CN105572125A - 一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法。该方法先将被测样品的预处理：将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品；然后对样品进行多酶联合处理提取，依次包括样品的胃蛋白酶处理、胰蛋白酶处理、链霉蛋白酶E处理和植物复合水解酶Viscozyme？L处理，再利用冷乙酸乙酯萃取的方式进行提取液的还原糖的去除，最后用现有方法进行抗氧化物质含量及活性分析，本发明通过对被测样品的抗氧化活性物质的提取中采用模拟人体消化过程的多酶联合酶解方法，再结合细胞水平的抗氧化活性分析方法，从而建立一种生物相关性更强，更接近动物试验水平的抗氧化活性评价方法。

Description

一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法
技术领域
本发明涉及一种抗氧化活性的评价方法，特别是涉及一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，该方法可以应用于生物医药、食品、保健品等行业领域。
背景技术
现代医学研究表明，包括心血管类疾病、癌症、糖尿病等多种慢性疾病都与自由基密切相关。在正常情况下，人体内自由基的产生与消除处于平衡状态。随着年龄的增长，抗氧化酶类活性下降，使体内清除自由基的能力下降，体内过量的自由基对生物大分子(如蛋白质、脂质、DNA)具有损伤作用，进而导致疾病和衰老。同时，外界因素如污染的空气、食物，不良生活方式、情绪因素等也会造成体内自由基的过量产生。多食富含有天然抗氧化剂的果蔬、服用含有天然抗氧化剂的保健食品是减轻机体氧化最有效的方法。
目前评价抗氧化活性的方法有体内和体外两类。体内方法即动物或人体试验，这种方法的优点是准确性高，但时间长、成本高、费用高，因此一般不作为大量初筛和前期评价工作，只作为功能食品的最终评价方法。
体外方法分为化学法(如ORAC、PSC、DPPH、ABTS、FRAP等)和基于细胞水平的方法(CellularAntioxidantActivityAssay，简称CAA)。化学法在生理条件和环境、吸收和生物利用率、代谢等方面无法达到或接近体内的真实环境，因此不能如实反映抗氧化物质在体内的真实状况。而细胞抗氧化活性分析CAA方法，由于它考虑了生物环境及吸收等，因此其生物相关性很高，能较真实地反映出抗氧化物质在体内的抗氧化活性大小。利用CAA评价方法来筛选评价比化学法所得的结果更准确可靠。相对而言，CAA方法是抗氧化活性评价的较好的方法。
由于抗氧化活性成分的多样性，它们在各种果蔬菜或功能食品中存在的方式是多样的，如多酚类物质，它既有游离状态的自由酚，也有与纤维素、蛋白质、多糖等结合在一起的结合酚；而且，不论是自由的还是结合状态的多酚，在人体内经过消化时结构也会发生变化，而在体内最终起抗氧化作用的是消化之后的结构状态。但是，目前不论是化学法还是细胞CAA法，在抗氧化活性物质的提取过程中都是采用溶剂提取法，虽然考虑到了游离态和结合态的问题，但没有考虑到人体中的消化过程及结构的转变问题；因此，溶剂提取法存在缺陷，有待进一步改进。
发明内容
针对目前体外抗氧化活性分析和评价方法中直接采用溶剂对样品的抗氧化剂物质进行提取存在的与人体消化吸收真实体系差异性较大的问题，本发明建立一种基于细胞水平的新的抗氧化活性评价方法，通过对被测样品的抗氧化活性物质的提取中采用模拟人体消化过程的多酶联合酶解方法，再结合细胞水平的抗氧化活性分析方法，从而建立一种生物相关性更强，更接近动物试验水平的抗氧化活性评价方法。
本发明通过在体外模仿人体消化过程，以提取出样品中的不同状态的抗氧化活性物质，结合化学及细胞水平的抗氧化活性评价方法，对果蔬菜、功能食品、保健品及普通食品的抗氧化活性进行全面系统评价。具体而言，本发明在样品抗氧化活性物质的提取过程中采用模拟人体消化的多酶联合酶解提法代替传统的溶剂萃取法，并与抗氧化活性的CAA方法有机结合起来对抗氧化活性进行综合评价，可以最大限度使测定结果接近人体和动物试验，因此更为准确可靠。
本发明首次提出在细胞抗氧化活性评价方法的基础上，建立一种新的抗氧化活性评价方法。该发明的要点是针对目前CAA方法及其它化学评价方法中对抗氧化活性物质的提取中直接溶剂提取与真实人体消化吸收体系存在很大偏差的问题，先对样品进行近似于人体消化过程的多酶联合酶解过程，然后采用乙酸乙酯对酶解产物进行萃取，再利用细胞水平抗氧化评价方法CAA法对抗氧化活性进行分析，从而建立一种评价抗氧化活性的新方法。由于酶解过程会产生蛋白降解的氨基酸、多糖降解后产生的还原糖，而目前研究中都没有考虑这些因素可能对CAA测定的影响，本发明考虑到还原糖也具有还原性，采用乙酸乙酸对提取物进行萃取，有效消除还原糖及氨基酸的影响，克服了还原糖及氨基酸等对分析测定过程的影响。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，包括如下步骤：
(1)被测样品的预处理：将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品；
(2)样品的多酶联合处理提取：
a、样品的胃蛋白酶处理
将预处理水匀浆或保健口服液用HCl调节pH至0.5～2.0，取胃蛋白酶用HCl水溶液溶解后加入，用锡箔纸包裹避光，不断通入氮气，于37℃水浴摇床里反应0.5～2h，离心，分离出上清液A和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液加入5～30mg胃蛋白酶；
b、样品的胰蛋白酶处理
经胃蛋白酶处理并离心分离后的残渣，加入蒸馏水，用NaHCO3水溶液调节pH至6.5～8；然后取胰蛋白酶，溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液后加入；锡箔纸包裹避光，不断通入氮气，在37℃的恒温水浴摇床里反应1～6h；反应结束，离心，分离出上清液B和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶处理得到的残渣加入80‐120mL蒸馏水；每mL缓冲液加入胰蛋白酶1‐5mg；
c、样品的链霉蛋白酶E处理
经胰蛋白酶处理并离心后所得残渣再加入蒸馏水，采用0.1M的NaOH水溶液调节pH为7.0‐9.0，加入链霉蛋白酶E，在37℃下酶解0.5‐2h，离心，分离出上清液C和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶和胰蛋白酶处理得到的残渣加入80‐120mL蒸馏水和0.5‐5mg链霉蛋白酶E；
d、样品的植物复合水解酶ViscozymeL处理
将步骤c反应物离心后所得残渣，加入蒸馏水，采用0.5M的HCl水溶液调节pH至3.0‐4.5，加入诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)，在37℃的恒温水浴摇床里反应作用时间为8‐18h；酶解结束，离心分离，倒出并收集上清液；底部残渣加入蒸馏水，搅拌，离心，取上清液后，残渣再1次用水提一次；合并3次离心上清液，为上清液D；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液经步骤a‐c处理得到的残渣加入80‐120mL蒸馏水和20‐100μL诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)；
e、提取液的还原糖的去除
分别将上清液A、B、C和D合并，在40℃水浴下真空浓缩，浓缩到体积为50mL，加入1‐3倍体积的冷乙酸乙酯萃取，离心取乙酸乙酯层；余下水相再萃取2次，合并3次萃取液，真空浓缩挥干乙酸乙酯后加入蒸馏水定容至10mL，用样品管分装于‐80℃冰箱冻存待测；
(3)抗氧化物质含量及活性分析
a、总多酚含量的测定参照Folin‐Ciocalten比色法，以没食子酸为标准品，采用分光光度法对总酚类物质的含量进行测定；
b、总黄酮含量的测定采用SBC比色法，以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色测定；总黄酮含量用儿茶素当量来表示；
c、CAA测定
按照CAA进行抗氧化活性的测定；荧光染料DCFH‐DA进入细胞后被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH被自由基引发剂AAPH产生的自由基ROO·氧化成荧光化合物DCF，通过荧光的降低程度来衡量抗氧化能力。
为进一步实现本发明目的，优选地，所述将待测原料配置成水匀浆是将水果、蔬菜的生鲜原料加入蒸馏水，采用搅碎机打浆；或者是将固体功能食品、保健品、普通食品或干燥的食品原材料，采用粉碎机粉碎成细粉，加入蒸馏水调成匀浆。
优选地，每克水果、蔬菜的生鲜原料加入3‐6mL蒸馏水；每克固体功能食品、保健品、普通食品和干燥的食品原材料粉末加入20‐40mL蒸馏水。
优选地，所述步骤a‐d的离心条件为3000g，4℃，5min。
优选地，所述胃蛋白酶用HCl水溶液溶解的HCl水溶液的浓度为0.01M；所述预处理水匀浆或保健口服液用HCl水溶液调节pH至0.5～2.0的HCl水溶液的浓度为0.1‐1M。
优选地，所述NaHCO3水溶液的浓度为0.1M。
优选地，所述Na2CO3/NaHCO3缓冲液的浓度为0.1M。
优选地，所述冷乙酸乙酯的温度为4℃。
更优选地，本发明采取如下具体方法。一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，包括如下步骤：
(1)被测样品的预处理
将待测原料配置成水匀浆；对于水果、蔬菜的生鲜原料，取25g供试样品，加入75～150mL蒸馏水，采用搅碎机打浆1～2min，并用高速匀浆机进一步将物料打成成匀浆，备用；对于固体功能食品、保健品、普通食品或干燥的食品原材料，采用粉碎机粉碎成细粉，取5g粉末，加入100～200mL蒸馏水调成匀浆，备用；对于口服液类保健食品，无需要进行预处理；
(2)样品的多酶联合处理提取
a、样品的胃蛋白酶处理
在250mL三角中，加入上述果蔬、功能食品或食品原料样品预处理匀浆或保健口服液100mL，用0.1M‐1M的HCl调节pH至0.5～2.0，取5～30mg胃蛋白酶用5mL0.01MHCl溶解后加入，用锡箔纸包裹避光，并向三解瓶中不断通入氮气，于37℃水浴摇床里反应0.5～2h，离心(3000g,4℃)5min，分离出上清液A和残渣；
b、样品的胰蛋白酶处理
经胃蛋白酶处理并离心分离后的残渣，加入80‐120mL蒸馏水，用0.1MNaHCO3调节pH至6.5～8。然后取5‐25mg胰蛋白酶，溶于5mL0.1MNa2CO3/NaHCO3缓冲液后加入。采用锡箔纸包裹避光，且在氮气流下在37℃的恒温水浴摇床里反应1～6h。反应结束，离心分离(3000g，4℃)5min，倒出并收集上清液，记为上清液B，底部残渣待进一步处理。
c、样品的链霉蛋白酶E处理
经胰蛋白酶处理并离心后所得残渣再加入80‐120mL蒸馏水，采用0.1MNaOH调节pH为7.0‐9.0，加入0.5‐5mg链霉蛋白酶E，在37℃下酶解0.5‐2h，离心(3000g，4℃)5min，取上清液C。
d、样品的植物复合水解酶ViscozymeL处理
将上述反应物离心后所得残渣，加入80‐120mL蒸馏水，采用0.5MHCl调节pH至3.0‐4.5，加入20‐100μL诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)，在37℃的恒温水浴摇床里反应作用时间为8‐18h。酶解结束是，离心分离(3000g，4℃)5min，倒出并收集上清液；底部残渣加入100mL蒸馏水，搅拌3min，离心，取上清液后，残渣再1次用水提一次。合并3次离心上清液，为上清液D。
e、提取液的还原糖的去除
分别将上清液A、B、C和D合并，在40℃水浴下真空浓缩，浓缩到体积为50mL，加入1‐3倍体积的4℃冷乙酸乙酯萃取，离心取乙酸乙酯层；余下水相再萃取2次，合并3次萃取液，真空浓缩挥干乙酸乙酯后加入蒸馏水定容至10mL，用样品管分装于‐80℃冰箱冻存待测。
(3)抗氧化物质含量及活性分析
a、总多酚含量的测定参照Folin‐Ciocalten比色法(Singleton，Orthofer，&Lamuela‐Raventos，1999)。以没食子酸为标准品，采用分光光度法对总酚类物质的含量进行测定。
b、总黄酮含量的测定采用美国康奈尔大学刘瑞海教授建立的硼氢化钠/氯醌(SBC)比色法(XiangjiuHe&RHLiu,2008)。以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色测定。总黄酮含量用儿茶素当量来表示。
c、CAA测定
测定方法完全按照美国康奈尔大学刘瑞海教授(KellyL.Wolfe和RuiHaiLiu)建立的CAA(cellularantioxidantactivity)进行抗氧化活性的测定。荧光染料DCFH‐DA进入细胞后被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH很容易被自由基引发剂AAPH产生的自由基ROO·氧化成荧光化合物DCF(dichlorofluorescein),抗氧化剂的存在可以和DCFH竞争自由基，从而减少荧光物质的形成，最后通过荧光的降低程度来衡量抗氧化能力。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和效果：
1)本发明在抗氧化活性物质的提取方法上采用与人体消化过程相近的多酶联合酶解提取方法，这样提取得到的抗氧化活性成分就与食品或保健品在人体中真实消化吸收过程较为相近；而且，在抗氧化活性的测定方法上也采用目前较先进的CAA法，与传统的化学法相比，其结果与人体更相近。因此，本发明将这两者有机结合起来，就能使食品及功能食品的抗氧化活性评价更为合理可信。
2)传统溶剂萃取法是先用冷的80％丙酮-水进行提取自由酚，提取三次后合并提取液浓缩回收溶剂定容得到测定自由酚的分析小样；然后残渣采用氢氧化钠在氮气保护下消化1小时后再用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后定容得结合酚的有效成分分析小样。表1为本发明方法与溶剂萃取法的最后抗氧化活性测定结果的比较，表中本发明的数据来自实施例的总结；表1可见，本发明将多酶联合酶解提取法与传统的溶剂萃取法得到的测定结果进行对比，发现本发明采用的多酶联合酶解法的效果显著好于溶剂提取法。
表1本发明方法与溶剂萃取法的最后抗氧化活性测定结果的比较
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，需要说明的是，实施例不构成对本发明要求保护范围的限定。
下列实施例中抗氧化物质含量及活性分析
a、总多酚含量的测定参照Folin‐Ciocalten比色法(Singleton，Orthofer，&Lamuela‐Raventos，1999)。以没食子酸为标准品，采用分光光度法对总酚类物质的含量进行测定。
b、总黄酮含量的测定采用美国康奈尔大学刘瑞海教授建立的硼氢化钠/氯醌(SBC)比色法(XiangjiuHe&RHLiu,2008)。以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色测定。总黄酮含量用儿茶素当量来表示。
c、CAA测定
测定方法完全按照美国康奈尔大学刘瑞海教授(KellyL.Wolfe和RuiHaiLiu)建立的CAA(cellularantioxidantactivity)进行抗氧化活性的测定。荧光染料DCFH‐DA进入细胞后被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH很容易被自由基引发剂AAPH产生的自由基ROO·氧化成荧光化合物DCF(dichlorofluorescein)，抗氧化剂的存在可以和DCFH竞争自由基，从而减少荧光物质的形成，最后通过荧光的降低程度来衡量抗氧化能力。
实施例1
取藏青25青稞10g，采用家用小型打粉机将其打成粉末，取5g粉末，加入100mL蒸馏水调成匀浆，先采用0.1M的HCl调节pH至2.0，然后加入20mg的胃蛋白酶，在37℃下酶解1.5h。离心(3000g,4℃)5min，倒出上清液A，残渣加入100mL蒸馏水，用0.1MNaHCO3调节pH7.5，加入15mg胰蛋白酶，在37℃下搅拌酶解5h，然后离心(3000g,4℃)5min，取上清液B；残渣再加入100mL蒸馏水，采用0.1MNaOH调节pH8，并加入2mg链霉蛋白酶E并在37℃下酶解1h，离心，取上清液C，残渣加入100mL蒸馏水后调节pH4，并加入50μL诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)并在37℃下搅拌酶解15h，离心，取上清液D。收集上清液A、B、C和D，浓缩至50mL，加入50mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯层后，水相再加入50mL乙酸乙酯萃取，取上层，再重复萃取一次，合并三次萃取液，在45℃下采用旋转真空浓缩回收乙酸乙酯后，往蒸馏烧瓶中加入8mL蒸馏水，并在超声浴中振荡3min，最后倒出并采用10mL容量瓶定容至10mL，采用1mL样品管分装冷冻于‐80℃冰箱中备用。分别进行总多酚和总黄酮含量以及CAA的测定，结果如表2所示。
传统溶剂萃取法是先用冷的80％丙酮-水进行提取自由酚，提取三次后合并提取液；然后残渣采用氢氧化钠在氮气保护下消化1小时后再用乙酸乙酯萃取三次，回收完溶剂后将上述自由酚提取液加入，再进一步浓缩定容10mL后分装冷藏或马上分析总酚、总黄酮及CAA测定，以下实施例有关溶剂提取法同实施例1。
表2藏青25的抗氧化活性测定结果并与溶剂提取法比较
实施例2
取云南长黑青稞10g，采用家用小型打粉机将其打成粉末，取5g粉末，加入120mL蒸馏水调成匀浆，先采用0.1M的HCl调节pH至1.5，然后加入25mg的胃蛋白酶，在37℃下酶解2h。离心(3000g,4℃)5min，倒出上清液A，残渣加入120mL蒸馏水，用0.1MNaHCO3调节pH7.0，加入20mg胰蛋白酶，在37℃下搅拌酶解6h，然后离心(3000g,4℃)5min，取上清液B；残渣再加入100mL蒸馏水，采用0.1MNaOH调节pH8.6，并加入3mg链霉蛋白酶E并在37℃下酶解1.5h，离心，取上清液C，残渣加入120mL蒸馏水后调节pH4.5，并加入40μL诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)并在37℃下搅拌酶解12h，离心，取上清液D。收集上清液A、B、C和D，浓缩至50mL，加入50mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯层后，水相再加入50mL乙酸乙酯萃取，取上层，再重复萃取一次，合并三次萃取液，在45℃下采用旋转真空浓缩回收乙酸乙酯后，往蒸馏烧瓶中加入8mL蒸馏水，并在超声浴中振荡3min，最后倒出并采用10mL容量瓶定容至10mL，采用1mL样品管分装冷冻于‐80℃冰箱中备用。分别进行总多酚和总黄酮含量以及CAA的测定，结果如表3所示。
表3云南长黑青稞抗氧化活性测定结果并与溶剂提取法比较
实施例3
取25g梨，加入125mL蒸馏水，采用搅碎机打浆2min，并用高速匀浆机进一步将物料打成成匀浆，采用0.1M的HCl调节pH至1.0，然后加入15mg的胃蛋白酶，在37℃下酶解1h。离心(3000g,4℃)5min，倒出上清液A，残渣加入100mL蒸馏水，用0.1MNaHCO3调节pH8.0，加入10mg胰蛋白酶，在37℃下搅拌酶解4.5h，然后离心(3000g,4℃)5min，取上清液B；残渣再加入100mL蒸馏水，采用0.1MNaOH调节pH8.0，并加入4mg链霉蛋白酶E并在37℃下酶解2h，离心，取上清液C，残渣加入120mL蒸馏水后调节pH3.5，并加入70μL诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)并在37℃下搅拌酶解18h，离心，取上清液D。收集A、B、C和D，浓缩至50mL，加入50mL乙酸乙酯萃取，吸取乙酸乙酯层后，水相再加入50mL乙酸乙酯萃取，取上层，再重复萃取一次，合并三次萃取液，在45℃下采用旋转真空浓缩回收乙酸乙酯后，往蒸馏烧瓶中加入8mL蒸馏水，并在超声浴中振荡3min，最后倒出并采用10mL容量瓶定容至10mL，采用1mL样品管分装冷冻于‐80℃冰箱中备用。分别进行总多酚和总黄酮含量以及CAA的测定，结果如表4所示。
表4梨的抗氧化活性测定结果并与溶剂提取法比较
传统溶剂萃取法是先用冷的80％丙酮-水进行提取自由酚，提取三次后合并提取液浓缩回收溶剂定容得到测定自由酚的分析小样；然后残渣采用氢氧化钠在氮气保护下消化1小时后再用乙酸乙酯萃取三次，回收溶剂后定容得结合酚的有效成分分析小样。表2-4三个实施例的结果表明，本发明所采用的方法测得的抗氧化活性的CAA值都要明显高于传统的溶剂提取法，而且多酚和总黄酮的含量也有相似的规律，显然采用传统方法会使抗氧化活性的测定结果虚低，而本发明方法则可以获得较为可靠的结果。

Claims (8)

1.一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)被测样品的预处理：将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品；
(2)样品的多酶联合处理提取：
a、样品的胃蛋白酶处理
将预处理水匀浆或保健口服液用HCl调节pH至0.5～2.0，取胃蛋白酶用HCl水溶液溶解后加入，用锡箔纸包裹避光，不断通入氮气，于37℃水浴摇床里反应0.5～2h，离心，分离出上清液A和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液加入5～30mg胃蛋白酶；
b、样品的胰蛋白酶处理
经胃蛋白酶处理并离心分离后的残渣，加入蒸馏水，用NaHCO3水溶液调节pH至6.5～8；然后取胰蛋白酶，溶于Na2CO3/NaHCO3缓冲液后加入；锡箔纸包裹避光，不断通入氮气，在37℃的恒温水浴摇床里反应1～6h；反应结束，离心，分离出上清液B和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶处理得到的残渣加入80‐120mL蒸馏水；每mL缓冲液加入胰蛋白酶1‐5mg；
c、样品的链霉蛋白酶E处理
经胰蛋白酶处理并离心后所得残渣再加入蒸馏水，采用0.1M的NaOH水溶液调节pH为7.0‐9.0，加入链霉蛋白酶E，在37℃下酶解0.5‐2h，离心，分离出上清液C和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶和胰蛋白酶处理得到的残渣加入80‐120mL蒸馏水和0.5‐5mg链霉蛋白酶E；
d、样品的植物复合水解酶ViscozymeL处理
将步骤c反应物离心后所得残渣，加入蒸馏水，采用0.5M的HCl水溶液调节pH至3.0‐4.5，加入诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)，在37℃的恒温水浴摇床里反应作用时间为8‐18h；酶解结束，离心分离，倒出并收集上清液；底部残渣加入蒸馏水，搅拌，离心，取上清液后，残渣再1次用水提一次；合并3次离心上清液，为上清液D；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液经步骤a‐c处理得到的残渣加入80‐120mL蒸馏水和20‐100μL诺维信复合植物水解酶(ViscozymeL)；
e、提取液的还原糖的去除
分别将上清液A、B、C和D合并，在40℃水浴下真空浓缩，浓缩到体积为50mL，加入1‐3倍体积的冷乙酸乙酯萃取，离心取乙酸乙酯层；余下水相再萃取2次，合并3次萃取液，真空浓缩挥干乙酸乙酯后加入蒸馏水定容至10mL，用样品管分装于‐80℃冰箱冻存待测；
(3)抗氧化物质含量及活性分析
a、总多酚含量的测定参照Folin‐Ciocalten比色法，以没食子酸为标准品，采用分光光度法对总酚类物质的含量进行测定；
b、总黄酮含量的测定采用SBC比色法，以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色测定；总黄酮含量用儿茶素当量来表示；
c、CAA测定
按照CAA进行抗氧化活性的测定；荧光染料DCFH‐DA进入细胞后被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH被自由基引发剂AAPH产生的自由基ROO·氧化成荧光化合物DCF，通过荧光的降低程度来衡量抗氧化能力。
2.根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于，所述将待测原料配置成水匀浆是将水果、蔬菜的生鲜原料加入蒸馏水，采用搅碎机打浆；或者是将固体功能食品、保健品、普通食品或干燥的食品原材料，采用粉碎机粉碎成细粉，加入蒸馏水调成匀浆。
3.根据权利要求2所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于，每克水果、蔬菜的生鲜原料加入3‐6mL蒸馏水；每克固体功能食品、保健品、普通食品和干燥的食品原材料粉末加入20‐40mL蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于，所述，步骤a‐d的离心条件为3000g，4℃，5min。
5.根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于，所述胃蛋白酶用HCl水溶液溶解的HCl水溶液的浓度为0.01M；所述预处理水匀浆或保健口服液用HCl水溶液调节pH至0.5～2.0的HCl水溶液的浓度为0.1‐1M。
6.根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于，所述NaHCO3水溶液的浓度为0.1M。
7.根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于，所述Na2CO3/NaHCO3缓冲液的浓度为0.1M。
8.根据权利要求1所述的果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于，所述冷乙酸乙酯的温度为4℃。
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