CN1740789A - 定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，研究了不同位点取代的壳聚糖硫酸酯(HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS)的抗氧化活性，发现这四种硫酸酯化衍生物具有明显得抑制超氧自由基、羟自由基作用、很强的还原能力；TSCTS的抗有机自由基(DPPH)能力最强，其他位点磺化产物对DPPH作用不明显；TSCTS及TCTS的螯合能力强于其他几种壳聚糖硫酸酯化衍生物；这四种衍生物也表现出很强的抑制H2O2诱导的红细胞溶血的作用，其中HCTS及SCTS效果最佳，而TSCTS剂量关系最显著；TSCTS及TCTS具有明显的抑制肝匀浆脂质过氧化作用；总的抗氧化能力测定结果显示HCTS、SCTS、TCTS效果最佳，TSCTS有一定的作用，但不明显。本发明可作为研制抗衰老药物的依据。
Description
技术领域
本发明涉及海洋药物的研究与开发，具体讲是一种定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，它可作为抗衰老药物的依据，其属于海洋生物技术领域。
背景技术
活性氧自由基对机体具有巨大的损伤作用，如会引起蛋白质损伤、酶失活、膜质过氧化，导致衰老、肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病的发生。因此筛选对人体安全、高效的活性氧清除剂有着重要的意义。
对于人工合成的二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基甲氧基(BHA)、丙二醇(PG)等有较好的抗氧化活性，但长期食用对人体有伤害作用，因此在最近几年，海洋生物活性多糖的抗氧化作用受到广泛的重视。研究表明海洋生物活性多糖具有较高抗氧化能力。鼠尾藻多糖能有效的清除活性氧自由基。浒台多糖能提高超氧化物歧化酶(SOD)活力及降低肝、脾中脂褐质(LPO)的含量。壳聚糖是一种来源于甲壳类动物蟹虾的外壳及节肢类动物蟑螂等骨骼的天然碱性高分子多糖，对人体无毒副作用，可生物降解。但高分子量壳聚糖分子结构紧密，抗氧化作用不很明显，而其硫酸酯化衍生物由于具有与肝素类似的结构和强聚阴离子性质而引起了广大学者的关注，在抗凝、抗栓和抗病毒方面的研究均有较多报道。但壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性方面研究不多，曾有文献报道壳聚糖硫酸酯衍生物对H2O2有明显的抗氧化活性，但对其他抗氧化方面如清除超氧阴离子自由基(O2 ·-)、羟自由基(·OH)、抑制有机自由基(DPPH)、红细胞溶血、肝匀浆脂质过氧化，壳聚糖硫酸酯对金属的螯合能力，他们的还原能力以及总的抗氧化能力均未见有报道。因此本发明拟就不同位点壳聚糖硫酸酯衍生物的抗氧化活性进行了探讨，并对各壳聚糖硫酸酯衍生物进行了抗氧化能力比较。
发明内容
本发明的目的是研究壳聚糖硫酸酯化衍生物的抗氧化能力，提供了一种定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，为今后能否成为抗衰老药提供依据。
本发明是用以下实验方法对不同位点磺化的壳聚糖硫酸酯衍生物的抗氧化进行检测的。各不同位置壳聚糖磺化产物的缩写形式为C2，3，6位壳聚糖硫酸酯(HCTS)、C3，6位壳聚糖硫酸酯(TSCTS)、C3位壳聚糖硫酸酯(TCTS)、C6位壳聚糖硫酸酯(SCTS)。
本发明的技术方案是：
一种定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，包括：
1)各磺化产物对超氧自由基的清除作用
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对超氧自由基的清除能力均很强，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为HCTC＞SCTS＞TCTS＞TSCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强；
2)各磺化产物对羟自由基的清除作用
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对羟自由基的清除能力均很强，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为TCTS＞SCTC＞TSCTS＞HCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强；
3)各磺化产物对有机自由基的抑制作用
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对有机自由基的抑制作用表现为TSCTS很强，其他磺化产物对有机自由基的清除不明显，均具有浓度依赖性，随着样品浓度增大清除有机自由基的能力增强；
4)各磺化产物对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力除TCTS外均很强，它们表现出一定的浓度依赖性，即随着浓度增大抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力增强；
5)各磺化产物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用
所得结果为TSCTS、TCTS对抑制肝匀浆脂质过氧化作用明显，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性；
6)各磺化产物的还原能力测试：
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS均具有很强的还原能力，还原能力强弱顺序为TSCTS＞TCTS＞SCTS＞HCTS；
7)各磺化产物对金属离子螯合能力的测定：
所得结果为TSCTS、TCTS具有很强的螯合能力，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对金属螯合能力测试均表现出浓度依赖性；
8)各磺化产物总的抗氧化能力实验，用β-胡萝卜素-亚油酸体系作为总抗氧化能力的评价：
所得结果为HCTS、SCTS、TCTS具有很强的抗氧化能力，随着时间的延长，达到2h且最大浓度为300mg/ml时，HCTS的抗氧化能力为67.60％，SCTS最大，达到90.23％，TCTS稍弱，为59.79％，它们均具有一定的浓度依赖性，而TSCTS随浓度变化总抗氧化能力变化不明显，用β-胡萝卜素-亚油酸体系衡量的TSCTS的总抗氧化能力比较弱。
所述各磺化产物对超氧自由基的清除作用，采用吩嗪硫酸甲酯-NADH体系发生，反应体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为16mmo1/L，pH＝8.0，其中含有78μmo1/L还原型辅酶I，50μmo1/L硝基四氮唑蓝，10μmo1/L吩嗪硫酸甲酯，以及不同浓度的多糖溶液，超氧阴离子和硝基四氮唑蓝的显色反应采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度，在空白对照实验中，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液替换还原型辅酶I，实验结果以清除率E％标示：
清除率E％＝(A-A1)/(A-A0)×100％
A：空白对照值
A1：加入样品后的吸光值
A0：参比，值为0；
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对超氧自由基的清除能力均很强，抗氧化性达50％时各样品的浓度IC50分别为0.012mg/ml，0.040mg/ml，0.015mg/ml，0.022mg/ml，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为HCTC＞SCTS＞TCTS＞TSCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强。
所述各磺化产物对羟自由基的清除作用，·OH是由EDTANa2-Fe(II)-H2O2体系产生，由于·OH可特异地使藩红花红色褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量，按体积份数计，反应体系中包括0.2M、pH7.4的磷酸缓冲液1.5份，260μg/ml的藩红花红0.2份，体积百分比浓度为3％的H2O20.8份，EDTANa2-Fe(II)0.7份，0.8份不同浓度的壳聚糖溶液，混合均匀后于37℃水浴保温30min，然后于520nm处测吸光度A值，空白组以重蒸馏水代替供试液，对照组以重蒸馏水代替供试液和EDTANa2-Fe(II)，反应总体积为4.0份，实验结果以清除率F％表示：
清除率F％＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对羟自由基的清除能力均很强，IC50分别为1.369mg/ml，1.184mg/ml，0.925mg/ml，0.350mg/ml，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为TCTS＞SCTC＞TSCTS＞HCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强。
所述各磺化产物对有机自由基的抑制作用，将样品溶于50％甲醇-水或50％乙醇-水的混合溶液中配成不同浓度的供试液，按体积份数计，将1份上述供试液与1.5份用95％甲醇或乙醇溶解的0.1mM 1，1-二苯基苦基苯肼溶液混合，振荡均匀，在室温放置20min后，于517nm处测定其吸光度值，阴性对照为DPPH有机自由基醇溶液，DPPH有机自由基现用现配；
清除率G％＝(1-A样品/A对照)×100
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对有机自由基的抑制作用表现为TSCTS很强，其IC50为0.06mg/ml，其他磺化产物对有机自由基的清除不明显，均具有浓度依赖性，随着样品浓度增大清除有机自由基的能力增强。
所述各磺化产物对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验，健康Wistar大鼠眼眶取血，制成抗凝血，1000×g离心10min，移弃血浆和自细胞，向沉淀的红细胞中加入等渗的生理盐水，混匀，1000×g离心10min，弃上清液，如此反复2次洗涤红细胞，将红细胞制成体积百分比浓度为0.5％的悬浮液，按体积份数计，取红细胞悬浮液1份，加2份不同浓度的磺化产物样品，最后加100mmol/l的H2O22份，混匀，37℃温浴60min，用生理盐水稀释5倍，1000×g离心10min，上清液于415nm处测定吸光度值；
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力除TCTS外均很强，它们的IC50分别为0.0042mg/ml，0.65mg/ml，0.0057mg/ml，4.85mg/ml，它们也表现出一定的浓度依赖性，即随着浓度增大抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力增强。
所述各磺化产物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用，健康Wistar大鼠，颈椎脱臼致死，迅速分离肝组织，用冰冷的20mmol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液制成体积百分比浓度为20％的匀浆，9810×g离心20min，沉淀再洗一次并离心，合并上清液，按体积份数计，在1.5份0.2mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，pH＝7.4，加含肝匀浆液0.2份，FeSO410μmol/l，抗坏血酸0.12mmol/l及1份不同浓度的磺化产物样品，在37℃温浴60min，保温结束后加入重量百分比浓度为20％的三氯乙酸1.0份终止反应，混匀，再加入重量百分比浓度为0.67％硫代巴比妥酸1.5份，沸水浴加热15min，离心去除蛋白质沉淀后，于532nm测定吸光度值；
所得结果为TSCTS、TCTS对抑制肝匀浆脂质过氧化作用明显，IC50分别为1.125mg/ml，1.55mg/ml，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性。
所述各磺化产物的还原能力测试，用0.2M磷酸缓冲液，pH＝6.6，配成不同浓度的样品溶液，按体积份数计，取2.5份，与2.5的1％(W/V)的铁氰化钾混匀，在50℃温浴20min，然后用重量百分比浓度为10％的2.5份三氯乙酸终止反应，反应混合物离心10min，取上清液5份，加入5份蒸馏水及重量百分比浓度为0.1％的1份氯化铁，混匀后在700nm下测定吸光度值，如吸光度增大则还原能力增强；
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS均具有很强的还原能力，还原能力强弱顺序为TSCTS＞TCTS＞SCTS＞HCTS。
所述各磺化产物对金属离子螯合能力的测定，不同浓度的样品溶液0.3份与2mM氯化亚铁0.3份和5mM的Ferrozine 0.2份混匀，用水调整体积为0.8份，混合均匀后，室温放置10min，在562nm处测定吸光值；
螯合能力L％＝(1-A样品/A对照)×100
所得结果为TSCTS、TCTS具有很强的螯合能力，其螯合金属50％时的浓度IC50分别为0.7729mg/ml，0.2266mg/ml，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对金属螯合能力测试均表现出浓度依赖性。
所述各磺化产物总的抗氧化能力实验，用β-胡萝卜素-亚油酸体系作为总抗氧化能力的评价，取10份氯仿溶解2份β-胡萝卜素，在100ml圆底烧瓶中将氯仿浓缩至干，加入40份亚油酸，400份Tween 40，用10份氯仿溶解，然后将氯仿蒸出，加入100份水振荡成乳浊液，将1份不同浓度的样品与上述乳浊液混合，在470nm处测其吸光度，上述混合液一混合均匀马上测其吸光值，作为零时刻吸收，然后每隔30min测定一次吸光值直至颜色消失，空白为不含β-胡萝卜素的混样；其中氯仿、水为按毫升计的体积份数，β-胡萝卜素、亚油酸、Tween40为按毫克计的重量份数；
总抗氧化能力AA％＝(2h后的β-胡萝卜素含量/起始β-胡萝卜素含量)×100
所得结果为HCTS、SCTS、TCTS具有很强的抗氧化能力，随着时间的延长，达到2h且最大浓度为300mg/ml时，HCTS的抗氧化能力为67.60％，SCTS最大，达到90.23％，TCTS稍弱，为59.79％，它们均具有一定的浓度依赖性，而TSCTS随浓度变化总抗氧化能力变化不明显，用β-胡萝卜素-亚油酸体系衡量的TSCTS的总抗氧化能力比较弱。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明定位壳聚糖硫酸酯是一种天然无毒的海洋生物多糖，经大量实验证明此多糖具有抗凝、抗栓、抗病毒、增强机体免疫力等众多生物活性，对与人体有害的BHA、BHT等相比对人体具有相当好的益处。目前，就壳聚糖硫酸酯多糖的抗氧化活性研究有文献报道对H2O2有明显的抗氧化活性，但对其他抗氧化方面如清除超氧阴离子自由基(O2 ·-)、羟自由基(·OH)、抑制有机自由基(DPPH)、红细胞溶血、肝匀浆脂质过氧化，壳聚糖硫酸酯对金属的螯合能力，他们的还原能力以及总的抗氧化能力均未见有报道。因此本发明拟就不同位点壳聚糖硫酸酯衍生物的抗氧化活性进行了探讨，并对各壳聚糖硫酸酯衍生物进行了抗氧化能力比较。
2、本发明通过研究不同位点取代的壳聚糖硫酸酯(HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS)的抗氧化活性，发现这四种硫酸酯化衍生物具有明显的抑制超氧自由基、羟自由基作用、很强的还原能力；TSCTS的抗有机自由基(DPPH)能力最强，其他位点磺化产物对DPPH作用不明显；TSCTS及TCTS的螯合能力强于其他几种壳聚糖硫酸酯化衍生物；这四种衍生物也表现出很强的抑制H2O2诱导的红细胞溶血的作用，其中HCTS及SCTS效果最佳，而TSCTS剂量关系最显著；TSCTS及TCTS具有明显的抑制肝匀浆脂质过氧化作用；总的抗氧化能力测定结果显示HCTS、SCTS、TCTS效果最佳，TSCTS有一定的作用，但不明显。本发明通过研究壳聚糖硫酸酯化衍生物的抗氧化能力，为今后能否成为抗衰老药提供依据。
附图说明
图1各磺化物质对超氧自由基的清除作用。
图2各磺化物质对羟自由基的清除作用。
图3各磺化物质对有机自由基DPPH的抑制作用。
图4各磺化物质抑制H2O2诱导的红细胞溶血作用。
图5各磺化物质抑制肝匀浆脂质过氧化作用。
图6各磺化物质还原能力测试。
图7各磺化物质对金属的螯合能力测试。
图8各磺化物质的总抗氧化能力测试。
具体实施方式
1.各磺化产物对超氧自由基的清除作用
采用吩嗪硫酸甲酯-NADH体系发生。反应体系为3.0ml的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液(16mmol/L，pH8.0)，其中含有78μmol/L还原型辅酶I(NADH)，50μmol/L硝基四氮唑蓝(NBT)，10μmol/L吩嗪硫酸甲酯(PMS)，以及不同浓度的多糖溶液。超氧阴离子和NBT的显色反应采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度。在空白对照实验中，用Tris-HCl缓冲液替换NADH。实验结果以清除率E％标示：
清除率E％＝(A-A1)/(A-A0)×100％
A：空白对照值
A1：加入样品后的吸光值
A0：参比，值为0。
2.各磺化产物对羟自由基的清除作用
·OH是由EDTANa2-Fe(II)-H2O2体系产生，由于·OH可特异地使藩红花红色褪色，根据褪色程度用比色法来衡量OH的含量。反应体系中包括pH7.4的磷酸缓冲液(0.2mol/l)1.5ml，藩红花红(260μg/ml)0.2ml，3％(体积百分比浓度)的H2O20.8ml，EDTANa2-Fe(II)0.7ml，0.8ml不同浓度的壳聚糖硫酸酯溶液，混合均匀后于37℃水浴保温30min，然后于520nm处测吸光度A值。空白组以重蒸馏水(二次蒸馏水)代替供试液(不同浓度的壳聚糖硫酸酯溶液)，对照组以重蒸馏水代替供试液和EDTANa2-Fe(II)，反应总体积为4.0ml。实验结果以清除率F％表示：
清除率F％＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％
3.各磺化产物对有机自由基(DPPH)的抑制作用
将样品溶于50％甲醇-水或50％乙醇-水的混合溶液中配成不同浓度的供试液，将1ml上述供试液与1.5ml用95％甲醇或乙醇溶解的1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH，0.1mM)溶液混合，振荡均匀，在室温放置20min后，于5l7nm处测定其吸光度值。阴性对照为DPPH醇溶液，DPPH现用现配。
清除率G％＝(1-A样品/A对照)×100
4.各磺化产物对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验
健康Wistar大鼠眼眶取血，制成抗凝血，1000×g离心10min，移弃血浆和白细胞，向沉淀的红细胞中加入等渗的生理盐水，混匀，1000×g离心10min，弃上清液，如此反复2次洗涤红细胞，将红细胞制成0.5％(体积百分比浓度)的悬浮液。取红细胞悬浮液1ml，加2ml不同浓度的磺化产物样品，最后加100mmol/l的H2O22ml，混匀，37℃温浴60min，用生理盐水稀释5倍，1000×g离心10min，上清液于415nm处测定吸光度值。
5.各磺化产物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用
健康Wistar大鼠，颈椎脱臼致死，迅速分离肝组织，用冰冷的Tris-HCl缓冲液(20mmol/l)制成20％(体积百分比浓度)的匀浆，9810×g离心20min，沉淀再洗一次并离心，合并上清液。在1.5ml 0.2mol/l Tris-HCl缓冲液中(pH7.4)加含肝匀浆液0.2ml，FeSO410μmol/l，抗坏血酸0.12mmol/l及1ml不同浓度的磺化产物样品，在37℃温浴60min，保温结束后加入20％(重量百分比浓度)三氯乙酸(TCA)1.0ml终止反应。混匀，再加入0.67％(重量百分比浓度)硫代巴比妥酸(TBA)1.5ml，沸水浴加热15min。离心去除蛋白质沉淀后，于532nm测定吸光度值。
6.各磺化产物的还原能力测试
用磷酸缓冲液(0.2M，pH6.6)配成不同浓度的样品溶液，取2.5ml，与2.5ml的1％(W/V)的铁氰化钾混匀，在50℃温浴20min。然后用2.5ml 10％(重量百分比浓度)的三氯乙酸终止反应。反应混合物离心10min。取上清液5ml，加入5ml蒸馏水及1ml 0.1％(重量百分比浓度)的氯化铁，混匀后在700nm下测定吸光度值。如吸光度增大则还原能力增强。
7.各磺化产物对金属离子螯合能力的测定
取不同浓度的样品溶液0.3ml与2mM氯化亚铁0.3ml和5mM通用显色剂Ferrozine(3-(2-pyridyl)-5，6-diphenyl-1，2，4-triazine-4’，4”-disulfonic acid sodium salt)0.2ml混匀，用水调整体积为0.8ml，混合均匀后，室温放置10min，在562nm处测定吸光值。
螯合能力L％＝(1-A样品/A对照)×100
8.各磺化产物总的抗氧化能力
用β-胡萝卜素-亚油酸体系作为总抗氧化能力的评价：
10ml氯仿溶解2mgβ-胡萝卜素，在100ml圆底烧瓶中将氯仿浓缩至干，加入40mg亚油酸，400mg Tween 40(吐温40)，用10ml氯仿溶解，然后将氯仿蒸出。加入100ml水振荡成乳浊液。将1ml不同浓度的样品与上述乳浊液混合，在470nm处测其吸光度。上述混合液一混合均匀马上测其吸光值，作为零时刻吸收。然后每隔30min测定一次吸光值直至颜色消失，空白为不含β-胡萝卜素的混样。总抗氧化能力AA％＝(2h后的β-胡萝卜素含量/起始β-胡萝卜素含量)×100
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的1所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对超氧自由基的清除能力均很强，IC50(抗氧化性达50％时各样品的浓度)分别为0.012mg/ml，0.040mg/ml，0.015mg/ml，0.022mg/ml。由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为HCTC＞SCTS＞TCTS＞TSCTS。而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强。
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的2所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对羟自由基的清除能力均很强，IC50分别为1.369mg/ml，1.184mg/ml，0.925mg/ml，0.350mg/ml。由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为TCTS＞SCTC＞TSCTS＞HCTS。而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强。
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的3所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对有机自由基的抑制作用表现为TSCTS很强，其IC50为0.06mg/ml，其他磺化产物对有机自由基的清除不明显，但均具有浓度依赖性，随着样品浓度增大清除有机自由基的能力增强。
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的4所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力除TCTS外均很强，它们的IC50分别为0.0042mg/ml，0.65mg/ml，0.0057mg/ml，4.85mg/ml。它们也表现出一定的浓度依赖性，即随着浓度增大抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力增强。
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的5所得结果为TSCTS、TCTS对抑制肝匀浆脂质过氧化作用明显，IC50分别为1.125mg/ml，1.55mg/ml，而HCTS、SCTS作用不明显，但此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性。
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的6所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS均具有很强的还原能力，还原能力强弱顺序为TSCTS＞TCTS＞SCTS＞HCTS。
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的7所得结果为TSCTS、TCTS具有很强的螯合能力，其IC50(螯合金属50％时的浓度)分别为0.7729mg/ml，0.2266mg/ml，而HCTS、SCTS作用不明显，但此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对金属螯合能力测试均表现出浓度依赖性。
本发明不同位点的壳聚糖磺化产物的抗氧化性，所述的8所得结果为HCTS、SCTS、TCTS具有很强的抗氧化能力，随着时间的延长，达到2h且最大浓度时(300mg/ml)，HCTS的抗氧化能力为67.60％，SCTS最大，达到90.23％，TCTS稍弱，为59.79％。它们均具有一定的浓度依赖性，而TSCTS随浓度变化总抗氧化能力变化不明显，用β-胡萝卜素-亚油酸体系衡量的TSCTS的总抗氧化能力比较弱。
实施例
1.各磺化产物对超氧自由基的清除能力，如图1表示。
| 浓度(mg/ml) | A560 | |||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | |
| 对照 | 0.894±0.003 | |||
| 0.005 | 0.645±0.002** | 0.692±0.003** | 0.642±0.004** | 0.679±0.002** |
| 0.025 | 0.154±0.004*** | 0.585±0.002*** | 0.277±0.005*** | 0.423±0.003*** |
| 0.05 | 0.090±0.003*** | 0.356±0.004*** | 0.080±0.003*** | 0.123±0.002*** |
| 0.1 | 0.073±0.001*** | 0.276±0.002*** | 0.069±0.004*** | 0.099±0.002*** |
| 0.2 | 0.037±0.002*** | 0.218±0.001*** | 0.055±0.002*** | 0.072±0.00*** |
| 0.4 | 0.025±0.001*** | 0.132±0.003*** | 0.048±0.001*** | 0.067±0.003*** |
| 清除率(％) | ||||
| 0.005 | 27.93 | 22.68 | 28.27 | 24.13 |
| 0.025 | 82.79 | 34.64 | 69.05 | 52.74 |
| 0.05 | 89.94 | 60.22 | 91.06 | 86.26 |
| 0.1 | 91.84 | 69.16 | 92.29 | 88.94 |
| 0.2 | 95.87 | 75.64 | 93.85 | 91.96 |
| 0.4 | 97.21 | 85.25 | 94.64 | 92.51 |
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
2.各磺化产物对羟自由基的清除能力，如图2表示。
| 浓度(mg/ml) | A520 | |||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | |
| 对照 | 0.446±0.003 | 1.241±0.001 | ||
| 参比 | 0.073±0.001 | 0.178±0.002 | ||
| 0.1 | 0.074±0.004* | 0.102±0.003* | 0.089±0.004* | 0.293±0.002* |
| 0.2 | 0.077±0.003** | 0.131±0.004*** | 0.105±0.003*** | 0.515±0.003*** |
| 0.4 | 0.092±0.005** | 0.183±0.002*** | 0.170±0.002*** | 0.766±0.002*** |
| 0.8 | 0.126±0.001*** | 0.255±0.001*** | 0.297＝0.001*** | 0.946±0.002*** |
| 1.6 | 0.212±0.001*** | 0.403±0.002*** | 0.485±0.001*** | 1.025±0.001*** |
| 3.2 | 0.372±0.002*** | 0.571±0.001*** | 0.610±0.002*** | 1.158±0.001*** |
| 清除率(％) | ||||
| 0.1 | 0.20 | 5.79 | 3.19 | 10.82 |
| 0.2 | 0.80 | 11.58 | 6.39 | 31.70 |
| 0.4 | 3.79 | 21.96 | 19.36 | 55.32 |
| 0.8 | 10.58 | 36.33 | 44.71 | 72.25 |
| 1.6 | 27.74 | 65.87 | 8224 | 79.68 |
| 3.2 | 59.68 | 99.40 | 107.19 | 92219 |
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
3.各磺化物质对有机自由基(DPPH)的抑制作用，如图3表示。
| 浓度(mg/ml) | A517 | |||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | |
| 对照 | 1.968±0.005 | |||
| 0.025 | 1.921±0.006* | 1.073±0.004* | 1.904±0.007* | 1.921±0.014* |
| 0.05 | 1.911±0.008* | 0.327±0.003* | 1.858±0.008 | 1.869±0.007* |
| 0.1 | 1.888±0.005 | 0.293±0.002** | 1.787±0.010 | 1.826±0.012 |
| 0.2 | 1.888±0.014 | 0.273±0.001** | 1.740±0.014 | 1.781±0.015 |
| 0.3 | 1.868±0.006 | 0.256±0.003** | 1.714±0.012 | 1.706±0.021 |
| 0.4 | 1.868±0.011 | 0.226±0.001** | 1.706±0.018 | 1.568±0.019 |
| 清除率(％) | ||||
| 0.025 | 2.39 | 45.53 | 3.25 | 2.39 |
| 0.05 | 3.25 | 83.38 | 5.49 | 5.03 |
| 0.1 | 4.07 | 85.11 | 9.20 | 7.22 |
| 0.2 | 4.07 | 86.13 | 11.69 | 9.50 |
| 0.3 | 5.08 | 86.99 | 12.91 | 13.31 |
| 0.4 | 5.08 | 88.52 | 13.31 | 20.33 |
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
4.各物质抑制H2O2对红细胞的溶血作用，如图4表示。
| 浓度(mg/ml) | A415 | |||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | |
| 对照 | 1.253±0.003 | |||
| 0.09 | 0.235±0.004* | 0.881±0.007* | 0.234±0.007* | 1.192±0.014 |
| 0.3 | 0.162±0.007* | 0.784±0.009* | 0.199±0.009* | 1.180±0.010 |
| 0.6 | 0.115±0.003* | 0.638±0.003* | 0.147±0.003* | 1.172±0.013 |
| 1.2 | 0.092±0.004* | 0.293±0.004* | 0.138±0.004* | 1.132±0.011* |
| 2.4 | 0.084±0.009* | 0.145±0.006* | 0.103±0.005* | 1.072±0.007* |
| 4.8 | 0.076±0.010* | 0.139±0.003* | 0.082±0.010* | 0.588±0.003* |
| 清除率(％) | ||||
| 0.09 | 81.25 | 29.69 | 81.32 | 4.87 |
| 0.3 | 87.07 | 37.43 | 84.12 | 5.83 |
| 0.6 | 90.82 | 49.08 | 88.27 | 6.46 |
| 1.2 | 92.58 | 76.62 | 88.99 | 9.66 |
| 2.4 | 93.29 | 88.43 | 91.78 | 14.45 |
| 4.8 | 93.93 | 88.91 | 93.56 | 53.23 |
与对照组比较：*P＜0.05
5.各物质抑制肝匀浆脂质过氧化作用，如图5表示。
| 浓度(mg/ml) | A532 | |||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | |
| 对照 | 0.285±0.013 | |||
| 0.09 | 0.269±0.014 | 0.175±0.010* | 0.240±0.014 | 0.165±0.012* |
| 0.3 | 0.251±0.021 | 0.164±0.008* | 0.235±0.017 | 0.165±0.021 |
| 0.6 | 0.246±0.008* | 0.157±0.011 | 0.233±0.013 | 0.161±0.009* |
| 1.2 | 0.233±0.010*** | 0.141±0.013* | 0.229±0.010* | 0.148±0.006* |
| 2.4 | 0.229±0.006* | 0.135±0.007* | 0.218±0.010* | 0.133±0.009* |
| 清除率(％) | ||||
| 0.09 | 5.61 | 38.60 | 15.79 | 42.11 |
| 0.3 | 11.93 | 42.46 | 17.54 | 42.11 |
| 0.6 | 13.68 | 44.91 | 18.25 | 43.51 |
| 1.2 | 18.25 | 50.53 | 19.65 | 48.07 |
| 2.4 | 19.65 | 52.63 | 23.51 | 53.33 |
与对照组比较：*P＜0.05
6.各磺化产物还原能力的测试，如图6表示。
| 浓度(μg/ml) | A700 | 浓度(μg/ml) | A700 | ||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | ||
| 对照 | 0.069±0.001 | 对照 | 0.069±0.001 | ||
| 150 | 0.0907±0.002* | 20 | 0.322±0.003** | 0.122±0.002* | 0.073±0.004* |
| 300 | 0.102±0.001** | 40 | 0.534±0.001*** | 0.126±0.003** | 0.089±0.003* |
| 450 | 0.124±0.003** | 60 | 0.677±0.002*** | 0.141±0.001** | 0.105±0.001** |
| 600 | 0.156±0.002** | 80 | 0.917±0.002*** | 0.160±0.002*** | 0.116±0.004** |
| 750 | 0.165±0.003** | 100 | 1.068±0.003*** | 0.182±0.002** | 0.130±0.003* |
注：随着浓度增大，吸光度值增大，则还原能力增强。
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
7.各磺化产物的螯合能力测试，如图7表示。
| 浓度(μg/ml) | A562 | |||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | |
| 对照 | 2.245±0.013 | |||
| 60 | 2.236±0.031 | 2.169±0.017 | 2.134±0.025 | 1.807±0.015 |
| 120 | 2.131±0.019 | 1.835±0.013 | 1.975±0.019 | 1.655±0.010 |
| 240 | 2.120±0.015 | 1.468±0.009* | 1.868±0.021 | 0.627±0.003** |
| 480 | 1.471±0.010 | 1.118±0.011* | 1.768±0.020 | 0.361±0.001** |
| 960 | 1.401±0.009* | 0.420±0.004** | 1.656±0.017 | 0.302±0.003** |
| 清除率(％) | ||||
| 60 | 0.40 | 3.39 | 4.94 | 19.51 |
| 120 | 5.08 | 18.26 | 12.03 | 26.28 |
| 240 | 5.57 | 34.61 | 16.79 | 72.07 |
| 480 | 34.48 | 50.20 | 21.25 | 83.92 |
| 960 | 37.59 | 81.29 | 26.24 | 86.55 |
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
8.各磺化产物的总抗氧化能力测试，如图8表示。
| 浓度(μg/ml) | 时间(h) | A470 | |||
| HCTS | TSCTS | SCTS | TCTS | ||
| 10 | 02 | 3.047±0.0211.118±0.008 | 2.993±0.0190.969±0.009 | 2.959±0.0241.330±0.012 | 2.848±0.0170.787±0.007 |
| 20 | 02 | 3.084±0.0221.280±0.009 | 3.015±0.0231.015±0.002 | 2.798±0.0211.527±0.009 | 2.842±0.0190.860±0.008 |
| 40 | 02 | 3.112±0.0151.681±0.010 | 3.019±0.0241.044±0.008 | 3.045±0.0132.293±0.017 | 2.893±0.0221.012±0.002 |
| 80 | 02 | 3.117±0.0151.902±0.010 | 2.926±0.0181.017±0.005 | 3.053±0.0192.558±0.014 | 2.833±0.0251.039±0.012 |
| 160 | 02 | 3.120±0.0242.075±0.013 | 3.018±0.0211.076±0.009 | 2.988±0.0222.625±0.022 | 2.847±0.0191.473±0.022 |
| 300 | 02 | 3.170±0.0212.143±0.018 | 3.014±0.0331.084±0.019 | 3.041±0.0232.744±0.019 | 2.917±0.0311.744±0.023 |
| 清除率(％) | |||||
| 10 | 36.69 | 32.38 | 44.95 | 27.63 | |
| 20 | 41.50 | 33.67 | 54.57 | 30.26 | |
| 40 | 54.02 | 34.58 | 75.30 | 34.98 | |
| 80 | 61.02 | 34.76 | 83.79 | 36.67 | |
| 160 | 66.51 | 35.65 | 87.85 | 51.74 | |
| 300 | 67.60 | 35.97 | 90.23 | 59.79 | |
Claims (9)
1、一种定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于包括：
1)各磺化产物对超氧自由基的清除作用
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对超氧自由基的清除能力均很强，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为HCTC＞SCTS＞TCTS＞TSCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强；
2)各磺化产物对羟自由基的清除作用
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对羟自由基的清除能力均很强，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为TCTS＞SCTC＞TSCTS＞HCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强；
3)各磺化产物对有机自由基的抑制作用
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对有机自由基的抑制作用表现为TSCTS很强，其他磺化产物对有机自由基的清除不明显，均具有浓度依赖性，随着样品浓度增大清除有机自由基的能力增强；
4)各磺化产物对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力除TCTS外均很强，它们表现出一定的浓度依赖性，即随着浓度增大抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力增强；
5)各磺化产物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用
所得结果为TSCTS、TCTS对抑制肝匀浆脂质过氧化作用明显，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性；
6)各磺化产物的还原能力测试：
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS均具有很强的还原能力，还原能力强弱顺序为TSCTS＞TCTS＞SCTS＞HCTS；
7)各磺化产物对金属离子螯合能力的测定：
所得结果为TSCTS、TCTS具有很强的螯合能力，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对金属螯合能力测试均表现出浓度依赖性；
8)各磺化产物总的抗氧化能力实验，用β-胡萝卜素-亚油酸体系作为总抗氧化能力的评价：
所得结果为HCTS、SCTS、TCTS具有很强的抗氧化能力，随着时间的延长，达到2h且最大浓度为300mg/ml时，HCTS的抗氧化能力为67.60％，SCTS最大，达到90.23％，TCTS稍弱，为59.79％，它们均具有一定的浓度依赖性，而TSCTS随浓度变化总抗氧化能力变化不明显，用β-胡萝卜素-亚油酸体系衡量的TSCTS的总抗氧化能力比较弱。
2、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物对超氧自由基的清除作用，采用吩嗪硫酸甲酯-NADH体系发生，反应体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液浓度为16mmol/L，pH＝8.0，其中含有78μmol/L还原型辅酶I，50μmol/L硝基四氮唑蓝，10μmol/L吩嗪硫酸甲酯，以及不同浓度的多糖溶液，超氧阴离子和硝基四氮唑蓝的显色反应采用分光光度法在560nm波长下测定反应液的吸光度，在空白对照实验中，用三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液替换还原型辅酶I，实验结果以清除率E％标示：
清除率E％＝(A-A1)/(A-A0)×100％
A：空白对照值
A1：加入样品后的吸光值
A0：参比，值为0；
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对超氧自由基的清除能力均很强，抗氧化性达50％时各样品的浓度IC50分别为0.012mg/ml，0.040mg/ml，0.015mg/ml，0.022mg/ml，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为HCTC＞SCTS＞TCTS＞TSCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除超氧自由基的能力增强。
3、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物对羟自由基的清除作用，·OH是由EDTANa2-Fe(II)-H2O2体系产生，由于·OH可特异地使藩红花红色褪色，根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量，按体积份数计，反应体系中包括0.2M、pH7.4的磷酸缓冲液1.5份，260μg/ml的藩红花红0.2份，体积百分比浓度为3％的H2O20.8份，EDTANa2-Fe(II)0.7份，0.8份不同浓度的壳聚糖溶液，混合均匀后于37℃水浴保温30min，然后于520nm处测吸光度A值，空白组以重蒸馏水代替供试液，对照组以重蒸馏水代替供试液和EDTANa2-Fe(II)，反应总体积为4.0份，实验结果以清除率F％表示：
清除率F％＝(A样品-A空白)/(A对照-A空白)×100％
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对羟自由基的清除能力均很强，IC50分别为1.369mg/ml，1.184mg/ml，0.925mg/ml，0.350mg/ml，由IC50可看出各样品清除超氧自由基的强弱顺序为TCTS＞SCTC＞TSCTS＞HCTS，而且各样品均具有浓度依赖性，即随着浓度增大清除羟自由基的能力增强。
4、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物对有机自由基的抑制作用，将样品溶于50％甲醇-水或50％乙醇-水的混合溶液中配成不同浓度的供试液，按体积份数计，将1份上述供试液与1.5份用95％甲醇或乙醇溶解的0.1mM 1，1-二苯基苦基苯肼溶液混合，振荡均匀，在室温放置20min后，于517nm处测定其吸光度值，阴性对照为DPPH有机自由基醇溶液，DPPH有机自由基现用现配；
清除率G％＝(1-A样品/A对照)×100
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对有机自由基的抑制作用表现为TSCTS很强，其IC50为0.06mg/ml，其他磺化产物对有机自由基的清除不明显，均具有浓度依赖性，随着样品浓度增大清除有机自由基的能力增强。
5、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物对H2O2诱导的红细胞氧化溶血实验，健康Wistar大鼠眼眶取血，制成抗凝血，1000×g离心10min，移弃血浆和白细胞，向沉淀的红细胞中加入等渗的生理盐水，混匀，1000×g离心10min，弃上清液，如此反复2次洗涤红细胞，将红细胞制成体积百分比浓度为0.5％的悬浮液，按体积份数计，取红细胞悬浮液1份，加2份不同浓度的磺化产物样品，最后加100mmol/l的H2O22份，混匀，37℃温浴60min，用生理盐水稀释5倍，1000×g离心10min，上清液于415nm处测定吸光度值；
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS对抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力除TCTS外均很强，它们的IC50分别为0.0042mg/ml，0.65mg/ml，0.0057mg/ml，4.85mg/ml，它们也表现出一定的浓度依赖性，即随着浓度增大抑制H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力增强。
6、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物对大鼠肝匀浆脂质过氧化的作用，健康Wistar大鼠，颈椎脱臼致死，迅速分离肝组织，用冰冷的20mmol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液制成体积百分比浓度为20％的匀浆，9810×g离心20min，沉淀再洗一次并离心，合并上清液，按体积份数计，在1.5份0.2mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，pH＝7.4，加含肝匀浆液0.2份，FeSO410μmol/l，抗坏血酸0.12mmol/l及1份不同浓度的磺化产物样品，在37℃温浴60min，保温结束后加入重量百分比浓度为20％的三氯乙酸1.0份终止反应，混匀，再加入重量百分比浓度为0.67％硫代巴比妥酸1.5份，沸水浴加热15min，离心去除蛋白质沉淀后，于532nm测定吸光度值；
所得结果为TSCTS、TCTS对抑制肝匀浆脂质过氧化作用明显，IC50分别为1.125mg/ml，1.55mg/ml，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对抑制脂质过氧化均表现出浓度依赖性。
7、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物的还原能力测试，用0.2M磷酸缓冲液，pH＝6.6，配成不同浓度的样品溶液，按体积份数计，取2.5份，与2.5份的1％(W/V)的铁氰化钾混匀，在50℃温浴20min，然后用重量百分比浓度为10％的2.5份三氯乙酸终止反应，反应混合物离心10min，取上清液5份，加入5份蒸馏水及重量百分比浓度为0.1％的1份氯化铁，混匀后在700nm下测定吸光度值，如吸光度增大则还原能力增强；
所得结果为HCTS、TSCTS、SCTS、TCTS均具有很强的还原能力，还原能力强弱顺序为TSCTS＞TCTS＞SCTS＞HCTS。
8、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物对金属离子螯合能力的测定，不同浓度的样品溶液0.3份与2mM氯化亚铁0.3份和5mM的Ferrozine 0.2份混匀，用水调整体积为0.8份，混合均匀后，室温放置10min，在562nm处测定吸光值；
螯合能力L％＝(1-A样品/A对照)×100
所得结果为TSCTS、TCTS具有很强的螯合能力，其螯合金属50％时的浓度IC50分别为0.7729mg/ml，0.2266mg/ml，而HCTS、SCTS作用不明显，此四种壳聚糖硫酸酯衍生物对金属螯合能力测试均表现出浓度依赖性。
9、按照权利要求1所述定位壳聚糖硫酸酯的抗氧化活性的研究方法，其特征在于：所述各磺化产物总的抗氧化能力实验，用β-胡萝卜素-亚油酸体系作为总抗氧化能力的评价，取10份氯仿溶解2份β-胡萝卜素，在100ml圆底烧瓶中将氯仿浓缩至于，加入40份亚油酸，400份Tween 40，用10份氯仿溶解，然后将氯仿蒸出，加入100份水振荡成乳浊液，将1份不同浓度的样品与上述乳浊液混合，在470nm处测其吸光度，上述混合液一混合均匀马上测其吸光值，作为零时刻吸收，然后每隔30min测定一次吸光值直至颜色消失，空白为不含β-胡萝卜素的混样；其中氯仿、水为按毫升计的体积份数，β-胡萝卜素、亚油酸、Tween 40为按毫克计的重量份数；
总抗氧化能力AA％＝(2h后的β-胡萝卜素含量/起始β-胡萝卜素含量)×100
所得结果为HCTS、SCTS、TCTS具有很强的抗氧化能力，随着时间的延长，达到2h且最大浓度为300mg/ml时，HCTS的抗氧化能力为67.60％，SCTS最大，达到90.23％，TCTS稍弱，为59.79％，它们均具有一定的浓度依赖性，而TSCTS随浓度变化总抗氧化能力变化不明显，用β-胡萝卜素-亚油酸体系衡量的TSCTS的总抗氧化能力比较弱。
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2004
- 2004-08-25 CN CN 200410050314 patent/CN1740789A/zh active Pending
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