CN108956488A - 一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：(1)配制库马斯亮蓝G‑250试液；(2)称取壳聚糖或壳聚糖盐样品，制得浓度为5mg/ml的样品溶液；(3)配制不同浓度的蛋白质标准溶液，加入库马斯亮蓝G‑250试液，绘制吸光度‑‑‑浓度曲线；(4)向样品溶液中加入库马斯亮蓝G‑250试液，测定样品溶液在595nm处的吸光度，计算样品中蛋白质含量。本发明通过在低于2％的盐酸浓度的条件下，采用超声处理15min并在100℃水浴处理待检测的壳聚糖/壳聚糖盐体系，然后通过特定浓度的库马斯亮蓝G‑250进行染色，经595nm处的吸光度值进行检测，可以显著提高蛋白质检测数值的准确度。
Description
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，属于蛋白检测技术领域。
背景技术
库马斯亮蓝(Coomassie Bri1liant Blue)G-250是一种具有两种色调，在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后转为青色，且其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比的检测试剂。其颜色在 595nm处有最大光吸处，可用分光光度计进行测定。由于其特殊的性质，使其在蛋白质检测领域被广泛的应用。
YY/T 0606.7-2008中详细记载了利用库马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)G-250检测壳聚糖中的蛋白质的方法。包括库马斯亮蓝G-250试液的配制：称取库马斯亮蓝G-250 100mg 溶解于50mL的95％乙醇中，再加入85％的磷酸100mL，并用蒸馏水稀释至1000mL，置于棕色瓶内，室温贮存。蛋白质标准液(30μg/mL)的配制：精确吸取5％牛血清白蛋白标准液0.6 mL于1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度,4℃下贮存。样品准备：精确称取105℃±2℃干燥至恒重的壳聚糖/壳聚糖盐约0.005g，置于样品管中，加1mL1％醋酸溶液/蒸馏水后，充分振荡混匀，使其完全溶解。测定步骤：制备蛋白质标准液系列，在标准液系列的各试管及样品试管中分别加入5mL的库马斯亮蓝G-250溶液。用漩涡式混合器使试管中溶液充分混合,并在室温20℃士10℃下放置15min。用不含蛋白质的样品作对照，用分光光度计测定 595nm处各标准管和样品管的吸光度。用标准管绘制吸光度---浓度曲线，根据样品的吸光度按标准曲线计算样品管的蛋白质浓度。然后按下式计算蛋白质含量ρ3(％):
式中：
ρ1——样品管中壳聚糖或壳聚糖盐浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)
ρ2——样品管中蛋白质浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)
但在实际检测过程中，发明人发现上述检测方法与实际蛋白质含量之间有一定差异，从而无法满足在壳聚糖或壳聚糖盐中对蛋白质的高精度检测。
虽然后续有科研人员对上述方法做了改进(韩婷、史国华等，《壳聚糖中蛋白质含量测定方法的研究》在《中国医疗器械杂志》2016年40卷第2期)，采用盐酸替换磷酸实现了防止壳聚糖沉淀的问题，提高了蛋白质含量测定的准确度，但依然无法满足高精度蛋白质含量检测的需求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法。
本发明技术方案如下：
一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：
(1)将库马斯亮蓝溶解于体积百分比浓度为95％的乙醇溶液中，加入浓盐酸，库马斯亮蓝G-250与浓盐酸的质量体积比为2:1，单位为mg/ml，蒸馏水稀释至库马斯亮蓝浓度为100mg/L，制得库马斯亮蓝G-250试液；
(2)称取103～107℃干燥至恒重的壳聚糖或壳聚糖盐样品，溶解于质量百分比浓度为 1％的醋酸溶液中，混合均匀，超声波处理，然后沸水浴中处理25～35min，制得浓度为5mg/ml 的样品溶液；
(3)配制不同浓度的蛋白质标准溶液，加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液，测定595nm处各标准溶液的吸光度，绘制吸光度---浓度曲线；
(4)向步骤(2)制得的样品溶液中加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液，测定样品溶液在595nm处的吸光度，计算样品中蛋白质含量。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，超声波处理条件为：温度20～24℃，频率35～45kHz，功率为400～500W，时间为12～18min。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，超声波处理条件为：温度22℃，频率40kHz，功率为500W，时间为15min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，不同浓度的蛋白质标准溶液采用如下步骤配制：
(i)精确吸取5％牛血清白蛋白标准液0.6mL，蒸馏水稀释定容至1000mL，制得浓度为30μg/mL的蛋白质标准溶液；
(ii)分别取步骤(i)配制的浓度为30μg/mL的蛋白质标准溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml，然后分别加入质量百分比浓度为1％的醋酸溶液1.0ml、0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.2ml、0ml，制得蛋白质浓度为0ug/mL、3ug/mL、6ug/mL、12ug/mL、24ug /mL、30ug/mL的蛋白质标准溶液。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，库马斯亮蓝G-250试液的添加量为每毫升蛋白质样品溶液添加5ml库马斯亮蓝G-250试液。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，计算样品中蛋白质含量的步骤如下：
将测定样品溶液在595nm处的吸光度值代入步骤(3)中的吸光度---浓度曲线，计算获得样品蛋白质浓度ρ2，代入下式，计算获得样品中蛋白质含量ρ3；
式中：
ρ1——样品溶液中壳聚糖或壳聚糖盐浓度，单位为微克每毫升，
ρ2——样品溶液中蛋白质浓度，单位为微克每毫升。
检测原理
利用库马斯亮蓝G-250检测壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的过程中，由于壳聚糖溶于 pH小于6的酸性溶液中，因其等电点在6-6.5之间，所以在低pH中，壳聚糖的氨基基团质子化带正电荷而易溶，随着pH增加，壳聚糖氨基基团则去质子化不带电从而不溶。但本领域研究人员同时研究发现，在体系反应相同的时间，盐酸浓度越高，吸光度值越小，灵敏度越差。因此，现有技术认为选择盐酸浓度为5％实现壳聚糖的溶解和吸光度灵敏度的平衡是一个最佳的选择。但发明人通过研究发现，当采用1.85％的盐酸浓度配合超声波处理后，不仅可以解决壳聚糖溶解问题，而且当在595nm处的吸光度值进行检测时，可以显著提高蛋白质检测数值的准确度，这完全出乎了本领域技术人员的预料。发明人推测，可能是由于在低于2％的盐酸浓度的条件下，采用超声处理15min并在100℃水浴处理后，纯粹采用物理方法加强壳聚糖在1％的醋酸溶液中的溶解性，更利于形成均一的水相，从而使该体系中只有蛋白质和染色剂形成青色络合物，在595nm条件下具有自己独特的吸光度值。
有益效果
本发明通过在低于2％(1.85％)的盐酸浓度的条件下，采用超声处理15min并在100℃水浴处理待检测的壳聚糖/壳聚糖盐体系，然后通过特定浓度的库马斯亮蓝G-250进行染色，经595nm处的吸光度值进行检测，可以显著提高蛋白质检测数值的准确度。
附图说明
图1是实施例1的吸光度---浓度曲线结果照片；
图2是对比例1的吸光度---浓度曲线结果照片；
图3是对比例2的吸光度---浓度曲线结果照片；
图4是对比例3的吸光度---浓度曲线结果照片；
图5是对比例4的吸光度---浓度曲线结果照片；
图6是对比例5的吸光度---浓度曲线结果照片；
具体实施方式
下面结合实例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
原料来源
库马斯亮蓝G-250购自SIGMA公司，CAS:6104-58-1lot#BCBL9406V；
牛血清白蛋白(粉末)购自Solarbio公司，CAT.NO.A8010，纯度≥98％；
浓盐酸购自J.T.Baker公司，浓度36.5-38％,Batch No:0000155827；
壳聚糖来源于山东大正医疗器械股份有限公司，蛋白质含量指标为＜0.2％。
实例中所用试剂均为分析纯。
实施例1
一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：
(1)称取库马斯亮蓝G-250 100mg溶解于50mL的95％乙醇中,再加入浓盐酸50mL,并用蒸馏水稀释至1000mL,制得库马斯亮蓝G-250试液；
(2)称取105℃干燥至恒重的壳聚糖样品0.005g，溶解于1mL质量百分比浓度为1％的醋酸溶液中，混合均匀，在温度22℃、频率40kHz、功率500W条件下超声波处理15min，然后沸水浴中处理30min，制得浓度为5mg/ml的样品溶液；
(3)配制不同浓度的蛋白质标准溶液，加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液，测定595nm处各标准溶液的吸光度，绘制吸光度---浓度曲线；
配制浓度为30μg/mL的蛋白质标准液:精确吸取5％牛血清白蛋白标准液0.6mL于1000 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度,4℃下贮存；
按表1配制蛋白质标准液系列：
表1
| 试管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 蛋白质标准溶液/mL | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.0 |
| 1％醋酸溶液-蒸馏水/mL | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.2 | 0 |
| 蛋白质浓度/(ug/mL) | 0 | 3 | 6 | 12 | 24 | 30 |
在标准液系列的各试管及样品试管中分别加入步骤(1)配制的库马斯亮蓝G-250试液 5mL，用漩涡式混合器使试管中溶液充分混合,并在室温20℃士10℃下放置15min；用0号管作对照，用分光光度计测定595nm处各标准管和样品管的吸光度。
用标准管绘制吸光度---浓度曲线,根据样品的吸光度按标准曲线计算样品管的蛋白质浓度，标准溶液检测数据如表2所示：
表2
| 标准溶液浓度(ug/mL) | 3.33 | 6.67 | 13.33 | 26.67 | 33.33 |
| 吸光度 | 0.0126 | 0.0263 | 0.0442 | 0.0779 | 0.0971 |
根据表2的数据绘制吸光度---浓度曲线，如图1所示，
线性相关方程：C＝365.53×A-2.2058r＝0.9985
(4)向步骤(2)制得的样品溶液中加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液5mL，用漩涡式混合器使试管中溶液充分混合,并在室温20℃士10℃下放置15min；测定样品溶液在595nm处的吸光度，计算样品中蛋白质含量。
经检测，样品溶液的吸光度值为：YA1＝0.0230YA2＝0.0251
代入线性方程得其浓度为C1＝6.14ug/mL C2＝6.47ug/mL
按下式计算壳聚糖中蛋白质含量ρ3(％):
式中：
ρ1——样品管中壳聚糖浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)
ρ2——样品管中蛋白质浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)
壳聚糖称样量为5.85mg和5.97mg,经计算，蛋白质含量为6.14/(5.85×1000)×100％＝0.105％，6.47/(5.97×1000)×100％＝0.108％。
对比例1
采用韩婷、史国华等，《壳聚糖中蛋白质含量测定方法的研究》在《中国医疗器械杂志》 2016年40卷第2期中记载的方法检测实施例1的样品壳聚糖。标准溶液及样品测得数据如下：
| 标准溶液浓度(ug/mL) | 3.02 | 6.04 | 12.07 | 24.15 | 30.20 |
| 吸光度 | -0.0021 | 0.0002 | 0.0006 | 0.0013 | 0.0028 |
线性方程为C＝5970.3A+11.700r＝0.9104r＜0.996,说明此方程可信度很低，样品溶液测得A1＝0.0047A2＝0.0049代入线性方程得C1＝39.55ug/mL C2＝40.91ug/mL，样品称样量为6.50mg和6.52mg，蛋白质含量为39.55/6500×100％＝0.608％40.91/6520×100％＝0.627％,此数值明显与实际情况不符，是实施例1测定结果0.106％的大约6倍多。
对比例2
如实施例1所述的一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，不同之处在于，仅仅采用充分振荡混匀，使其完全溶解。标准溶液及样品测定数据如下：
| 标准溶液浓度(ug/mL) | 3.33 | 6.67 | 13.33 | 26.67 | 33.33 |
| 吸光度 | 0.0076 | 0.0186 | 0.0375 | 0.0766 | 0.0964 |
线性相关方程为：C＝339.92×A+0.5706r＝0.9999样品称样量为5.31mg和6.37mg。
测得吸光度值为A1＝0.0323A2＝0.0561代入线性方程的C1＝11.54ug/mL C2＝19.65ug/mL，蛋白质含量为11.54/5310×100％＝0.22％19.65/6370×100％＝0.31％
超过了该产品蛋白质含量的最高限值0.20％。
原始数据见图3。
对比例3
如实施例1所述的一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，不同之处在于，采用在598nm处的吸光度值进行检测。
| 标准溶液浓度(ug/mL) | 3.02 | 6.04 | 12.07 | 24.15 | 30.20 |
| 吸光度 | 0.0020 | 0.0088 | 0.0178 | 0.0406 | 0.0566 |
线性相关方程为：C＝510.51A+2.2339，r＝0.9969。样品称样量为5.03mg和5.61mg。样品溶液测得吸光度为A1＝0.0216A2＝0.0244，代入线性方程得C1＝13.26ug/mLC2＝14.71ug/mL,蛋白质含量为13.26/5030×100％＝0.264％14.71/5610×100％＝0.262％,测定结果比在595nm条件下偏大。
对比例4
如实施例1所述的一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，不同之处在于，库马斯亮蓝G-250试液的浓度为80mg/L。标准溶液及样品测定数据如下：
| 标准溶液浓度(ug/mL) | 3.02 | 6.04 | 12.07 | 24.15 | 30.20 |
| 吸光度 | 0.0029 | 0.0087 | 0.0156 | 0.0270 | 0.0390 |
线性相关方程为：C＝799.29A+0.2006，相关系数r＝0.9917。r＜0.996,说明此线性方程可信度很低。样品称样量为5.67mg和5.47mg。样品溶液测得吸光度为A1＝0.0141A2＝0.0144，代入线性方程得C1＝11.50ug/mL C2＝11.69ug/mL,蛋白质含量为11.50/5670×100％＝0.203％11.69/5470×100％＝0.214％，测定结果也明显偏高，说明选择的80mg/L的马斯亮蓝G-250试液的浓度也是不合理的。
对比例5
一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，包括如下步骤：
(1)称取库马斯亮蓝G-250 100mg溶解于50mL的95％乙醇中,再加入85％的磷酸100 mL,并用蒸馏水稀释至1000mL,制得库马斯亮蓝G-250试液；
(2)称取103℃干燥至恒重的壳聚糖样品0.005g，溶解于1mL质量百分比浓度为1％的醋酸溶液中，混合均匀，在温度24℃、频率35kHz、功率400W条件下超声波处理18min，制得浓度为5mg/ml的样品溶液；
(3)配制不同浓度的蛋白质标准溶液，加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液，测定595nm处各标准溶液的吸光度，绘制吸光度---浓度曲线；
配制浓度为30μg/mL的蛋白质标准液:精确吸取5％牛血清白蛋白标准液0.6mL于1000 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度,4℃下贮存；
按表3配制蛋白质标准液系列：
表3
| 试管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 蛋白质标准溶液/mL | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.0 |
| 1％醋酸溶液-蒸馏水/mL | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.2 | 0 |
| 蛋白质浓度/(ug/mL) | 0 | 3 | 6 | 12 | 24 | 30 |
在标准液系列的各试管及样品试管中分别加入步骤(1)配制的库马斯亮蓝G-250试液 5mL，用漩涡式混合器使试管中溶液充分混合,并在室温20℃士10℃下放置15min；用0号管作对照，用分光光度计测定595nm处各标准管和样品管的吸光度。
用标准管绘制吸光度---浓度曲线,根据样品的吸光度按标准曲线计算样品管的蛋白质浓度，标准溶液检测数据如表4所示：
表4
| 标准溶液浓度(ug/mL) | 3.12 | 6.23 | 12.46 | 24.93 | 31.16 |
| 吸光度 | 0.0328 | 0.0504 | 0.1270 | 0.2254 | 0.2810 |
根据表4的数据绘制吸光度---浓度曲线。
线性相关方程：：C＝111.29×A-0.3725r＝0.9976
(4)向步骤(2)制得的样品溶液中加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液5mL，用漩涡式混合器使试管中溶液充分混合,并在室温20℃士10℃下放置15min；测定样品溶液在595nm处的吸光度，计算样品中蛋白质含量。
经检测，样品溶液的吸光度值为：：C＝111.29×A-0.3725r＝0.9976
代入线性方程得其浓度为C1＝36.836ug/mL C2＝42.698ug/mL
按下式计算壳聚糖中蛋白质含量ρ3(％):
式中：
ρ1——样品管中壳聚糖浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)
ρ2——样品管中蛋白质浓度,单位为微克每毫升(ug/mL)
壳聚糖称样量为5.63mg和6.02mg,经计算，蛋白质含量为36.836/(5.63×1000)×100％＝0.65％,42.698/(6.02×1000)×100％＝0.709％。
采用磷酸配制的库马斯亮蓝，数值也明显与实际情况不符。
Claims (6)
1.一种壳聚糖或壳聚糖盐中蛋白质含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将库马斯亮蓝溶解于体积百分比浓度为95％的乙醇溶液中，加入浓盐酸，库马斯亮蓝G-250与浓盐酸的质量体积比为2:1，单位为mg/ml，蒸馏水稀释至库马斯亮蓝浓度为100mg/L，制得库马斯亮蓝G-250试液；
(2)称取103～107℃干燥至恒重的壳聚糖或壳聚糖盐样品，溶解于质量百分比浓度为1％的醋酸溶液中，混合均匀，超声波处理，然后沸水浴中处理25～35min，制得浓度为5mg/ml的样品溶液；
(3)配制不同浓度的蛋白质标准溶液，加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液，测定595nm处各标准溶液的吸光度，绘制吸光度---浓度曲线；
(4)向步骤(2)制得的样品溶液中加入步骤(1)制得库马斯亮蓝G-250试液，测定样品溶液在595nm处的吸光度，计算样品中蛋白质含量。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声波处理条件为：温度20～24℃，频率35～45kHz，功率为400～500W，时间为12～18min。
3.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声波处理条件为：温度22℃，频率40kHz，功率为500W，时间为15min。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中，不同浓度的蛋白质标准溶液采用如下步骤配制：
(i)精确吸取5％牛血清白蛋白标准液0.6mL，蒸馏水稀释定容至1000mL，制得浓度为30μg/mL的蛋白质标准溶液；
(ii)分别取步骤(i)配制的浓度为30μg/mL的蛋白质标准溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml，然后分别加入质量百分比浓度为1％的醋酸溶液1.0ml、0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.2ml、0ml，制得蛋白质浓度为0ug/mL、3ug/mL、6ug/mL、12ug/mL、24ug/mL、30ug/mL的蛋白质标准溶液。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(4)中，库马斯亮蓝G-250试液的添加量为每毫升蛋白质样品溶液添加5ml库马斯亮蓝G-250试液。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(4)中，计算样品中蛋白质含量的步骤如下：
将测定样品溶液在595nm处的吸光度值代入步骤(3)中的吸光度---浓度曲线，计算获得样品蛋白质浓度ρ2，代入下式，计算获得样品中蛋白质含量ρ3；
式中：
ρ1——样品溶液中壳聚糖或壳聚糖盐浓度，单位为微克每毫升，
ρ2——样品溶液中蛋白质浓度，单位为微克每毫升。
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