CN105524183A - 一种荸荠多糖的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荸荠多糖的提取方法，其包括一次提取，称取荸荠粉按料液重量比1：20-40加入蒸馏水，在60-70℃下进行超声波提取，超声时间为20-30min，超声功率为600w；二次提取，将步骤一制得的溶液降至室温，然后加入纤维素酶进行二次提取，其中酶解温度为40-48℃，酶解时间为35-45min，酶用量为150-180U/g；94％乙醇脱脂取上清液；去蛋白糖浓缩得到荸荠粗多糖；利用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex？G-25凝胶柱层析进行荸荠多糖的纯化制得荸荠多糖。本发明所述荸荠多糖的提取方法，具有反应条件温和、时间短、试剂消耗少等优点，适于工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物多糖的提取方法。更具体地说，本发明涉及一种荸荠多糖的提取方法。
背景技术
荸荠(Eleochairistoberosa)，又名马蹄(Waterchestnut)，地栗、乌芋、通天草等，属莎草科荸荠属，是多年生浅水草本植物。在中国长江流域以南各省均有栽培。荸荠以其地下球茎为食用器官，是一种药食兼用的果蔬类食品。其肉质细嫩，营养丰富，汁多味甜，清脆爽口，在南方自古有“地下雪梨”之美誉，北方则称其为“江南人参”。
研究发现马蹄内含有的活性成分包括黄酮类、多酚类、多糖类、甾醇类和马蹄英等。荸荠多糖具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节等功能与人工合成的抗氧化剂相比，荸荠多糖具有安全性高、来源广等特点，在食品、化妆品和医药等领域显示出广阔的应用前景。目前荸荠多糖提取方法甚多，每种方法都各有利弊，选择合适的荸荠多糖提取方法可满足不同的需要。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种荸荠多糖的提取方法，其采用酶解法与超声波相结合的提取工艺，具有反应条件温和、时间短、试剂消耗少等优点，适于工业化大生产。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种荸荠多糖的提取方法，包括以下步骤：
步骤一，一次提取，称取荸荠粉100g，按料液重量比1：20-40加入蒸馏水，在60-70℃下进行超声波提取，超声时间为20-30min，超声功率为600w；
步骤二，二次提取，将步骤一制得的溶液降至室温，然后加入纤维素酶进行二次提取，其中酶解温度为40-48℃，酶解时间为35-45min，酶用量为150-180U/g；
步骤三，脱脂，将步骤二制得的溶液加入94％乙醇脱脂，沉淀静置过夜后离心取上清液；
步骤四，将步骤三制得的上清液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，摇匀，静止沉淀30min；倾倒去上清得沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，得到糖液；将制得的糖液,用体积比为25∶5∶1的糖液:氯仿:正丁醇进行萃取,弃去中间层的变性蛋白及下层的有机液，萃取5次，得到去蛋白糖溶液；将去蛋白糖液浓缩,浓缩液先放冰箱中冷冻,再放置真空冷冻干燥，得到荸荠粗多糖；
步骤五，利用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-25凝胶柱层析进行荸荠多糖的纯化制得荸荠多糖。
优选的是，所述步骤一中，超声波提取的所述料液重量比为1：40，超声温度为62℃，超声时间为21min，超声功率为600w。
优选的是，所述步骤二中，酶解温度40℃，酶解时间42min，纤维素酶用量174U/g，pH值为6.0。
优选的是，所述荸荠多糖的提取方法还包括：所述荸荠粉的制备，具体为选取饱满无病斑的荸荠洗干净、去皮、蒸馏水清洗2遍，切片、60℃烘干、粉碎过60目筛。
优选的是，所述步骤三中，离心的转速为5000r/min，时间为15min。
优选的是，所述步骤五中，所述DEAE-52纤维素柱层析具体包括：
a，溶液配制
0.5％HCL溶液：准确量取20.85ml盐酸，用蒸馏水定容至500ml；
0.5％NaOH溶液：准确称取10gNaOH，用蒸馏水溶解定容至500ml，移到塑料瓶中备用；
Tris-HCL溶液：准确称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
不同NaCL浓度的系列Tris-HCL洗脱液：分别称取0.5852g，1.7556g，2.926g，4.0964g，5.852gNaCL，用Tris-HCL溶液溶解定容到100ml，即得0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl洗脱液；
b，DEAE-纤维素的处理：称量15gDEAE-52阴离子交换剂干粉，用蒸馏水浸泡，去除杂质；再用0.5mol/L的HCL溶液浸泡1h，再用蒸馏水洗至pH值中性，并在抽滤漏斗中将其抽干；再用0.5mol/L的NaOH溶液将抽干的离子交换剂浸泡1h，再用蒸馏水将其洗至中性，抽干，浸泡于pH7.420mmol/LTris-HCL缓冲液中；
c，装柱:将活化后的DEAE-cellulose52离子交换填料装填柱型为2.8cm×50cm层，柱床高度为25cm；
d，平衡:用Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床1个柱床体积；
e，上样:称取步骤四制备的荸荠粗多糖2.5g用10mLTris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上样；
f，洗脱:依次用Tris-HCl液及用Tris-HCl溶液配成的含0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl溶液洗脱，以1mL/min流速洗脱；
g，收集:收集不同梯度荸荠多糖，每个梯度收集10管，每管收集10ml，用苯酚-硫酸法检测跟踪每管洗脱液，找出洗脱峰，合并单一峰，再浓缩至10ml，制得浓缩样品。
优选的是，所述步骤五中，所述SephadexG-25凝胶柱层析具体包括：
洗脱液的制备：称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
凝胶的制备：称取SephadexG-75粉末7g，加蒸馏水50ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3h，冷却至室温静止，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；
装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的蒸馏水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；
平衡：凝胶床用洗脱液平衡，约2个柱体积；
加样：取2ml浓缩样品。先吸去床面上层多余的洗脱液，余2-3mm，关闭柱出口，将样品溶液贴着柱的内壁旋转缓慢加入，打开柱出口，让样品渗入凝胶床内；
洗脱：待液面与床面持平时，先用少量洗脱液冲洗内壁，再用洗脱液以1mL/min流速进行洗脱；
收集：用分部收集器收集洗脱液，每种样品收集20管，每管自动部分收集3.0mL，苯酚-硫酸比色法跟踪检测，合并单一峰，再浓缩至10ml，即得荸荠多糖。
本发明所述荸荠多糖提取方法采用酶解法与超声波相结合的提取工艺，具有反应条件温和、时间短、试剂消耗少等优点，适于工业化大生产。在超声波提取之后使用纤维素酶进行辅助提取，一方面通过降解植物细胞壁使有效成分更易提取从而达到提高提取收率或减低溶剂消耗量；另一方面可以针对植物中的大多数杂质(淀粉、蛋白质等)选择性降解，使浸提液澄清。从而在一定限度防止了酶变的发生，且对人无毒。本发明所述荸荠多糖的提取方法将超声波提取和纤维素酶提取分开进行，能够保证纤维素酶的活性，通过更加温和的反应条件，同时，缩短了提取时间。当超声温度62℃，超声时间21min，超声功率600W，酶解温度40℃，酶解时间42min，纤维素酶用量174U/g，pH值为6.0时，荸荠粗多糖的提取率为4.462％。经过纯化后，荸荠多糖中能够测定出含有35.2％葡萄糖醛酸，4.7％硫酸基。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述荸荠多糖的提取方法的紫外可见光图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
步骤一，一次提取，选取饱满无病斑的荸荠洗干净、去皮、蒸馏水清洗2遍，切片、60℃烘干、粉碎过60目筛，称取荸荠粉100g，按料液重量比1：20加入蒸馏水，在60℃下进行超声波提取，超声时间为30min，超声功率为600w；
步骤二，二次提取，将步骤一制得的溶液降至室温，然后加入纤维素酶进行二次提取，其中酶解温度为40℃，酶解时间为35min，酶用量为150U/g；
步骤三，脱脂，将步骤二制得的溶液加入94％乙醇脱脂，沉淀静置过夜后离心取上清液；离心的转速为5000r/min，时间为15min；
步骤四，将步骤三制得的上清液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，摇匀，静止沉淀30min；倾倒去上清得沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，得到糖液；将制得的糖液,用体积比为25∶5∶1的糖液:氯仿:正丁醇进行萃取,弃去中间层的变性蛋白及下层的有机液，萃取5次，得到去蛋白糖溶液；将去蛋白糖液浓缩,浓缩液先放冰箱中冷冻,再放置真空冷冻干燥，得到荸荠粗多糖；
步骤五，利用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-25凝胶柱层析进行荸荠多糖的纯化制得荸荠多糖。
其中，所述DEAE-52纤维素柱层析具体包括：
a，溶液配制
0.5％HCL溶液：准确量取20.85ml盐酸，用蒸馏水定容至500ml；
0.5％NaOH溶液：准确称取10gNaOH，用蒸馏水溶解定容至500ml，移到塑料瓶中备用；
Tris-HCL溶液：准确称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
不同NaCL浓度的系列Tris-HCL洗脱液：分别称取0.5852g，1.7556g，2.926g，4.0964g，5.852gNaCL，用Tris-HCL溶液溶解定容到100ml，即得0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl洗脱液；
b，DEAE-纤维素的处理：称量15gDEAE-52阴离子交换剂干粉，用蒸馏水浸泡，去除杂质；再用0.5mol/L的HCL溶液浸泡1h，再用蒸馏水洗至pH值中性，并在抽滤漏斗中将其抽干；再用0.5mol/L的NaOH溶液将抽干的离子交换剂浸泡1h，再用蒸馏水将其洗至中性，抽干，浸泡于pH7.420mmol/LTris-HCL缓冲液中；
c，装柱:将活化后的DEAE-cellulose52离子交换填料装填柱型为2.8cm×50cm层，柱床高度为25cm；
d，平衡:用Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床1个柱床体积；
e，上样:称取步骤四制备的荸荠粗多糖2.5g用10mLTris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上样；
f，洗脱:依次用Tris-HCl液及用Tris-HCl溶液配成的含0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl溶液洗脱，以1mL/min流速洗脱；
g，收集:收集不同梯度荸荠多糖，每个梯度收集10管，每管收集10ml，用苯酚-硫酸法检测跟踪每管洗脱液，找出洗脱峰，合并单一峰，再浓缩至10ml，制得浓缩样品。
所述步骤五中，所述SephadexG-25凝胶柱层析具体包括：
洗脱液的制备：称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
凝胶的制备：称取SephadexG-75粉末7g，加蒸馏水50ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3h，冷却至室温静止，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；
装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的蒸馏水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；
平衡：凝胶床用洗脱液平衡，约2个柱体积；
加样：取2ml浓缩样品。先吸去床面上层多余的洗脱液，余2-3mm，关闭柱出口，将样品溶液贴着柱的内壁旋转缓慢加入，打开柱出口，让样品渗入凝胶床内；
洗脱：待液面与床面持平时，先用少量洗脱液冲洗内壁，再用洗脱液以1mL/min流速进行洗脱；
收集：用分部收集器收集洗脱液，每种样品收集20管，每管自动部分收集3.0mL，苯酚-硫酸比色法跟踪检测，合并单一峰，再浓缩至10ml，即得荸荠多糖。
实施例2
步骤一，一次提取，选取饱满无病斑的荸荠洗干净、去皮、蒸馏水清洗2遍，切片、60℃烘干、粉碎过60目筛，称取荸荠粉100g，按料液重量比1：40加入蒸馏水，在70℃下进行超声波提取，超声时间为20min，超声功率为600w；
步骤二，二次提取，将步骤一制得的溶液降至室温，然后加入纤维素酶进行二次提取，其中酶解温度为48℃，酶解时间为45min，酶用量为180U/g；
步骤三，脱脂，将步骤二制得的溶液加入94％乙醇脱脂，沉淀静置过夜后离心取上清液；离心的转速为5000r/min，时间为15min；
步骤四，将步骤三制得的上清液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，摇匀，静止沉淀30min；倾倒去上清得沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，得到糖液；将制得的糖液,用体积比为25∶5∶1的糖液:氯仿:正丁醇进行萃取,弃去中间层的变性蛋白及下层的有机液，萃取5次，得到去蛋白糖溶液；将去蛋白糖液浓缩,浓缩液先放冰箱中冷冻，再放置真空冷冻干燥，得到荸荠粗多糖；
步骤五，利用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-25凝胶柱层析进行荸荠多糖的纯化制得荸荠多糖。
所述DEAE-52纤维素柱层析具体包括：
a，溶液配制
0.5％HCL溶液：准确量取20.85ml盐酸，用蒸馏水定容至500ml；
0.5％NaOH溶液：准确称取10gNaOH，用蒸馏水溶解定容至500ml，移到塑料瓶中备用；
Tris-HCL溶液：准确称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
不同NaCL浓度的系列Tris-HCL洗脱液：分别称取0.5852g，1.7556g，2.926g，4.0964g，5.852gNaCL，用Tris-HCL溶液溶解定容到100ml，即得0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl洗脱液；
b，DEAE-纤维素的处理：称量15gDEAE-52阴离子交换剂干粉，用蒸馏水浸泡，去除杂质；再用0.5mol/L的HCL溶液浸泡1h，再用蒸馏水洗至pH值中性，并在抽滤漏斗中将其抽干；再用0.5mol/L的NaOH溶液将抽干的离子交换剂浸泡1h，再用蒸馏水将其洗至中性，抽干，浸泡于pH7.420mmol/LTris-HCL缓冲液中；
c，装柱:将活化后的DEAE-cellulose52离子交换填料装填柱型为2.8cm×50cm层，柱床高度为25cm；
d，平衡:用Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床1个柱床体积；
e，上样:称取步骤四制备的荸荠粗多糖2.5g用10mLTris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上样；
f，洗脱:依次用Tris-HCl液及用Tris-HCl溶液配成的含0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl溶液洗脱，以1mL/min流速洗脱；
g，收集:收集不同梯度荸荠多糖，每个梯度收集10管，每管收集10ml，用苯酚-硫酸法检测跟踪每管洗脱液，找出洗脱峰，合并单一峰，再浓缩至10ml，制得浓缩样品。
所述步骤五中，所述SephadexG-25凝胶柱层析具体包括：
洗脱液的制备：称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
凝胶的制备：称取SephadexG-75粉末7g，加蒸馏水50ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3h，冷却至室温静止，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；
装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的蒸馏水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；
平衡：凝胶床用洗脱液平衡，约2个柱体积；
加样：取2ml浓缩样品。先吸去床面上层多余的洗脱液，余2-3mm，关闭柱出口，将样品溶液贴着柱的内壁旋转缓慢加入，打开柱出口，让样品渗入凝胶床内；
洗脱：待液面与床面持平时，先用少量洗脱液冲洗内壁，再用洗脱液以1mL/min流速进行洗脱；
收集：用分部收集器收集洗脱液，每种样品收集20管，每管自动部分收集3.0mL，苯酚-硫酸比色法跟踪检测，合并单一峰，再浓缩至10ml，即得荸荠多糖。
实施例3
步骤一，一次提取，选取饱满无病斑的荸荠洗干净、去皮、蒸馏水清洗2遍，切片、60℃烘干、粉碎过60目筛，称取荸荠粉100g，按料液重量比1：40加入蒸馏水，在62℃下进行超声波提取，超声时间为21min，超声功率为600w；
步骤二，二次提取，将步骤一制得的溶液降至室温，然后加入纤维素酶进行二次提取，其中酶解温度为40℃，酶解时间为42min，酶用量为174U/g，pH值为6.0。
步骤三，脱脂，将步骤二制得的溶液加入94％乙醇脱脂，沉淀静置过夜后离心取上清液；离心的转速为5000r/min，时间为15min；
步骤四，将步骤三制得的上清液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，摇匀，静止沉淀30min；倾倒去上清得沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，得到糖液；将制得的糖液,用体积比为25∶5∶1的糖液:氯仿:正丁醇进行萃取,弃去中间层的变性蛋白及下层的有机液，萃取5次，得到去蛋白糖溶液；将去蛋白糖液浓缩,浓缩液先放冰箱中冷冻,再放置真空冷冻干燥，得到荸荠粗多糖；
步骤五，利用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-25凝胶柱层析进行荸荠多糖的纯化制得荸荠多糖。
所述DEAE-52纤维素柱层析具体包括：
a，溶液配制
0.5％HCL溶液：准确量取20.85ml盐酸，用蒸馏水定容至500ml；
0.5％NaOH溶液：准确称取10gNaOH，用蒸馏水溶解定容至500ml，移到塑料瓶中备用；
Tris-HCL溶液：准确称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
不同NaCL浓度的系列Tris-HCL洗脱液：分别称取0.5852g，1.7556g，2.926g，4.0964g，5.852gNaCL，用Tris-HCL溶液溶解定容到100ml，即得0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl洗脱液；
b，DEAE-纤维素的处理：称量15gDEAE-52阴离子交换剂干粉，用蒸馏水浸泡，去除杂质；再用0.5mol/L的HCL溶液浸泡1h，再用蒸馏水洗至pH值中性，并在抽滤漏斗中将其抽干；再用0.5mol/L的NaOH溶液将抽干的离子交换剂浸泡1h，再用蒸馏水将其洗至中性，抽干，浸泡于pH7.420mmol/LTris-HCL缓冲液中；
c，装柱:将活化后的DEAE-cellulose52离子交换填料装填柱型为2.8cm×50cm层，柱床高度为25cm；
d，平衡:用Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床1个柱床体积；
e，上样:称取步骤四制备的荸荠粗多糖2.5g用10mLTris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上样；
f，洗脱:依次用Tris-HCl液及用Tris-HCl溶液配成的含0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl溶液洗脱，以1mL/min流速洗脱；
g，收集:收集不同梯度荸荠多糖，每个梯度收集10管，每管收集10ml，用苯酚-硫酸法检测跟踪每管洗脱液，找出洗脱峰，合并单一峰，再浓缩至10ml，制得浓缩样品。
所述步骤五中，所述SephadexG-25凝胶柱层析具体包括：
洗脱液的制备：称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
凝胶的制备：称取SephadexG-75粉末7g，加蒸馏水50ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3h，冷却至室温静止，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；
装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的蒸馏水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；
平衡：凝胶床用洗脱液平衡，约2个柱体积；
加样：取2ml浓缩样品。先吸去床面上层多余的洗脱液，余2-3mm，关闭柱出口，将样品溶液贴着柱的内壁旋转缓慢加入，打开柱出口，让样品渗入凝胶床内；
洗脱：待液面与床面持平时，先用少量洗脱液冲洗内壁，再用洗脱液以1mL/min流速进行洗脱；
收集：用分部收集器收集洗脱液，每种样品收集20管，每管自动部分收集3.0mL，苯酚-硫酸比色法跟踪检测，合并单一峰，再浓缩至10ml，即得荸荠多糖。
利用苯酚--硫酸法测定荸荠粗多糖含量。将提取液稀释25倍后，取0.5mL稀释液，加1mL苯酚、5mL浓硫酸，100℃恒温水浴15min，取出后自然冷却至室温，在490nm处测吸光度，计算出质量浓度，带入下列公式后计算提取率。
结果见表1
将经过纯化后的荸荠多糖用紫外可见分光光度计对其进行扫描检测，结果见图1.如图1所示，经Sephorose-25凝胶过滤后得到的C-2已基本不含核酸和蛋白质，纯度较高。
用硫酸钡比浊法测各单一组分总硫酸根含量
移取1ml马蹄多糖单一组分于比色管中，加入1mol/L的盐酸溶液4ml于沸水浴中水解2h，冷却，再准确量取0.5mL水解液，以0.5ml1mol/L的盐酸溶液作为空白，加入7.50mL三氯乙酸溶液和2.00mL氯化钡-明胶溶液，摇匀，室温静止15min，于360nm波长处测定吸光度，然后代入标准曲线算出其总硫酸基含量。结果见表2
表2各实施例中荸荠多糖中硫酸基含量
用硫酸-咔唑法测定各单一组分中的葡萄糖醛酸含量
移取1ml马蹄多糖单一组分于比色管中，加4mL浓硫酸，摇匀，沸水浴加热20分钟，冷至室温后加入0.1％的咔唑标准溶液1.0ml，充分搅匀后，置于室温下放置20min；另取1.00ml水同上操作制得空白溶液，于530nm波长处测定吸光度，然后代入标准曲线算出其葡萄糖醛酸含量。结果见表3：
表3各实施例中荸荠多糖中葡萄糖醛酸含量
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.一种荸荠多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，一次提取，称取荸荠粉100g，按料液重量比1：20-40加入蒸馏水，在60-70℃下进行超声波提取，超声时间为20-30min，超声功率为600w；
步骤二，二次提取，将步骤一制得的溶液降至室温，然后加入纤维素酶进行二次提取，其中酶解温度为40-48℃，酶解时间为35-45min，酶用量为150-180U/g；
步骤三，脱脂，将步骤二制得的溶液加入94％乙醇脱脂，沉淀静置过夜后离心取上清液；
步骤四，将步骤三制得的上清液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇浓度达到80％，摇匀，静止沉淀30min；倾倒去上清得沉淀，沉淀用蒸馏水复溶，得到糖液；将制得的糖液,用体积比为25∶5∶1的糖液:氯仿:正丁醇进行萃取,弃去中间层的变性蛋白及下层的有机液，萃取5次，得到去蛋白糖溶液；将去蛋白糖液浓缩,浓缩液先放冰箱中冷冻,再放置真空冷冻干燥，得到荸荠粗多糖；
步骤五，利用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-25凝胶柱层析进行荸荠多糖的纯化制得荸荠多糖。
2.如权利要求1所述的荸荠多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤一中，超声波提取的所述料液重量比为1：40，超声温度为62℃，超声时间为21min，超声功率为600w。
3.如权利要求1所述的荸荠多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤二中，酶解温度40℃，酶解时间42min，纤维素酶用量174U/g，pH值为6.0。
4.如权利要求1所述的荸荠多糖的提取方法，其特征在于，还包括：所述荸荠粉的制备，具体为选取饱满无病斑的荸荠洗干净、去皮、蒸馏水清洗2遍，切片、60℃烘干、粉碎过60目筛。
5.如权利要求1所述的荸荠多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤三中，离心的转速为5000r/min，时间为15min。
6.如权利要求1所述的荸荠多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤五中，所述DEAE-52纤维素柱层析具体包括：
a，溶液配制
0.5％HCL溶液：准确量取20.85ml盐酸，用蒸馏水定容至500ml；
0.5％NaOH溶液：准确称取10gNaOH，用蒸馏水溶解定容至500ml，移到塑料瓶中备用；
Tris-HCL溶液：准确称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
不同NaCL浓度的系列Tris-HCL洗脱液：分别称取0.5852g，1.7556g，2.926g，4.0964g，5.852gNaCL，用Tris-HCL溶液溶解定容到100ml，即得0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl洗脱液；
b，DEAE-纤维素的处理：称量15gDEAE-52阴离子交换剂干粉，用蒸馏水浸泡，去除杂质；再用0.5mol/L的HCL溶液浸泡1h，再用蒸馏水洗至pH值中性，并在抽滤漏斗中将其抽干；再用0.5mol/L的NaOH溶液将抽干的离子交换剂浸泡1h，再用蒸馏水将其洗至中性，抽干，浸泡于pH7.420mmol/LTris-HCL缓冲液中；
c，装柱:将活化后的DEAE-cellulose52离子交换填料装填柱型为2.8cm×50cm层，柱床高度为25cm；
d，平衡:用Tris-HCl液以2.5mL/min流速平衡柱床1个柱床体积；
e，上样:称取步骤四制备的荸荠粗多糖2.5g用10mLTris-HCl溶液溶解，以1mL/min流速上样；
f，洗脱:依次用Tris-HCl液及用Tris-HCl溶液配成的含0.1、0.3、0.5以及1.0mol/LNaCl溶液洗脱，以1mL/min流速洗脱；
g，收集:收集不同梯度荸荠多糖，每个梯度收集10管，每管收集10ml，用苯酚-硫酸法检测跟踪每管洗脱液，找出洗脱峰，合并单一峰，再浓缩至10ml，制得浓缩样品。
7.如权利要求6所述的荸荠多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤五中，所述SephadexG-25凝胶柱层析具体包括：
洗脱液的制备：称取Tris2.422g溶于适量的蒸馏水中，用浓盐酸溶液调节pH值至7.4，再用蒸馏水定容至1000mL；
凝胶的制备：称取SephadexG-75粉末7g，加蒸馏水50ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3h，冷却至室温静止，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；
装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的蒸馏水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；
平衡：凝胶床用洗脱液平衡，约2个柱体积；
加样：取2ml浓缩样品。先吸去床面上层多余的洗脱液，余2-3mm，关闭柱出口，将样品溶液贴着柱的内壁旋转缓慢加入，打开柱出口，让样品渗入凝胶床内；
洗脱：待液面与床面持平时，先用少量洗脱液冲洗内壁，再用洗脱液以1mL/min流速进行洗脱；
收集：用分部收集器收集洗脱液，每种样品收集20管，每管自动部分收集3.0mL，苯酚-硫酸比色法跟踪检测，合并单一峰，再浓缩至10ml，即得荸荠多糖。
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