CN103667409A - 一种缓解铅毒性的富硒米肽酶解制备方法 - Google Patents

一种缓解铅毒性的富硒米肽酶解制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于富硒稻米深加工领域，涉及一种缓解铅毒性的富硒米肽酶解制备方法。本发明利用新鲜富硒稻米为原料，将原料磨粉、过筛、脱脂后过夜风干，以碱法提取蛋白质，酸沉后水洗冻干，制成富硒米蛋白。富硒米蛋白经酶解、灭酶活后所得多肽冻干保存，即得本发明产品。本发明的富硒米肽在细胞实验中，能拮抗铅对细胞的毒性作用，明显提高铅中毒细胞的存活率和受试物的半数致死量(IC50值)。本发明所得的富硒米肽具有缓解铅对细胞毒性的作用，制备方法简单、易行，可应用于功能食品的研制和开发。

Description

一种缓解铅毒性的富硒米肽酶解制备方法
一、技术领域
本发明涉及富硒稻米深加工领域，尤其涉及一种缓解铅毒性的富硒米肽的酶解制备方法，属于保健食品开发领域。
二、背景技术
铅是一种对动物和植物均具有严重毒害作用的重金属元素，已被证明在进入人体后主要在骨骼、内脏、血液以及神经系统中蓄积，造成血铅超标与铅中毒，并可致癌与致突变，直接诱导细胞凋亡。水体、土壤、大气以及粮农作物等极易受到铅的污染，蓄积的铅毒通过皮肤与消化道直接进入人体，经循环系统分布并沉积在人体内。由于代谢与排泄都极为缓慢，铅对靶器官造成的损伤持续且不可逆转。铅中毒已成为最为严峻的重金属危害之一。近年来重金属铅的致毒机制与铅毒的预防和解除受到了医学与营养健康领域的高度关注，寻找能够驱铅，拮抗铅的毒性作用的功能食品是缓解铅中毒的理想解决方案。
硒是一种人类和动物生长发育所必需的微量营养元素，具有调控生物体生殖、发育、代谢、免疫等过程的生物学机能，被誉为生物医学领域的“奇效元素”。硒在生物活性成分中大多以硒代氨基酸，硒多肽以及硒蛋白的形式存在，其参与构成的25种硒酶与硒蛋白，与抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫力、预防心脑血管及地方性疾病，尤其是近年来颇受关注的减弱重金属毒性等生物学功能密切相关。已有学者的研究证明，硒具有缓解重金属中毒，拮抗铅毒，促进排铅的特殊生理功能。利用天然含硒产物深加工以制备缓解铅对生物体的毒理作用具有现实性的研究价值。
富硒米蛋白具有营养价值丰富，过敏性低，生物活性明显高于普通稻米蛋白等突出优势，选用优质高值富硒农产品——富硒稻米为提取原料，是一种前景广阔的富硒作物深加工产品。目前稻米蛋白的提取方法已经十分成熟，相较酶法与超声辅助等方法，碱法提取因原材料损失少，蛋白得率高、提取成本低，工艺条件简单可控而得到广泛的应用。许多研究表明，将稻米蛋白酶解后得到的稻米多肽甚至小分子氨基酸残基，其生物活性均高于未酶解的稻米蛋白。在生物学实验中，普遍选用反应温和、天然成分不受破坏的体外酶解条件制备稻米多肽。稻米蛋白酶解物抗氧化、抗衰老与预防疾病、免疫调节的作用已受到许多学者的关注，研究携带硒元素为活性中心的富硒米肽在生物医学与营养保健领域具有重要的研究价值。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种缓解铅毒性的富硒米肽的酶解制备方法，对富硒稻米进行合理有效深加工，可应用于保健食品的研发。
技术方案
本发明的一种缓解铅毒性的富硒米肽是通过以下技术方案实现的：
(1)原料预处理：选取新鲜富硒稻米为原料，磨成粉末后过80目筛；
(2)脱脂：将富硒米样品按照料液比1∶4～1∶6配比后，借助磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)浸提脱脂两次，每次3～4h，4500g离心15min，收集沉淀，置于鼓风干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35℃下，通风2h至干燥；
(3)碱法提取蛋白质：将干燥后的富硒米粉按照料液比1∶15～1∶20与浓度为0.02～0.07mol／L的NaOH溶液配比后，搅拌均匀，设置温度35～40℃，于恒温振荡器(SHA-B，金坛市荣华仪器制造有限公司)上恒温震荡提取2.5～3h，4500g离心15min，收集上清液，重复此法碱提2～3次，合并上清液；
(4)酸沉：用0.01～0.02mol／L的HCl溶液调(3)中蛋白液pH至等电点(4.8)，待大量蛋白质沉淀析出后，4500g离心15min，收集沉淀；
(5)水洗：将上述沉淀用去离子水按照料液比1∶10～1∶20洗涤后，4500g离心15min，弃去上清液，重复水洗2～3次；
(6)冻干：将(5)所得富硒米蛋白分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻12～15h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒米蛋白保存于-4℃冰箱备用；
(7)酶解：将(6)中所述富硒米蛋白制成底物浓度3％～5％的悬浊液，按照酶比底物浓度8％～12％加入胰蛋白酶，用0.05mol／LNaOH调节体系pH至8.0～9.0附近，置磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)搅拌同时，控制温度45～50℃水浴3.5～4h；
(8)灭酶活：升温至90～95℃，保持10～15min，将胰蛋白酶灭活；
(9)冻干：待(8)所得富硒米肽悬浊液冷却后分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻12～15h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒米肽产品保存于-4℃冰箱备用。
有益效果
(1)本发明选取富硒稻米作为原材料，提取富硒稻米蛋白并进一步酶解，制备出能缓解铅毒性的富硒米肽(制备工艺见图1)，合理的利用了富硒碎米和富硒米糠等稻米加工副产物，避免农产品废弃物的资源浪费。
(2)本发明制备的富硒米肽比普通米肽的硒含量高，可作为硒缺乏地区以及缺硒人群的膳食补充剂和营养强化剂进行推广。表1为富硒米肽与普通米肽的硒含量对比。
表1富硒米肽与普通米肽的硒含量
(3)本发明制备的富硒米肽具有缓解铅毒性的活性，可起到排除铅毒性，促进人体健康的作用。在细胞实验中，在80～100mg/L的富硒米肽终浓度范围内，能缓解铅对小鼠巨噬细胞RAW264.7的毒性作用，一定程度上保护细胞免受铅毒性的伤害，且效果明显优于普通米肽(图2)。选取富硒米肽浓度100mg／L为实验剂量，细胞实验表明，富硒米肽对于5～1600μmol／L浓度范围内的PbCl2铅毒性均有明显的缓解作用，提高了细胞的存活率以及受试物对小鼠巨噬细胞的半数致死量(IC50值)：富硒米肽实验组、普通米肽实验组与染铅对照组IC50值分别为：16322.1μmol／L，1041.3μmol／L和311.0μmol／L(图3)。
四、附图说明
图1富硒米肽酶解制备工艺流程图。
图2本发明所得的富硒米肽在细胞实验中对铅毒性的缓解作用。
图3本发明所得的富硒米肽在细胞实验中对受试IC50值(半数致死剂量)的影响。
发明的具体实施方式
实施例1
(1)原料预处理：选取新鲜富硒稻米为原料，磨成粉末后过80目筛；
(2)脱脂：将富硒稻米样品按照料液比1∶5配比后，借助磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)浸提脱脂两次，每次4h，4500g离心15min，收集沉淀，置于鼓风干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35℃下，通风2h至干燥；
(3)碱法提取蛋白质：将干燥后的富硒大米粉按照料液比1∶15与浓度为0.02mol／L的NaOH溶液配比后，搅拌均匀，设置温度40℃，于恒温振荡器(SHA-B，金坛市荣华仪器制造有限公司)上恒温震荡提取2.5h，4500g离心15min，收集上清液，重复此法碱提3次，合并上清液；
(4)酸沉：用0.02mol／L的HCl溶液调(3)中蛋白液pH至等电点(4.8)，待大量蛋白质沉淀析出后，4500g离心15min。收集沉淀；
(5)水洗：将上述沉淀用去离子水按照料液比1∶10洗涤后，4500g离心15min，弃去上清液，重复水洗3次；
(6)冻干：将(5)所得富硒米蛋白分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻12h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒大米蛋白保存于-4℃冰箱备用；
(7)酶解：将(6)中所述富硒蛋白制成底物浓度3％～5％的悬浊液，按照酶比底物浓度8％加入胰蛋白酶，用0.05mol／LNaOH调节体系pH至8.0，置磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)搅拌的同时，控制温度45℃水浴3.5h；
(8)灭酶活：升温至90℃，保持10min，将胰蛋白酶灭活；
(9)冻干：待(8)所得富硒米肽悬浊液冷却后分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻12h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒米肽保存于-4℃冰箱备用。
实施例2
(1)原料预处理：选取新鲜富硒稻米为原料，磨成粉末后过80目筛；
(2)脱脂：将富硒稻米样品按照料液比1∶4配比后，借助磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)浸提脱脂两次，每次4h，4500g离心15min，收集沉淀，置于鼓风干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35℃下，通风2h至干燥；
(3)碱法提取蛋白质：将干燥后的富硒米蛋白按照料液比1∶20与浓度为0.05mol／L的NaOH溶液配比后，搅拌均匀，设置温度35℃，于恒温振荡器(SHA-B，金坛市荣华仪器制造有限公司)上恒温震荡提取3h，4500g离心15min，收集上清液，重复此法碱提2次，合并上清液；
(4)酸沉：用0.02mol／L的HCl溶液调(3)中蛋白液pH至等电点(4.8)，待大量蛋白质沉淀析出后，4500g离心15min。收集沉淀；
(5)水洗：将上述沉淀用去离子水按照料液比1∶10～1∶20洗涤后4500g，离心15min离心，弃去上清液，重复水洗2～3次；
(6)冻干：将(5)所得富硒米蛋白分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻14h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒大米蛋白保存于-4℃冰箱备用；
(7)酶解：将(6)中所述富硒米蛋白制成底物浓度3％～5％的悬浊液，按照酶比底物浓度10％加入胰蛋白酶，用0.05mol／LNaOH调节体系pH至8.5，置磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)搅拌的同时，控制温度50℃水浴3.5h；
(8)灭酶活：升温至90℃，保持15min，将胰蛋白酶灭活；
(9)冻干：待(8)所得富硒米肽悬浊液冷却后分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻14h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒米肽保存于-4℃冰箱备用。
实施例3
(1)原料预处理：选取新鲜富硒稻米为原料，磨成粉末后过80目筛；
(2)脱脂：将富硒稻米样品按照料液比1：6配比后，借助磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)浸提脱脂两次，每次4h，4500g离心15min，收集沉淀，置于鼓风干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35℃下，通风2h至干燥；
(3)碱法提取蛋白质：将干燥后的富硒米蛋白按照料液比1∶18与浓度为0.07mol／L的NaOH溶液配比后，搅拌均匀，设置温度40℃，于恒温振荡器(SHA-B，金坛市荣华仪器制造有限公司)上恒温震荡提取2.5h，4500g离心15min，收集上清液，重复此法碱提3次，合并上清液；
(4)酸沉：用0.02mol／L的HCl溶液调(3)中蛋白液pH至等电点(4.8)，待大量蛋白质沉淀析出后，4500g离心15min，收集沉淀；
(5)水洗：将上述沉淀用去离子水按照料液比1∶15洗涤后4500g，离心15min离心，弃去上清液，重复水洗3次；
(6)冻干：将(5)所得富硒米蛋白分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻15h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒大米蛋白保存于-4℃冰箱备用；
(7)酶解：将(6)中所述富硒米蛋白制成底物浓度3％～5％的悬浊液，按照酶比底物浓度9％加入胰蛋白酶，用0.05mol／LNaOH调节体系pH至8.5，置磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)搅拌的同时，控制温度45℃水浴3.5h；
(8)灭酶活：升温至90℃，保持10min，将胰蛋白酶灭活；
(9)冻干：待(8)所得富硒米肽悬浊液冷却后分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻15h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒米肽保存于-4℃冰箱备用。

Claims (7)

1.一种缓解铅对小鼠巨噬细胞RAW264.7毒性的富硒米肽的酶解制备方法，其特征在于包括以下制备步骤和工艺条件：
(1)原料预处理：选取新鲜富硒稻米为原料，磨成粉末后过80目筛；
(2)脱脂：将富硒稻米样品按照料液比1∶4～1∶6配比后，借助磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)浸提脱脂两次，每次3～4h，4500g离心15min，收集沉淀，置于电热鼓风干燥箱(DHG-9030A，上海一恒科技有限公司)，35℃下通风2h至干燥；
(3)碱法提取蛋白质：将干燥后的富硒米粉按照料液比1∶15～1∶20与浓度为0.02～0.07mol／L的NaOH溶液配比后，搅拌均匀，设置温度35～40℃，于恒温振荡器(SHA-B，金坛市荣华仪器制造有限公司)上提取2.5～3h，4500g离心15min，收集上清液，重复此法碱提2～3次，合并上清液；
(4)酸沉：用0.01～0.02mol／L的HCl溶液调(3)中蛋白液pH至等电点(4.8)，待大量蛋白质沉淀析出后，4500g离心15min，收集沉淀；
(5)水洗：将上述沉淀用去离子水按照料液比1∶10～1∶20洗涤后，4500g离心15min，弃去上清液，重复水洗2～3次；
(6)冻干：将(5)所得富硒米蛋白分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻12～15h，取出放入真空冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒米蛋白保存于-4℃冰箱备用；
(7)酶解：将(6)中所述富硒米蛋白制成底物浓度3％～5％的悬浊液，按照酶比底物浓度8％～12％加入胰蛋白酶，用0.05mol／LNaOH调节体系pH至8.0～9.0附近，置磁力搅拌器(JB-5，金坛市精达仪器制造有限公司)搅拌的同时，控制温度45～50℃水浴3.5～4h；
(8)灭酶活：升温至90～95℃，保持10～15min，将胰蛋白酶灭活；
(9)冻干：待(8)所得富硒米肽悬浊液冷却后分装入培养皿，表面用保鲜膜包裹，在-20℃冰箱中预冻12～15h，取出放入冷冻干燥机(Lg-5A，上海离心机械研究所)24h，将所得富硒米肽产品保存于-4℃冰箱备用。
2.根据权利要求1所述的富硒米肽的制备方法，其特征在于(3)碱法提取蛋白质：将脱脂后的富硒大米用0.02～0.07mol／L的NaOH溶液，按照料液比1∶15～1∶20均匀混合后，35～40℃震荡提取2.5～3h。
3.根据权利要求1所述的富硒米肽的制备方法，其特征在于(4)酸沉：0.01～0.02mol／L的稀HCl调节富硒米蛋白悬浊液至等电点(4.5～5.5)，待有大量蛋白质沉淀析出后，4500g离心15min，收集沉淀。
4.根据权利要求1所述的富硒米肽的制备方法，其特征在于(7)酶解：用胰蛋白酶对底物浓度3％～5％的富硒米蛋白悬浊液，按照酶比底物浓度8％～12％进行酶解，0.05mol／LNaOH调节体系pH至8.0～9.0附近，磁力搅拌的同时，控制温度45～50℃水浴3.5～4h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，获得的具有缓解铅对细胞毒性作用的富硒米肽产品。
6.一种缓解铅对细胞毒性的方法，其特征在于：以一定浓度按照权利要求1方法提取的富硒米肽作为拮抗添加物加入细胞DMEM培养基中，缓解和拮抗浓度范围在5～1600μmol／L的重金属铅(PbCl2)对于小鼠巨噬细胞RAW264.7的毒害作用；
7.根据权利要求6所述的缓解铅对细胞毒性的方法，其特征在于：所述富硒酶解肽的浓度在80～100mg/L之间，既能很好地缓解5～1600μmol／L浓度范围内铅(PbCl2)对细胞的毒性作用，又符合在大米硒肽对细胞的安全作用浓度范围(10～120μg／L)。
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