CN106053409A - 一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法。按如下步骤操作：用丙酮浸提出红肉苹果中的花青苷，抽滤，滤液旋转蒸发至丙酮除尽，剩余液体用滤膜过滤后，4℃保存备用；体外培养猪卵巢颗粒细胞；用不同体积分数的红肉苹果花青苷和活性氧阳性对照试剂Rosup刺激猪卵巢颗粒细胞F1代6小时；给细胞装载荧光探针DCFH‑DA，收集细胞后用流式细胞仪检测。本发明方法原理可靠，操作简单，结果显示，红肉苹果花青苷能降低细胞内的活性氧水平，且随着浓度的增加效果越明显。
Description
技术领域：
本发明涉及一种检测天然色素——红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法，属于功能性苹果保健功能及作为天然抗氧化剂的开发应用领域。
背景技术：
红肉苹果因其含有丰富的花青苷，被誉为功能性果品。研究红肉苹果的抗氧化活性，这对功能性果品的选育以及天然抗氧化剂的开发应用具有重要意义。苹果是世界上栽培面积大、产量多的树种之一，另外，它也是全球用于鲜食的最为广泛的水果品种之一，其栽培范围分布于世界各个地区，而我国凭借得天独厚的苹果生产条件和销售渠道已成为世界苹果栽培、苹果浓缩汁生产和出口第一大国，面积和产量分别约占世界的42％和50％。
红肉苹果从外皮到果核都是玫瑰般的红色，其所含的花青苷要比普通苹果多出很多。花青苷是一种抗氧化剂，其具有软化血管、促进新陈代谢和预防心脑血管疾病等保健功能，是一种公认的对健康有益的“健康物质”。
随着人们对生活质量要求的提高，对自身身体健康的重视程度也在不断提高，红肉苹果凭借其独特的口感和保健功能必将成为消费者广泛追捧的对象。所以为了确定红肉苹果具有抗氧化功能，我们借助猪卵巢颗粒细胞的体外培养模型，深入研究红肉苹果提取液对猪卵巢颗粒细胞抗氧化作用，这对红肉苹果的选育与开发应用具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法，该方法首次采用了红肉苹果提取液对猪卵巢颗粒细胞进行处理，为研究红肉苹果的抗氧化功能提供一种确实可行的实验方法，使富含花青苷的红肉苹果的保健功能深入人心。
为了实现上述发明目的，本发明方法利用猪卵巢颗粒细胞装载荧光探针2'7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA，碧云天活性氧检测试剂盒)，收集后用流式细胞仪检测了猪卵巢颗粒细胞在用不同体积分数(1/2000，3/2000，1/200)红肉苹果花青苷提取液和0.25mg/ml活性氧阳性对照试剂(Rosup，(碧云天活性氧检测试剂盒[产品编号：S0033]里的S0033-2活性氧阳性对照药品)刺激6小时后的阳性细胞，结果显示阴性对照的阳性细胞率为11.61％，添加Rosup试剂为阳性对照的阳性细胞率为46.06％，这表明添加Rosup试剂可以有效引起细胞内的活性氧升高；在添加Rosup试剂同时添加体积分数为1/2000的红肉苹果花青苷提取液，阳性细胞率由46.06％降为21.55％，当添加Rosup试剂同时添加体积分数为3/2000的红肉苹果花青苷提取液，阳性细胞率由21.55％降为11.31％；当添加Rosup试剂同时添加体积分数为1/200的红肉苹果花青苷提取液，阳性细胞率由11.31％降为3.75％，这表明红肉苹果花青苷提取液能有效降低阳性细胞比例，且随着添加花青苷浓度升高，降低阳性细胞比例效果越明显。
本发明的一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法，按照如下步骤操作：
第一步，红肉苹果花青苷样品的制备：
取优质的红肉苹果为原料，洗净后沥干，削皮，将皮用液氮研磨成粉；将得到的苹果皮粉末置于锥形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液；将锥形瓶用封口膜封口，置于超声波清洗器中，控制温度在30℃，超声30min后置于黑暗中浸提10小时，得浸提液；将浸提液用连接真空抽气泵的布氏漏斗抽滤；将所得滤液倒入旋蒸瓶，在旋转蒸发仪上以20-30℃旋蒸以去除丙酮溶剂；避光静置；抽滤，滤纸上的颗粒即为花青苷粗品；将带有花青苷粗品的滤纸于-70℃预冷，后放入真空冷冻干燥机内冻干至少12小时；称取0.0090g所得的花青苷粗品，加4.5mL二甲基亚砜(DMSO)稀释，用0.22μm滤膜过滤后用锡箔纸包裹，4℃避光保存待用；
所述第一步中为了减少提取中由于提取溶剂选择不当而给细胞造成伤害，选择了丙酮溶剂，它比甲醇毒性小，易挥发，且旋转蒸发除去丙酮避免了外来因素给红肉苹果花青苷对颗粒细胞抗氧化作用带来影响；将果皮用液氮研磨成细粉并用超声30分钟的方法提取，可最大程度地将果皮中的花青苷浸提出来；真空冷冻干燥冻干花青苷粗品，避免了红肉苹果花青苷由于温度和空气中的氧接触而降解。
第二步，猪卵巢颗粒细胞的培养：
采集母猪形态健康没有排卵的卵巢，用75％的酒精清洗卵巢表面，随后用37℃生理盐水洗三遍，后放入生理盐水中，置于水浴锅上37℃保温；使用注射器抽取直径大于3mm的卵泡于离心管中，37℃自然沉降后，弃掉上层卵泡液，吸取剩下的白色沉淀，移至离心管中，离心，弃掉上清和上层红色血细胞，加入磷酸盐缓冲液(PBS)，将底部细胞沉淀吹打均匀，离心，弃掉上清和上层红色血细胞，再加PBS，重复洗一遍；而后，将细胞沉淀接种到加有10mL含有10％胎牛血清(FBS)及100IU青霉素和链霉素的M199(HyClone)培养液的10cm贴壁培养皿中，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养；在细胞培养24小时时更换新的培养液，继续放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养，此时细胞组织块都已贴壁；在细胞培养72小时时，弃掉原代培养培养皿中的培养液，每个培养皿中加入胰酶细胞消化液(TE)，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里孵育3-5min，待细胞组织块消化，将细胞吹打下来，转入离心管，离心；弃上清，将细胞接种到24孔板中，每孔加有1mL培养液且每孔接种的细胞数约为1×105个，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里静置12小时后待用；
第三步，用红肉苹果花青苷刺激细胞：
将静置12小时后的猪卵巢颗粒细胞，更换新培养液，用红肉苹果花青苷刺激细胞，按照实验设计，2个空白对照孔，2个阴性对照孔，2个阳性对照孔，2个加0.5μL体积分数1/2000的红肉苹果花青苷孔，2个加1.5μL体积分数3/2000的红肉苹果花青苷孔，2个加5μL体积分数1/200的红肉苹果花青苷孔，未加花青苷或加花青苷不足5μL的加DMSO补齐，加完药品，放入培养箱中处理6小时；
第三步中所述培养液为含有10％胎牛血清(FBS)及100IU青霉素和链霉素的M199(HyClone)培养液；
第四步，原位装载探针：
按照体积比1:2000用无血清的M199培养液稀释2'7'-二乙酰二氯荧光素(DCFH-DA，碧云天活性氧检测试剂盒)，使终浓度为5μM/L，将处理6小时的颗粒细胞，去除培养液，每孔加入500μL稀释好的DCFH-DA探针溶液，空白对照组不加；阳性对照组和三个加花青苷处理组都加入2.5μL Rosup，其它组用水补齐，放入培养箱孵育半小时；
第五步，检测：
将装载完探针的细胞取出，弃上清，每孔加500μL TE，放入培养箱孵育5min，将细胞吹打下来，转移到对应标记的离心管中，过细胞筛后用流式细胞仪检测。
本发明方法中对红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的实验，设置了6组，包括空白对照，阴性对照，阳性对照和添加1/2000、3/2000、1/200体积分数红肉苹果花青苷处理组，空白对照的设立，排除了其他干扰因素对阴性对照组中探针的干扰，阴性对照组的设立排除了阳性对照组加Rosup的干扰，三个花青苷处理组按浓度梯度差近乎3倍设置，且未加花青苷或Rosup处理的，都加DMSO和H2O补齐。
空白对照组阳性细胞率为1.36％，设置阴性对照表明装载探针后阳性细胞率为11.61％，更容易被检测到，设置阳性对照可看出添加Rosup明显增加了阳性细胞率，后又设置了加Rosup和三个不同浓度花青苷处理细胞，阳性细胞率随着添加红肉苹果花青苷浓度的增加明显减小。
本发明方法原理可靠，实验设计严谨，操作简单。DCFH-DA探针本身没有荧光，可自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH(2',7'-二氢二氯荧光素)，而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF(2',7'-二氯荧光素)，检测DCF的荧光就可以知道细胞内的活性氧水平。活性氧阳性对照可以显著提高细胞内的活性氧水平，红肉苹果花青苷能降低细胞内的活性氧水平，对猪卵巢颗粒细胞的抗氧化作用具有一定的效果，且随着浓度的增加效果越明显。
附图说明：
图1为流式细胞仪检测的红肉苹果花青苷处理后的猪卵巢颗粒细胞ROS阳性率图。
具体实施方式：
下面通过实施例和附图对本发明方法作进一步的阐述。
实施例1、
本发明的提取红肉苹果花青苷对猪卵巢颗粒细胞抗氧化作用的操作步骤如下：
第一步，红肉苹果花青苷样品的制备：
1)清洗削皮：取优质的红肉苹果为原料，洗净之后沥干，削皮，将皮用液氮研磨成粉；
2)浸提：将步骤1)得到的苹果皮粉末置于锥形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液；
3)超声、浸提：将步骤2)中的锥形瓶用封口膜封口，置于超声波清洗器中，控制温度在30℃，超声30min后置于黑暗中浸提10h；
4)抽滤：将步骤3)中所得的浸提液用连接真空抽气泵的布氏漏斗抽滤；
5)旋蒸：将步骤4)中所得滤液倒入旋蒸瓶，在旋转蒸发仪上以20-30℃旋蒸以去除丙酮溶剂；
6)避光静置5小时；
7)抽滤，滤纸上的颗粒即为花青苷粗品；
8)冻干：将步骤7)中带有花青苷粗品的滤纸于-70℃预冷，后放入真空冷冻干燥机内冻干至少12小时；
9)溶解花青苷：称取0.0090g步骤8)中所得的花青苷粗品，加4.5mLDMSO稀释，用0.22μm滤膜过滤后用锡箔纸包裹，4℃避光保存待用；
第二步，猪卵巢颗粒细胞的培养：
1)采集新鲜出栏母猪形态健康未排卵的卵巢，立即放入含有青链霉素各100IU的37℃生理盐水中，用75％的酒精对卵巢表面稍作清洗，随后用37℃生理盐水洗三遍，后放入生理盐水中，置于水浴锅上37℃保温；
2)使用18号针头的10mL注射器，抽取直径大于3mm的卵泡于15mL离心管中，37℃自然沉降15分钟后，弃掉上层卵泡液，吸取剩下的2mL白色沉淀，移至1.5mL离心管中，300g离心三分半钟，弃掉上清和上层红色血细胞，加入1mL PBS，将底部细胞沉淀吹打均匀，300g离心三分半钟后，弃掉上清和上层红色血细胞，再加1mL PBS，重复洗一遍；而后，将细胞沉淀接种到加有10mL含有10％FBS及100IU青霉素和链霉素的M199培养液的10cm贴壁培养皿中，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养；
3)换液：在细胞培养24小时时更换新的培养液，继续放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养，此时细胞组织块都已贴壁；
4)传代：在细胞培养72小时时，弃掉原代培养培养皿中的培养液，每个培养皿中加入2mLTE，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里孵育3-5min，待细胞组织块消化，将细胞吹打下来，转入1.5mL离心管，300g离心5分钟；弃上清，将细胞接种到24孔板中，每孔加有1mL培养液且每孔接种的细胞数约为1×105个，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里静置12小时后待用；
第三步，用红肉苹果花青苷刺激细胞：
将静置12小时后的猪卵巢颗粒细胞，更换1mL新培养液，用红肉苹果花青苷提取液刺激细胞，按照实验设计，2个空白对照孔，2个阴性对照孔，2个阳性对照孔，2个加0.5μL(体积分数1/2000)红肉苹果花青苷孔，2个加1.5μL(体积分数3/2000)红肉苹果花青苷孔，2个加5μL(体积分数1/200)红肉苹果花青苷孔，未加花青苷或加花青苷不足5μL的加DMSO补齐，加完药品，放入培养箱中处理6小时；
所述培养液为含有10％胎牛血清(FBS)及100IU青霉素和链霉素的M199(HyClone)培养液；
第四步，原位装载探针：
按照体积比1:2000用无血清的M199培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为5μM/L。将处理6小时的颗粒细胞，去除培养液，每孔加入500μL稀释好的DCFH-DA探针溶液，空白对照组不加；阳性对照组和三个加花青苷处理组都加入2.5μL Rosup，其它组用水补齐，放入培养箱孵育半小时；
第五步，检测：
将装载完探针的细胞拿出，弃上清，每孔加500μLTE，放入培养箱孵育5min，将细胞吹打下来，转移到对应标记的离心管中，过细胞筛后用流式细胞仪检测。
如图1中A所示，空白对照组阳性细胞率为1.36％，如图1中B所示，装载DCFH-DA探针的阴性对照组阳性细胞率为11.61％，说明装载DCFH-DA探针后，阳性细胞更易被检测；如图1中C所示，添加活性氧阳性对照试剂(Rosup)刺激6小时的阳性对照组阳性细胞率为46.06％，这表明添加Rosup试剂可以有效引起细胞内的活性氧升高；如图1中D、E、F所示，添加Rosup试剂同时添加体积分数1/2000、3/2000、1/200的红肉苹果花青苷，阳性细胞率分别为21.55％、11.31％和3.75％，这表明红肉苹果花青苷提取液能有效降低阳性细胞比例，且随着添加花青苷浓度升高，降低阳性细胞比例效果越明显。
Claims (2)
1.一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，红肉苹果花青苷样品的制备：取红肉苹果为原料，洗净后沥干，削皮，将皮用液氮研磨成粉；将得到的苹果皮粉末置于锥形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液；将锥形瓶用封口膜封口，置于超声波清洗器中，控制温度在30℃，超声30min后置于黑暗中浸提10小时，得浸提液；将浸提液用连接真空抽气泵的布氏漏斗抽滤；将所得滤液倒入旋蒸瓶，在旋转蒸发仪上以20-30℃旋蒸以去除丙酮溶剂；避光静置；抽滤，滤纸上的颗粒即为花青苷粗品；将带有花青苷粗品的滤纸于-70℃预冷，后放入真空冷冻干燥机内冻干至少12小时；称取0.0090g所得的花青苷粗品，加4.5mL二甲基亚砜DMSO稀释，用0.22μm滤膜过滤后用锡箔纸包裹，4℃避光保存待用；第二步，猪卵巢颗粒细胞的培养：采集母猪形态健康没有排卵的卵巢，用75％的酒精清洗卵巢表面，随后用37℃生理盐水洗三遍，后放入生理盐水中，置于水浴锅上37℃保温；使用注射器抽取直径大于3mm的卵泡于离心管中，37℃自然沉降后，弃掉上层卵泡液，吸取剩下的白色沉淀，移至离心管中，离心，弃掉上清和上层红色血细胞，加入磷酸盐缓冲液PBS，将底部细胞沉淀吹打均匀，离心，弃掉上清和上层红色血细胞，再加PBS，重复洗一遍；而后，将细胞沉淀接种到加有10mL含有10％胎牛血清FBS及100IU青霉素和链霉素的M199培养液的10cm贴壁培养皿中，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养；在细胞培养24小时时更换新的培养液，继续放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里培养，此时细胞组织块都已贴壁；在细胞培养72小时时，弃掉原代培养培养皿中的培养液，每个培养皿中加入胰酶细胞消化液TE，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里孵育3-5min，待细胞组织块消化，将细胞吹打下来，转入离心管，离心；弃上清，将细胞接种到24孔板中，每孔加有1mL培养液且每孔接种的细胞数为1×105个，放入37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱里静置12小时后待用；第三步，用红肉苹果花青苷刺激细胞：将静置12小时后的猪卵巢颗粒细胞，更换新培养液，用红肉苹果花青苷刺激细胞，按照实验设计，2个空白对照孔，2个阴性对照孔，2个阳性对照孔，2个加0.5μL体积分数1/2000的红肉苹果花青苷孔，2个加1.5μL体积分数3/2000的红肉苹果花青苷孔，2个加5μL体积分数1/200的红肉苹果花青苷孔，未加花青苷或加花青苷不足5μL的加DMSO补齐，加完药品，放入培养箱中处理6小时；所述培养液为含有10％FBS及100IU青霉素和链霉素的M199培养液；第四步，原位装载探针：按照体积比1:2000用无血清的M199培养液稀释2'7'-二乙酰二氯荧光素DCFH-DA，使终浓度为5μM/L，将处理6小时的颗粒细胞，去除培养液，每孔加入500μL稀释好的DCFH-DA探针溶液，空白对照组不加；阳性对照组和三个加花青苷处理组都加入2.5μLRosup，其它组用水补齐，放入培养箱孵育半小时；第五步，检测：将装载完探针的细胞取出，弃上清，每孔加500μLTE，放入培养箱孵育5min，将细胞吹打下来，转移到对应标记的离心管中，过细胞筛后用流式细胞仪检测。
2.根据权利要求1所述的一种检测红肉苹果花青苷降低猪卵巢颗粒细胞内活性氧的方法，其特征在于空白对照组阳性细胞率为1.36％；装载DCFH-DA探针的阴性对照组阳性细胞率为11.61％；添加活性氧阳性对照试剂Rosup，刺激6小时的阳性对照组，阳性细胞率为46.06％；在添加Rosup试剂同时添加体积分数分别为1/2000、3/2000、1/200的红肉苹果花青苷，阳性细胞率分别为21.55％、11.31％和3.75％，阳性细胞率随着添加红肉苹果花青苷浓度的增加明显减小。
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