CN111060468A - 一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法 - Google Patents

一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速检测甲壳素中蛋白质的方法，属于蛋白质检测技术领域。检测方法包括如下步骤：（1）称取样品，加入0.5mol/L NaOH溶液，水浴后抽滤，得到收集液1；（2）收集残渣加入0.3mol/L NaOH溶液，水浴后抽滤，得到收集液2；（3）收集残渣加入0.2mol/L NaOH溶液，水浴后抽滤，得到收集液3；（4）将三次收集液分别吸取1mL于10mL样品比色管中，另分别吸取浓度为100μg/mL的蛋白质标准溶液0 mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL标准比色管中，向6支标准比色管加入1%NaCl溶液1mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0 mL，使其体积为1.0mL,于标准比色管和样品比色管中加入考马斯亮蓝G250溶液5.0 mL,混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度。（5）通过计算公式，计算得到总的蛋白质含量。

Description

一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法
技术领域
本发明属于蛋白质检测技术领域，尤其涉及一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法。
背景技术
甲壳素（C8H13O5N）n，又称甲壳质，英文名Chitin.是主要存在于甲壳类动物外壳中的一种功能性物质，经工艺提取，产品为白色片状物质，甲壳素无臭、无味，不溶于水、稀酸、稀碱及其它有机溶剂。
目前，甲壳素主要用于生产壳聚糖的原料，壳聚糖普遍应用于医药、美容、工业等领域。作为一种现代保健食品，壳聚糖具有增加免疫力、护肝解毒等功效。随着甲壳素向高科技产业的发展，甲壳素工艺中蛋白质的残留含量已作为甲壳素质量的一个主要指标。在生产甲壳质的工艺中，需要用稀盐酸溶液脱去碳酸钙，然后用稀氢氧化钠溶液洗脱去蛋白质，在工业生产中，甲壳素产品中蛋白质难以完全脱除，且甲壳素不溶于水，难以直接测定其蛋白质含量及变化。目前测定蛋白质含量的方法主要有福林酚试剂法、紫外分光光度法和考马斯亮蓝G-250法，福林酚试剂法操作要求严格计时耗费时间常，灵敏度不高，且蛋白质之间的变动大、干扰物较多，如硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、各种硫醇对检测结果的准确性有较大影响。紫外分光光度法无样品损耗，但是干扰物质也比较多，如各种核苷酸。因此，目前，尚无一种高效的检测甲壳素中蛋白质含量的方法。
发明内容
本发明的目的提供一种能够快速且准确检测甲壳素中蛋白质含量的方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）样品前处理
A.称取甲壳素样品，加入0.5mol/L NaOH溶液，80℃水浴1h；
B.冷却后，使用抽滤瓶过滤残渣，将收集液1转移到100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用（1+5）Hcl溶液调节PH值至中性，用纯水定容后待测；
C.将残渣1收集至锥形瓶中，加入0.3mol/L NaOH溶液，80℃水浴1h；
D.冷却后，使用抽滤瓶过滤残渣，将收集液2转移到100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用（1+7）Hcl溶液调节PH值至中性，用纯水定容后待测；
E.将残渣2收集至锥形瓶中，加入0.2mol/L NaOH溶液，70℃水浴1h；
F.冷却后，使用抽滤瓶过滤残渣，将收集液3转移到100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用（1+7）Hcl溶液调节PH值至中性，用纯水定容后待测；
（2）样品检测
A.将收集液1，收集液2和收集液3分别吸取1mL于10mL样品比色管中；
B.分别吸取100μg/mL 的蛋白质标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL标准比色管中；
C.向6支标准比色管中加入1% Nacl溶液1mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0 mL，使其体积为1mL；
D.于6支标准比色管和3支样品比色管中加入5mL考马斯亮蓝G250溶液，混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度，
E.通过计算公式，计算3支样品的蛋白质含量，合并3次结果得到总的蛋白质含量。
优选地，所述检测方法的计算公式为：
公式中：
X--试样中蛋白质含量（%）；
C--从标准曲线上得到蛋白质溶液浓度，单位为微克（μg）；
V1--样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
V2--样品溶液待测体积位为毫升（mL）；
m--样品溶液所代表的试样的质量，单位为微克（μg）。
优选地，所述甲壳素样品质量与所述0.5mol/L NaOH溶液用量的比值为2g：50mL；所述甲壳素样品质量与所述0.3mol/L NaOH溶液用量的比值为2g:50mL；
所述甲壳素样品质量与所述0.2mol/L NaOH溶液用量的比值为2g:50mL。
优选地，所述考马斯亮蓝G250溶液的配置方法为100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95%乙醇溶液中，加入180g柠檬酸，20g硼酸，溶解后定容至1L。
本发明的有益效果在于：
1.本发明检测方法的加标回收率效果良好，加标回收率在90%-100%之间。
2.本发明采用NaOH溶液3次提取的方式，将甲壳素中的蛋白质完全的提取出来，且采用NaOH浓度递减的方式进行提取，既保证了优异的提取效果，又起到了节约成本的效果。
3.本发明所使用的考马斯亮蓝溶液使用硼酸和柠檬酸代替磷酸，因此，检测时无磷污染，且溶液的缓冲能力强，检测结果稳定，重现性好。
附图说明
图1 蛋白质标准曲线。
具体实施方式
本发明所使用的试剂和材料
考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂，牛血清白蛋白，纯度≥99%，氯化钠（分析纯），柠檬酸（分析纯），硼酸（分析纯），无水乙醇（分析纯），氢氧化钠（分析纯），盐酸（分析纯），PH试纸，甲壳素样品。
本发明所使用的仪器和设备
分析天平：0.01g-0.1mg，紫外分光光度计，水浴锅，抽滤装置。
实施例1
（1）准备4个250mL具塞锥形瓶，编号为1-4, 称取处理好的甲壳素1号样品2.000g，其中3号4号为加标样品，3号加入10μg标准蛋白溶液，4号加入20μg标准白蛋白溶液；
（2）将四个锥形瓶中各加入50mL 0.5mol/L NaOH溶液，于80℃水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+5)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（3）将残渣收集于2号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.3mol/L NaOH溶液，再次放入80℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（4）将残渣收集于3号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.2mol/L NaOH溶液，放入70℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（5）将三次收集液分别吸取1.0mL于10mL比色管中，另分别吸取浓度为100 μg/mL的蛋白质标准溶液0 .0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL比色管中，向6支标准管加入1% NaCl溶液1.0mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0.0 mL，使其体积为1.0mL,于标准管和样品管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5 .0mL,混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度，根据标准曲线求得甲壳素中蛋白质的含量，同时计算加标样品的回收率。
实施例2
（1）准备4个250mL具塞锥形瓶，编号为1-4, 称取处理好的甲壳素2号样品2.000g，其中3号4号为加标样品，3号加入10μg标准蛋白溶液，4号加入20μg标准蛋白溶液；
（2）将四个锥形瓶中各加入50mL 0.5mol/L NaOH溶液，于80℃水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+5)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（3）将残渣收集于2号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.3mol/L NaOH溶液，再次放入80℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（4）将残渣收集于3号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.2mol/L NaOH溶液，放入70℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测.
（5）将三次收集液分别吸取1.0mL于10mL比色管中，另分别吸取浓度为100 μg/mL的蛋白质标准溶液0.0 mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL比色管中，向6支标准管加入1% NaCl溶液1.0mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0 mL，使其体积为.01mL,于标准管和样品管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL,混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度，根据标准曲线求得甲壳素2号中蛋白质的含量，同时计算加标样品的回收率。
实施例3
（1）准备4个250mL具塞锥形瓶，编号为1-4, 称取处理好的甲壳素3号样品2.000g，其中3号4号为加标样品，3号加入10μg标准蛋白溶液，4号加入20μg标准蛋白溶液；
（2）将四个锥形瓶中各加入50mL 0.5mol/L NaOH溶液，于80℃水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+5)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（3）将残渣收集于2号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.3mol/L NaOH溶液，再次放入80℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（4）将残渣收集于3号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.2mol/L NaOH溶液，放入70℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（5）将三次收集液分别吸取1.0mL于10mL比色管中，另分别吸取浓度为100 μg/mL的蛋白质标准溶液0 mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL比色管中，向6支标准管加入1% NaCl溶液1.0mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0 mL，使其体积为1mL,于标准管和样品管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL,混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度，根据标准曲线求得甲壳素3号中蛋白质的含量，同时计算加标样品的回收率。
实施例4
（1）准备4个250mL具塞锥形瓶，编号为1-4, 称取处理好的甲壳素4号样品2.000g，其中3号4号为加标样品，3号加入10μg标准蛋白溶液，4号加入20μg标准蛋白溶液；
（2）将四个锥形瓶中各加入50mL 0.5mol/L NaOH溶液，于80℃水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+5)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（3）将残渣收集于2号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.3mol/L NaOH溶液，再次放入80℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（4）将残渣收集于3号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.2mol/L NaOH溶液，放入70℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（5）将三次收集液分别吸取1.0mL于10mL比色管中，另分别吸取浓度为100 μg/mL的蛋白质标准溶液0 mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL比色管中，向6支标准管加入1% NaCl溶液1.0mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0 mL，使其体积为1mL,于标准管和样品管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL,混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度，根据标准曲线求得甲壳素4号中蛋白质的含量，同时计算加标样品的回收率。
实施例5
（1）准备4个250mL具塞锥形瓶，编号为1-4, 称取处理好的甲壳素5号样品2.000g，其中3号4号为加标样品，3号加入10μg标准蛋白溶液，4号加入20μg标准蛋白溶液；
（2）将四个锥形瓶中各加入50mL 0.5mol/L NaOH溶液，于80℃水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+5)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（3）将残渣收集于2号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.3mol/L NaOH溶液，再次放入80℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（4）将残渣收集于3号250mL具塞锥形瓶中，加入50mL 0.2mol/L NaOH溶液，放入70℃水浴中水浴1h,取出，冷却后用抽滤瓶过滤残渣，将收集液转移至100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用(1+7)Hcl溶液调节pH至中性，用纯水定容后待测；
（5）将三次收集液分别吸取1.0mL于10mL比色管中，另分别吸取浓度为100 μg/mL的蛋白质标准溶液0 mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL比色管中，向6支标准管加入1% NaCl溶液1.0mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0 mL，使其体积为1mL,于标准管和样品管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0 mL,混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度，根据标准曲线求得甲壳素5号中蛋白质的含量，同时计算加标样品的回收率。
实验结果
加标回收率统计结果如下：
表1加标回收率结果
样品名称 甲壳素1号 甲壳素2号 甲壳素3号 甲壳素4号 甲壳素5号
加标量（μg） 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
测得C含量（μg） 9.62 9.85 9.89 9.92 9.91
回收率(%) 96.2 98.5 98.9 99.2 99.1
加标量（μg） 20.0 20.0 20.0 20.0 20.0
测得C含量（μg） 19.85 19.79 19.92 19.86 19.82
回收率（%） 99.25 98.95 99.60 99.30 99.10

Claims (4)

1.一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）样品前处理
A.称取甲壳素样品，加入0.5mol/L NaOH溶液，80℃水浴1h；
B.冷却后，使用抽滤瓶过滤残渣，将收集液1转移到100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用（1+5）Hcl溶液调节PH值至中性，用纯水定容后待测；
C.将残渣1收集至锥形瓶中，加入0.3mol/L NaOH溶液，80℃水浴1h；
D.冷却后，使用抽滤瓶过滤残渣，将收集液2转移到100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用（1+7）Hcl溶液调节PH值至中性，用纯水定容后待测；
E.将残渣2收集至锥形瓶中，加入0.2mol/L NaOH溶液，70℃水浴1h；
F.冷却后，使用抽滤瓶过滤残渣，将收集液3转移到100mL容量瓶中，加入一滴甲基红指示剂，用（1+7）Hcl溶液调节PH值至中性，用纯水定容后待测；
（2）样品检测
A.将收集液1，收集液2和收集液3分别吸取1mL于10mL样品比色管中；
B.分别吸取100μg/mL 的蛋白质标准溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL于6支10mL标准比色管中；
C.向6支标准比色管中加入1% Nacl溶液1mL、0.9 mL、0.8 mL、0.6 mL、0.2 mL、0 mL，使其体积为1mL；
D.于6支标准比色管和3支样品比色管中加入5mL考马斯亮蓝G250溶液，混匀，静置10min后于595nm处测定其吸光度；
E.通过计算公式，计算3支样品的蛋白质含量，合并3次结果得到总的蛋白质含量。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述计算公式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
公式中：
X---试样中蛋白质含量（%）；
C ---从标准曲线上得到蛋白质溶液浓度，单位为微克（μg）；
V1---样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；
V2--样品溶液待测体积位为毫升（mL）；
m ---样品溶液所代表的试样的质量，单位为微克（μg）。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法，其特征在于，所述甲壳素样品质量与所述0.5mol/L NaOH溶液用量的比值为2g：50mL；所述甲壳素样品质量与所述0.3mol/L NaOH溶液用量的比值为2g:50mL；
所述甲壳素样品质量与所述0.2mol/L NaOH溶液用量的比值为2g:50mL。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测甲壳素中蛋白质含量的方法，所述考马斯亮蓝G250溶液的配置方法为100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇溶液中，加入180g柠檬酸，20g硼酸，溶解后定容至1L。
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