CN109354601A - 一种梨果实内硒蛋白的提取方法 - Google Patents

一种梨果实内硒蛋白的提取方法 Download PDF

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杨美玲
靳丛
王云鹏
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Abstract

本发明公开了一种梨果肉硒蛋白的提取方法，该方法通过取梨果肉烘干磨粉，采用温和的连续浸提法，具体为采用蒸馏水、NaCl溶液、乙醇和磷酸二氢钠－磷酸二氢钾缓冲液为溶剂依次提取后得到不同溶性的梨果肉硒蛋白。本发明采用较温和的浸提、搅拌提取手段提取梨果肉硒蛋白，回收率高，而采用超声波或机械振摇等提取，回收率较低。依次采用蒸馏水、NaCl溶液、乙醇和磷酸二氢钠－磷酸二氢钾缓冲液为溶剂在温和的提取下提取水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白、酸溶性硒蛋白和碱溶性硒蛋白。具有高效提取硒多糖的方法具有广阔的市场推广价值。

Description

一种梨果实内硒蛋白的提取方法
技术领域
本发明属于植物生理学领域，具体涉及一种梨果实内硒蛋白的提取方法。
背景技术
硒是生物体必须的微量元素,人或动物摄入的硒都直接或间接来自于植物体。硒元素是世界上公认的“抗癌之王”，也是人体不可缺少的微量元素之一。它具有抗氧化作用，由于很多如克山病、动脉粥样硬化、白内障形成等都与活性自由基有关，比如它能与维生素E共同作用，防治氧自由基对细胞膜的攻击性，因此可以补充一定量的硒元素来清除人体内的自由基和胆固醇，预防慢性疾病的发生。
硒被植物吸收后，形成非常复杂的化学形态，分为无机硒和有机硒两大类。无机硒较少，包括硒酸、亚硒酸和其他一些无机形态(如Se2－和HSe－)，且主要以Se(Ⅳ)形式存在。有机硒占硒总量80％以上，由大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物组成；大分子硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等，小分子硒化物包括硒甲基硒半胱氨酸、硒代高胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒肽等。硒代氨基酸是人日常膳食中获取硒的主要来源。
梨的成分有蛋白质、脂肪、糖类和水,其中糖类和蛋白质是梨的两大主要成分。按蛋白溶解性的不同,梨果实内的蛋白质可分为5种类型水溶性蛋白、盐溶性蛋白、酸溶性蛋白、碱溶性谷蛋白和醇溶蛋白。其中水溶性蛋白和弱碱性蛋白为主要成分。硒蛋白中的硒主要以硒代甲硫氨酸存在,要准确检测其中硒含量，必须找到合适的硒蛋白提取方法，提取出硒蛋白。
目前硒蛋白主要提取方法有溶剂提取法、柱分离技术、生物学方法、辅助提取技术等。溶剂提取法由于其高效率和低成本收到广泛推广，但是同时也存在着硒蛋白流失严重的问题，因此，研究一种具有高效提取硒蛋白的方法具有广阔的市场推广价值。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种梨果实内硒蛋白的提取方法，采用不同极性的浸提剂提取梨果实中不同形态硒，其目的比较优化浸提时间，浸提温度对不同形态硒含量的影响，从而在最佳提取条件下对梨果实中的不同形态硒进行定量分析。根据不同浸提剂提取的硒形态不同，研究硒在果实内内的变化分布规律，为富硒梨的开发和规模化生产进一步提供理论支撑。本发明制作工艺简单，操作简便易行，环境友好，所得硒蛋白含量较高。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种梨果实内硒蛋白的提取方法，该方法通过取梨果肉烘干磨粉，然后采用温和的连续浸提法，分别采用蒸馏水、NaCl溶液、乙醇和磷酸二氢钠－磷酸二氢钾缓冲液为溶剂依次提取梨果实内水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白、弱酸溶性硒蛋白和弱碱溶性硒蛋白，最终提取得到梨果肉硒蛋白。
具体的，一种梨果实内硒蛋白的提取方法，包括以下步骤：
前处理：选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料，先用自来水洗净，再用蒸馏水反复冲洗，去除果皮和果核，留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用；
2)水提取：称取步骤1)处理后的干粉，加入双蒸水，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣1，在残渣1中加入一定量水搅拌，重复提取2次，合并3次的上清液，得到水溶性硒蛋白溶液1和残渣2；同时，称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒蛋白溶液2和残渣3；
3)盐提取：在步骤2)水提取后剩余的残渣2中加入NaCl溶液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣4，在残渣4中加入一定量相同浓度的NaCl溶液，重复提取2次，合并3次的上清液得到盐溶性硒蛋白溶液1和残渣5；同时，按照前述的盐提取步骤处理步骤2)中水提取后的残渣3得到盐溶性硒蛋白溶液2和残渣6；
4)醇提取和弱酸提取：在步骤3)盐提取后剩余的残渣5中加入乙醇溶液室温下提取，离心分别得到上清液和沉淀，取离心后的上清液，加一定量的双重蒸馏水，4℃静置过夜，离心，转速同上，取沉淀，冻干，加入乙醇溶液溶解得到醇溶性硒蛋白溶液和残渣7；同时，在步骤3)盐提取后剩余的残渣6中加入pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，搅拌提取，离心后得到上清液和沉淀，在沉淀中加入一定量相同浓度的pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，重复提取2次，合并3次的上清液即得弱酸溶性硒蛋白溶液和残渣8；
5)碱提取：将步骤4)得到的残渣7和残渣8合并，加入pH8.5磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，搅拌提取，离心后得到上清液和残渣，在残渣中分别加入一定量的pH8.5的磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液重复提取2次，合并3次所得提取液，即得弱碱溶性硒蛋白溶液；
6)将步骤2)的水溶性硒蛋白溶液1和水溶性硒蛋白溶液2、步骤3)的盐溶性硒蛋白溶液1和盐溶性硒蛋白溶液2、步骤4)的醇溶性硒蛋白溶液和弱酸溶性硒蛋白溶6)通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩，最后定容，浓缩液即为梨果肉硒蛋白。
其中，所述步骤2)中干粉与双蒸水的料液比为1：8～1:50(w/v)。
其中，所述步骤3)NaCl溶液的浓度为0.2mol/L～0.8mol/L。
其中，所述步骤4)乙醇溶液的体积百分比浓度为60％～80％。
其中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液的浓度为1/15mol/L。
本发明的实验原理：本发明是在蛋白水提液中加入另一种溶剂(如NaCl溶液、醇溶液以及磷酸缓冲液)以改变混合溶剂的极性，使一部分硒蛋白粗提物沉淀析出，从而实现分离。与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低；而且在一定温度、pH值和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此，控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。在室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀，而且伴随着变性。
有益效果：本发明提供的一种梨果实内硒蛋白的提取方法，利用不同极性的浸提剂提取梨果实中不同形态硒含量，采用微波消解结合ICP方法测定不同形态硒的含量，本发明能在最佳提取条件下对梨果实中的不同形态硒进行定量分析。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次实现了硒蛋白在梨果实内的提取与定量分析，确立了梨果实内硒蛋白的最佳提取条件，具有较高的利用价值。
(2)应用本发明的方法，能够准确地知道梨果实内不同形态的硒含量的多少，为其他水果果实内硒形态的分布测定奠定基础。
(3)本发明蛋白质提取率在50％以上，且提取的硒蛋白杂质少，硒多糖含量占总硒含量的75％～88％，均显著高于现有的提取技术。
(4)本发明选择的原材料是市场上最常见的砀山酥梨，提取的是水果中的有机硒蛋白，经济环保，绿色健康。相比无机硒，毒性大大降低，使用安全，吸收效果好。
(5)本发明的方法简便，不使用酶，提取温度范围广，提取效率高。条件温和，生产工艺简单，易于工业推广。
附图说明
图1是本发明的梨果实内硒蛋白的提取流程示意框图；
图2是本发明实施例1的最佳原始数据：砀山酥梨成熟期果肉硒蛋白分布特点附图。
具体实施方式
下面对本发明作更进一步的说明。
实施例1一种梨果肉硒蛋白的提取方法
如图1所示，一种梨果肉硒蛋白的提取方法，包括以下步骤：
1)前处理：选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料，先用自来水洗净，再用蒸馏水反复冲洗，去除果皮和果核，留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用；
2)水提取：称取干粉样品5.0g于三口瓶中，加入40ml纯水于锥形瓶中室温下震荡1h，充分搅拌过后加入离心管在离心机4000r/min离心，离心15min后拿出取上清液和残渣1，在残渣1中加入40ml纯水，再次室温下震荡2次得到上清液和残渣2，合并3次所取得的上清液，即是水溶性硒蛋白提取液1，同时，称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒蛋白提取液2和残渣3；
3)盐溶性蛋白的提取：在提取水溶性硒蛋白后的残渣2中加入40ml的0.5mol/LNaCl溶液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣4，在残渣4中加入40ml的0.5mol/L的NaCl溶液，重复提取2次，合并3次的上清液得到盐溶性硒蛋白溶液1和残渣5；同时，按照前述的盐提取步骤处理步骤2)中水提取后的残渣3得到盐溶性硒蛋白溶液2和残渣6；合并3次所得上清液，即可得盐溶性硒蛋白提取液；
4)醇溶性和弱酸性蛋白提取：在提取的盐溶性蛋白后剩余的残渣5中加入40ml75％乙醇溶液室温下提取，离心分别得到上清液和沉淀，取离心后的上清液，加40ml的双重蒸馏水，4℃静置过夜，离心，转速同上，取沉淀，冻干，加入乙醇溶液溶解得到醇溶性硒蛋白溶液和残渣7；同时，在步骤3)盐提取后剩余的残渣6中加40ml入pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，搅拌提取，离心后得到上清液和沉淀，在沉淀中加入一定量相同浓度的pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，重复提取2次，合并3次的上清液即得弱酸溶性硒蛋白溶液和残渣8；
5)碱溶性蛋白提取：将步骤4)得到的残渣7和残渣8合并，加入40mlpH8.5磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣，再在残渣中分别加入40ml的pH8.5的磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液重复提取2次，合并3次所得提取液，即得弱碱溶性硒蛋白溶液；
6)分别将所提取到的水溶性硒蛋白溶液1和水溶性硒蛋白溶液2、步骤3)的盐溶性硒蛋白溶液1和盐溶性硒蛋白溶液2、步骤4)的醇溶性硒蛋白溶液和弱酸溶性硒蛋白溶6)通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩，最后定容，浓缩液即为梨果肉硒蛋白。
浓缩液微波消解后采用ICP-MS测定样品中的硒含量。具体测定步骤如下：4ml浓缩液中取2ml样品加入消煮管，依次在消煮管中加入硝酸5mL并在记录本上标记好，将消煮液加入对应的50mL容量瓶中(为防止倒出，先在容量瓶上加一个玻璃漏斗)，并用去离子水冲洗消煮管3遍，最后统一定容。用0.45μm水系滤膜，5mL注射器，过滤，滤液备用将定容好的溶液，取大约10mL，转移至10mL离心管中，待测。采用ICP-MS测定样品中的硒含量，以硒标准液浓度(ppb)为横坐标，进样强度为纵坐标，得标准曲线方y＝58.471x－29.006(R2＝1.000)(x：硒标准液浓度(ppb)，y：进样强度)，Se含量(μg·100g-1)＝(100CSe·V)/W其中，CSe：样品消化定容后溶液Se的浓度，μg·L-1；V：样品消化后定容体积，L；W：样品的取样量，g。仪器经过进样强度值计算得到硒浓度，再依据硒含量公式依次测得硒蛋白提取液中硒的含量，在测定的硒蛋白组分中，硒蛋白中硒的含量为0.356mg·kg-1，水溶性硒蛋白硒的含量为0.096mg·kg-1占硒蛋白的28％，盐溶性硒蛋白硒的含量最多为0.108mg·kg-1占硒蛋白的30％，醇溶性硒蛋白硒的含量为0.024mg·kg-1占硒蛋白的6％，弱酸性硒蛋白硒的含量为0.044mg·kg-1占硒蛋白的12％，碱溶性硒蛋白硒的含量为0.04mg·kg-1占硒蛋白的11％。在此实施例中，硒蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测得达总体积的51％，杂质含量14％，硒蛋白提取率达86％。
实施例2一种梨果肉硒蛋白的提取方法
1)前处理：选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料，先用自来水洗净，再用蒸馏水反复冲洗，去除果皮和果核，留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用；
2)水提取：称取干粉样品5.0g于三口瓶中，加入100ml纯水于锥形瓶中室温下震荡1h，充分搅拌过后加入离心管在离心机4000r/min离心，离心15min后拿出取上清液和残渣1，在残渣1中加入100ml纯水，再次室温下震荡2次得到上清液和残渣2，合并3次所取得的上清液，即是水溶性硒蛋白提取液1，同时，称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒蛋白提取液2和残渣3；
3)盐溶性蛋白的提取：在提取水溶性硒蛋白后的残渣2中加入100ml的0.8mol/LNaCl溶液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣4，在残渣4中加入100ml的0.8mol/L的NaCl溶液，重复提取2次，合并3次的上清液得到盐溶性硒蛋白溶液1和残渣5；同时，按照前述的盐提取步骤处理步骤2)中水提取后的残渣3得到盐溶性硒蛋白溶液2和残渣6；合并3次所得上清液，即可得盐溶性硒蛋白提取液；
4)醇溶性和弱酸性蛋白提取：在提取的盐溶性蛋白后剩余的残渣5中加入100ml75％乙醇溶液室温下提取，离心分别得到上清液和沉淀，取离心后的上清液，加100ml的双重蒸馏水，4℃静置过夜，离心，转速同上，取沉淀，冻干，加入乙醇溶液溶解得到醇溶性硒蛋白溶液和残渣7；同时，在步骤3)盐提取后剩余的残渣6中加100ml入pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，搅拌提取，离心后得到上清液和沉淀，在沉淀中加入一定量相同浓度的pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，重复提取2次，合并3次的上清液即得弱酸溶性硒蛋白溶液和残渣8；
5)碱溶性蛋白提取：将步骤4)得到的残渣7和残渣8合并，加入100mlpH8.5磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣，再在残渣中分别加入100ml的pH8.5的磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液重复提取2次，合并3次所得提取液，即得弱碱溶性硒蛋白溶液；
6)分别将所提取到的水溶性硒蛋白溶液1和水溶性硒蛋白溶液2、步骤3)的盐溶性硒蛋白溶液1和盐溶性硒蛋白溶液2、步骤4)的醇溶性硒蛋白溶液和弱酸溶性硒蛋白溶6)通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩，最后定容，浓缩液即为梨果肉硒蛋白。
浓缩液微波消解后采用ICP-MS测定样品中的硒含量。具体测定步骤如下：4ml浓缩液中取2ml样品加入消煮管，依次在消煮管中加入硝酸5mL并在记录本上标记好，将消煮液加入对应的50mL容量瓶中(为防止倒出，先在容量瓶上加一个玻璃漏斗)，并用去离子水冲洗消煮管3遍，最后统一定容。用0.45μm水系滤膜，5mL注射器，过滤，滤液备用将定容好的溶液，取大约10mL，转移至10mL离心管中，待测。采用ICP-MS测定样品中的硒含量，以硒标准液浓度(ppb)为横坐标，进样强度为纵坐标，得标准曲线方y＝58.471x－29.006(R2＝1.000)(x：硒标准液浓度(ppb)，y：进样强度)，Se含量(μg·100g-1)＝(100CSe·V)/W其中，CSe：样品消化定容后溶液Se的浓度，μg·L-1；V：样品消化后定容体积，L；W：样品的取样量，g。仪器经过进样强度值计算得到硒浓度，再依据硒含量公式依次测得硒蛋白提取液中硒的含量，在测定的硒蛋白组分中，硒蛋白中硒的含量为0.356mg·kg-1，水溶性硒蛋白硒的含量为0.088mg·kg-1占硒蛋白的24％，盐溶性硒蛋白硒的含量最多为0.102mg·kg-1占硒蛋白的28％，醇溶性硒蛋白硒的含量为0.018mg·kg-1占硒蛋白的5％，弱酸性硒蛋白硒的含量为0.046mg·kg-1占硒蛋白的13％，碱溶性硒蛋白硒的含量为0.036mg·kg-1占硒蛋白的10％。在此实施例中，硒蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测得达总体积的51％，杂质含量20％，硒蛋白提取率达80％。
实施例3一种梨果肉硒蛋白的提取方法
1)前处理：选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料，先用自来水洗净，再用蒸馏水反复冲洗，去除果皮和果核，留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用；
2)水提取：称取干粉样品5.0g于三口瓶中，加入60ml纯水于锥形瓶中室温下震荡1h，充分搅拌过后加入离心管在离心机4000r/min离心，离心15min后拿出取上清液和残渣1，在残渣1中加入60ml纯水，再次室温下震荡2次得到上清液和残渣2，合并3次所取得的上清液，即是水溶性硒蛋白提取液1，同时，称取等量的步骤1)处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒蛋白提取液2和残渣3；
3)盐溶性蛋白的提取：在提取水溶性硒蛋白后的残渣2中加入60ml的0.5mol/LNaCl溶液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣4，在残渣4中加入60ml的0.5mol/L的NaCl溶液，重复提取2次，合并3次的上清液得到盐溶性硒蛋白溶液1和残渣5；同时，按照前述的盐提取步骤处理步骤2)中水提取后的残渣3得到盐溶性硒蛋白溶液2和残渣6；合并3次所得上清液，即可得盐溶性硒蛋白提取液；
4)醇溶性和弱酸性蛋白提取：在提取的盐溶性蛋白后剩余的残渣5中加入60ml75％乙醇溶液室温下提取，离心分别得到上清液和沉淀，取离心后的上清液，加60ml的双重蒸馏水，4℃静置过夜，离心，转速同上，取沉淀，冻干，加入乙醇溶液溶解得到醇溶性硒蛋白溶液和残渣7；同时，在步骤3)盐提取后剩余的残渣6中加60ml入pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，搅拌提取，离心后得到上清液和沉淀，在沉淀中加入一定量相同浓度的pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，重复提取2次，合并3次的上清液即得弱酸溶性硒蛋白溶液和残渣8；
5)碱溶性蛋白提取：将步骤4)得到的残渣7和残渣8合并，加入60mlpH8.5磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣，再在残渣中分别加入60ml的pH8.5的磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液重复提取2次，合并3次所得提取液，即得弱碱溶性硒蛋白溶液；
6)分别将所提取到的水溶性硒蛋白溶液1和水溶性硒蛋白溶液2、步骤3)的盐溶性硒蛋白溶液1和盐溶性硒蛋白溶液2、步骤4)的醇溶性硒蛋白溶液和弱酸溶性硒蛋白溶6)通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩，最后定容，浓缩液即为梨果肉硒蛋白。
浓缩液微波消解后采用ICP-MS测定样品中的硒含量。具体测定步骤如下：4ml浓缩液中取2ml样品加入消煮管，依次在消煮管中加入硝酸5mL并在记录本上标记好，将消煮液加入对应的50mL容量瓶中(为防止倒出，先在容量瓶上加一个玻璃漏斗)，并用去离子水冲洗消煮管3遍，最后统一定容。用0.45μm水系滤膜，5mL注射器，过滤，滤液备用将定容好的溶液，取大约10mL，转移至10mL离心管中，待测。采用ICP-MS测定样品中的硒含量，以硒标准液浓度(ppb)为横坐标，进样强度为纵坐标，得标准曲线方y＝58.471x－29.006(R2＝1.000)(x：硒标准液浓度(ppb)，y：进样强度)，Se含量(μg·100g-1)＝(100CSe·V)/W其中，CSe：样品消化定容后溶液Se的浓度，μg·L-1；V：样品消化后定容体积，L；W：样品的取样量，g。仪器经过进样强度值计算得到硒浓度，再依据硒含量公式依次测得硒蛋白提取液中硒的含量，在测定的硒蛋白组分中，硒蛋白中硒的含量为0.356mg·kg-1，水溶性硒蛋白硒的含量为0.092mg·kg-1占硒蛋白的25％，盐溶性硒蛋白硒的含量最多为0.103mg·kg-1占硒蛋白的29％，醇溶性硒蛋白硒的含量为0.020mg·kg-1占硒蛋白的5％，弱酸性硒蛋白硒的含量为0.041mg·kg-1占硒蛋白的12％，碱溶性硒蛋白硒的含量为0.035mg·kg-1占硒蛋白的10％，。在此实施例中，硒蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250试剂结合法测得达总体积的51％，杂质含量19％，硒蛋白提取率达81％。
表1
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种梨果实内硒蛋白的提取方法，其特征在于，该方法通过取梨果肉烘干磨粉然后采用温和的连续浸提法，分别采用蒸馏水、NaCl溶液、乙醇和磷酸二氢钠－磷酸二氢钾缓冲液为溶剂依次提取梨果实内水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白、弱酸溶性硒蛋白和弱碱溶性硒蛋白，最终提取得到梨果肉硒蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种梨果实内硒蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）前处理：选取果实大小均匀的砀山酥梨为试验材料，先用自来水洗净，再用蒸馏水反复冲洗，去除果皮和果核，留取果肉切碎烘干并用粉碎机打磨成干粉备用；
2）水提取：称取步骤1）处理后的干粉，加入双蒸水，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣1，在残渣1中加入双蒸水搅拌，重复提取2次，合并3次的上清液，得到水溶性硒蛋白溶液1和残渣2；同时，称取等量的步骤1）处理后的干粉重复前述的水提取步骤得到水溶性硒蛋白溶液2和残渣3；
3）盐提取：在步骤2）水提取后剩余的残渣2中加入NaCl溶液，室温下搅拌提取，离心后得到上清液和残渣4，在残渣4中加入NaCl溶液，重复提取2次，合并3次的上清液得到盐溶性硒蛋白溶液1和残渣5；同时，按照前述的盐提取步骤处理步骤2）中水提取后的残渣3得到盐溶性硒蛋白溶液2和残渣6；
4）醇提取和弱酸提取：在步骤3）盐提取后剩余的残渣5中加入乙醇溶液室温下提取，离心分别得到上清液和沉淀，取离心后的上清液，加双重蒸馏水，4℃静置过夜，离心，转速同上，取沉淀，冻干，加入乙醇溶液溶解得到醇溶性硒蛋白溶液和残渣7；同时，在步骤3）盐提取后剩余的残渣6中加入pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，搅拌提取，离心后得到上清液和沉淀，在沉淀中加入一定量相同浓度的pH6.0磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，重复提取2次，合并3次的上清液即得弱酸溶性硒蛋白溶液和残渣8；
5）碱提取：将步骤4）得到的残渣7和残渣8合并，加入pH8.5磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液，搅拌提取，离心后得到上清液和残渣，在残渣中分别加入pH8.5的磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液重复提取2次，合并3次所得提取液，即得弱碱溶性硒蛋白溶液；
6）将步骤2）的水溶性硒蛋白溶液1和水溶性硒蛋白溶液2、步骤3）的盐溶性硒蛋白溶液1和盐溶性硒蛋白溶液2、步骤4）的醇溶性硒蛋白溶液和弱酸溶性硒蛋白溶液、步骤5）的弱碱溶性硒蛋白溶液通过旋转蒸发仪蒸馏浓缩，最后定容，浓缩液即为梨果肉硒蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种梨果实内硒蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤2）中干粉与双蒸水的料液比为1：8~1:50。
4.根据权利要求1所述的一种梨果实内硒蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤3）NaCl溶液的浓度为0.2mol/L~0.8mol/L。
5.根据权利要求1所述的一种梨果实内硒蛋白的提取方法，其特征在于，所述步骤4）乙醇溶液的体积百分比浓度为60%~80%。
6.根据权利要求1所述的一种梨果实内硒蛋白的提取方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钾缓冲液的浓度为1/15mol/L。
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