽组分具有很高的抗氧化活性。这种原材料丰富、加工成本低廉；产品效果突出，可作为功能因子添加在食品或化妆品中，或作为一种新型的天然抗氧化药物的成分进行开发。
附图说明
图1是还原力随孵化天数的变化。
图2是DPPH自由基清除力随孵化天数的变化。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
鸡胚抗氧化混合肽的制备方法：
（1）精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.8℃，相对湿度60%，每2小时翻蛋一次，待孵化至第15天，胚胎处于营养成分增长的高峰期，各种器官基本形成，此时取出受精鸡蛋，放入4℃冰柜中结束孵化并保存，以备加工用；
（2）对鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在4℃下将鸡胚胎用组织匀浆机匀浆后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入-30℃冰箱内低温保存，以备加工用；
（3）将干燥的鸡胚粉末中加入无菌水按照5g粉末/100mL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；
（4）将鸡胚浆液在4℃，5000×g条件下离心20min，收集离心后的上清液；
（5）收集离心后的上清液，将其通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有抗氧化肽的混合液；
（6）将混合液进行冷冻干燥，得到含有抗氧化肽混合物的粉末状产品，密封后放在4℃下低温保存。
实施例2
鸡胚抗氧化混合肽的制备方法：
（1）精选孵化至第15天的鸡蛋，以备加工用；
（2）对鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在4℃下将鸡胚胎用组织匀浆机匀浆后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入-30℃冰箱内低温保存，以备加工用；
（3）将干燥的鸡胚粉末中加入无菌水按照5g粉末/100mL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；
（4）将鸡胚浆液在4℃，5000×g条件下离心20min，收集离心后的上清液；
（5）收集离心后的上清液，将其通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有高活性的抗氧化肽的混合液；
（6）将混合液进行冷冻干燥，得到含有抗氧化肽混合物的粉末状产品，密封后放在4℃下低温保存。
实施例3
鸡胚抗氧化混合肽的活性测定
（1）材料：铁氰化钾、三氯化铁、DPPH、邻苯三酚的标品从Sigma公司购得；三氯乙酸（TFA）等试剂均为色谱级。
（2）活性肽的提取，见实施例1或2。
（3）抗氧化活性的测定：
a. 还原力：
取10mL (1mg/mL)上述超滤液与2.5mL的0.2M磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2.5mL的1%的铁氰化钾溶液混合均匀，在50℃反应20 min，向其中加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液；充分震荡后，将混合液在2000×g的条件下离心10 min；之后吸取2.5mL上清液与2.5mL的去离子水、0.5mL 0.1%的三氯化铁溶液混合，在室温反应10 min，测其在700nm下的吸光值；吸光值越大说明还原力越强，结果见图1。
b．DPPH自由基清除力：
取2mL（1mg/mL）上述超滤液与2mL含有0.1 mM DPPH的95%乙醇混合，在暗处反应30 min，之后在517nm下测其吸光值；另外，将超滤液换做乙醇作为空白对照；
DPPH自由基清除力计算如下：
RSA (%) = (Acontrol-Asample)/Acontrol×100%
其中Asample为样品的吸光值，Acontrol为空白对照的吸光值。结果见图2。
c. 超氧阴离子抑制活性：
将2mg的上述样品粉末与Tris-HCl缓冲液(4.5 mL，50 mmol/L，pH 8.0)混合，反应10 min后加入300μL的邻苯三酚（3mmol/L溶于10mmol/L HCl中），在325nm下测定溶液的吸光值，每间隔30秒测定一次；通过吸光值与时间曲线的斜率得到抑制常数，数值越小说明抑制活性越高。结果见表1。
表1超氧阴离子抑制活性随孵化天数的变化
| 孵化天数 | 3 | 4 | 5 | 6 | 9 | 12 | 15 |
| 抑制曲线斜率 (×10-6) | 40±4.2 | 50±3.5 | 40±2.7 | 40±3.2 | 60±4.1 | 10±1.5 | 8±0.9 |
（4）从图1，图2，表1中可以看出提取的多肽混合液具有很高的抗氧化性，并且随着孵化时间的增长而增强。尤其是孵化到第15天，抗氧化活性达到最大。说明孵化至第3-15天的鸡胚是一种良好的天然抗氧化剂来源，特别是孵化至第15天的鸡胚。
Claims (3)
1.一种鸡胚抗氧化活性混合肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）孵化鸡胚：精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.8℃，相对湿度60%，每2小时翻蛋一次，待孵化至第3-15天，胚胎处于营养成分增长的高峰期，各种器官基本形成，此时取出受精鸡蛋，放入4℃的冰柜中停止孵化并保存，以备加工用；
（2）匀浆，冻干：对步骤（1）孵化鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚，在4℃下将鸡胚用组织匀浆机匀浆后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入-30℃冰箱内低温保存，以备加工用；
（3）无菌水复溶：将步骤（2）所得的鸡胚粉末中加入无菌水，按照5g鸡胚粉末加100mL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；
（4）离心：将鸡胚浆液在4℃，5000×g条件下离心20min，收集离心后的上清液；
（5）超滤：收集步骤（4）离心后的上清液，将其通过截留分子量为3000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有抗氧化肽的混合液；
（6）冻干：将步骤（5）所得的混合液进行冷冻干燥，得到含有抗氧化活性混合肽的粉末状产品，密封后放在4℃下低温保存，为具有抗氧化活性的小分子肽，其分子量小于3000道尔顿。
2.根据权利要求1所述的鸡胚抗氧化活性混合肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中孵化时间为15天。
3.用权利要求1所述的方法制备得到的抗氧化活性混合肽的用途，其特征在于，将其加工成为具有抗氧化功效的食品或药物，或作为功能因子添加到功能性食品或化妆品中。
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