CN106620067A - 一种提取菠萝皮黄酮类化合物的方法 - Google Patents
一种提取菠萝皮黄酮类化合物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于黄酮类化合物的提取方法领域,涉及一种提取菠萝皮中黄酮类化合物的方法。本发明的黄酮类化合物的提取方法包括:以菠萝皮为原料,首先将菠萝皮干燥,干燥后粉碎处理,过60~80目的筛子;然后用纤维素酶解和超声波浸提,将浸提液浓缩干燥制成粗提物;将粗提物与乙酸锌盐溶液络合反应,反应结束后,用EDTA进行解络合反应;最后旋转蒸干、过滤、用清洗液清洗得到纯化后的黄酮类化合物。本发明的提取方法具有减少资源浪费、降低环境压力、操作简单、时间短、提取率高、成本低、节约能耗、保证黄酮类化合物生物活性的优点,可广泛应用于黄酮类化合物的工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种黄酮类化合物的提取方法,尤其是一种提取菠萝皮中黄酮类化合物的方法。
背景技术
黄酮类化合物广泛存在于自然界中,具有防治高血压、血管硬化以及抗自由基、降低血清胆固醇等作用。人体不能合成,在体内代谢很快,所以寻找一种简单,高效,环保的提取方法成为了研究的焦点。目前,黄酮类化合物的提取方法主要采用热水提取、碱液提取、系统溶剂提取、超声提取技术等。热水提取,可以采用浸提和煮提,水的极性较大,易将蛋白质、糖类等溶于水的成分浸提,从而使提取液存放时易腐败变质,为后续分离带来困难。碱液提取,黄酮类化合物分子中多有酚羟基,显酸性,故可用碱提,但是碱的浓度难以控制,碱的浓度高提取率高,但是强碱条件下一旦加热会破坏黄酮类化合物的母核,活性下降。系统溶剂提取,采用极性由小到大的溶剂依次提取,可以提取出大多数游离的黄酮类化合物,但是此种方法仅限用于实验室,很难工业化生产。超声提取技术提取黄酮类物质不受成分极性和分子量大小因素的限制,同时操作简单,所提取料液杂质少,有效成分容易分离和纯化。
菠萝其色香味及营养价值佳,据报道菠萝皮渣含有的营养成分与果肉的基本成分相接近。菠萝的加工产品主要是糖水菠萝罐头,在加工过程中有50%~60%的菠萝皮未被利用,这些资源的浪费也给环境带来了压力。基于此,对菠萝皮的研究也有初试成果,如菠萝皮发酵乳酸饮料的制作;菠萝果酒、白兰地、果醋、果冻制造,产沼气、乙醇、柠檬酸,作为饲料;测定菠萝皮中总糖、总酸、酶活性;还有从菠萝皮中提取天然色素等。但是,菠萝皮中含有大量的黄酮类物质,至今的利用率还不高。
发明内容
基于以上提取方法的不足,本发明的目的是提供一种菠萝皮中黄酮类化合物的提取方法,利用来源丰富且未得到充分利用的菠萝皮作为原料,通过纤维素酶解、超声提取技术和络合反应相结合的方法提取黄酮类化合物。该方法有利于对菠萝皮的综合利用以减少资源浪费和降低环境压力,同时拓宽了黄酮类物质的来源。
本发明的目的是通过采用以下技术方案来实现的:
一种菠萝皮黄酮类化合物的提取方法,该方法包括如下步骤:
a)将菠萝皮渣经水洗后加热恒温干燥;
b)将干燥后的菠萝皮渣通过植物粉碎机粉碎,过筛制成菠萝皮粉末;
c)在菠萝皮粉末中加入水和纤维素酶进行酶解反应,反应结束后,加入乙醇至终浓度为60~90%(v/v),进行超声波浸提,浸提后得到浸提液;
d)将浸提液浓缩、干燥,制成粗提物;
e)将粗提物用乙醇溶解,制成浓度为10~20mg/mL的溶液,搅拌同时加入乙酸锌盐溶液,调节溶液的pH值为8~10,进行络合反应,反应结束后得到金属络合物沉淀;
f)将络合物沉淀溶解于乙醇中,加入EDTA进行解络合反应,震荡反应至沉淀完全溶解,冷却至室温,旋转蒸干,用甲醇溶解过滤,得到滤液;
g)将滤液浓缩、干燥得到黄酮类化合物粗品;
h)将得到的黄酮类化合物粗品用清洗液进行清洗,最终得到纯化的黄酮类化合物。
优选地,上述提取菠萝皮中黄酮类化合物的方法,所述的步骤(b)中粉末过筛为60~80目。
优选地,上述提取菠萝皮中黄酮类化合物的方法,所述的步骤(c)中酶解时间为1~3h,所述的酶解温度为25~35℃,所述的超声波浸提为250W,常温浸提30~60min,50~60℃浸提3~4h。
优选地,上述提取菠萝皮中黄酮类化合物的方法,所述的步骤(e)中乙醇浓度为70~75%(v/v),所述的乙酸锌盐溶液浓度为5mg/mL,所述的络合反应条件为络合反应温度50~60℃,反应时间30~60min。
优选地,上述提取菠萝皮中黄酮类化合物的方法,所述的步骤(f)中乙醇浓度为30~35%(v/v),所述的EDTA加入终浓度为15~40mg/mL,所述的解络合反应温度为55~65℃。
优选地,上述提取菠萝皮中黄酮类化合物的方法,所述的步骤(h)中清洗液浓度为20%(v/v)的乙醇丙酮水溶液,其中乙醇和丙酮的体积比为2:1。
相对于现有技术,本发明的有益效果是:
1.减少资源浪费和降低环境压力。菠萝皮中含有大量的黄酮类化合物,采用废弃的菠萝皮为原料避免废弃物对环境的污染,同时开辟了菠萝皮综合利用的新途径。
2.提取过程操作简单、时间短、纯度高。采用乙醇溶解、生物酶酶解和络合反应、解络合反应操作简单,时间短;100g菠萝皮粉末提取黄酮类化合物的质量百分比含量为58%。
3.成本低、节约能耗、保证黄酮类化合物的生物活性。采用来源广泛且废弃的菠萝皮作为原料,大大降低了成本;溶剂乙醇和生物酶均可回收,再次利用,工艺过程温度低,节约能耗;酶解、超声、提取过程pH为8~10,不会导致变性,保证黄酮类化合物的生物活性。
附图说明
图1为本发明菠萝皮中黄酮类化合物的提取工艺流程示意图。
图2为不同摩尔浓度黄酮类化合物、Vc和BHT清除DPPH活性示意图。
具体实施方式
下面将结合附图与具体实施方式对本发明作出进一步详细的说明。如图1所示,首先将菠萝皮渣经水洗后加热恒温干燥,然后用植物粉碎机粉碎过60~80目筛收集粉末;取一定量的粉末加入水和纤维素酶进行酶解,酶解1~3h后,加入乙醇至终浓度为60~90%(v/v),进行超声波浸提,浸提3~4h后,将浸提液浓缩、干燥,制成粗提物。将制成的粗提物用浓度为70~75%(v/v)的乙醇溶解,制成浓度为10~20mg/mL的溶液,在搅拌条件下加入乙酸锌盐溶液,调节溶液的pH值为8~10,进行络合反应,络合反应温度为50~60℃,络合反应时间为30~60min,反应结束后收集金属络合物沉淀;将所得金属络合沉淀物溶解于浓度为30~35%(v/v)的乙醇中,加入EDTA进行解络合反应,EDTA加入终浓度为15~40mg/mL,解络合反应温度为55~65℃,振荡反应至沉淀完全溶解,冷却至室温,旋转蒸干,用甲醇溶解过滤,将滤液浓缩、干燥得到黄酮类化合物粗品。将制得的黄酮类化合物粗品用浓度为20%(v/v)的清洗液清洗,清洗液由无水乙醇和丙酮配制,其中无水乙醇与丙酮的体积比为2:1,旋转蒸干得到纯化的黄酮类化合物。将得到的纯化后的黄酮类化合物进行抗氧化活性的研究,对比其与Vc和BHT的抗氧化活性强弱。
实施例1本发明化合物的提取方法
首先取菠萝皮渣经水洗后加热恒温干燥,然后用植物粉碎机粉碎过60目筛收集粉末,取100g菠萝皮粉末,加入300mL的水,再加入纤维素酶在30℃进行酶解,酶解2h后,加入乙醇至终浓度为70%(v/v),进行功率为250W的超声波浸提30min,再置于50℃水浴条件下超声浸提4h;将浸提液浓缩、干燥,制成粗提物。将粗提物用70%(v/v)乙醇溶液配制成浓度为15mg/mL的溶液,用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为5mg/mL的乙酸锌盐溶液100mL,设置络合反应温度为55℃,用10%NaOH将溶液pH值调为8,反应60min后,收集沉淀,该沉淀即为黄酮-金属络合物;将金属络合物均匀分散溶解于浓度为30%(v/v)的乙醇溶液中,加入EDTA使溶液中EDTA浓度达到40mg/mL,设置解络合反应温度为65℃,振荡反应至沉淀完全溶解,冷却至室温,旋转蒸干,用甲醇溶解过滤,将滤液浓缩、干燥得到黄酮类化合物粗品。将制得的黄酮类化合物粗品用浓度为20%(v/v)的清洗液清洗,清洗液由无水乙醇和丙酮配制,其中无水乙醇与丙酮的体积比为2:1,旋转蒸干得到纯化的黄酮类化合物。
测定:采用紫外‐可见光谱法,以芦丁作为标准对照品,绘制标准曲线,以亚硝酸钠-硝酸铝显色于500nm处测得总黄酮的吸光度。
(1)芦丁标准溶液的制备
取芦丁对照品约20mg,精密称定,置于100mL容量瓶中,加60%(v/v)乙醇适量,超声处理使之溶解,放置至室温,加60%(v/v)乙醇至刻度,摇匀,即得芦丁对照品储备液。
(2)标准曲线的制作
分别精密量取芦丁对照品储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0mL置于25mL容量瓶中,用30%(v/v)乙醇补足至6mL,加5%NaNO2 1mL,静置6min,然后加入10%AlNO3 1mL,静置6min,最后加入4%NaOH 10mL,30%(v/v)乙醇定容后静置15min,并在500nm下测定吸光度,以芦丁对照品溶液浓度(x,mg/mL)为横坐标,吸光度(y)为纵坐标绘制标准曲线,得到线性回归方程:y=k1x+b1。
(3)供试品溶液的制备
取本品约100mg,精密称定,置25mL容量瓶中,加60%(v/v)乙醇适量,超声处理使之溶解,放置至室温,加60%(v/v)乙醇至25mL,摇匀,即得置于25mL供试品储备液。
(4)测定方法
精密量取2mL供试品储备液,置25mL容量瓶中,照标准曲线制备的方法,自“用30%(v/v)乙醇补足至6mL”起依次测定,吸光度记为A1。
(5)黄酮含量的计算
具体公式如下:
式中A1为亚硝酸钠-硝酸铝显色法测得的总黄酮吸光度值,控制在0.2~0.8范围内,如果吸光度超过此范围,则可通过稀释样品溶液来控制,n为样品溶液的稀释倍数。K1和b1分别为AlCl3显色法标准曲线的斜率和截距,W为样品中黄酮的质量分数(%),m为样品的称样量(mg)。
按照上述检测方法对最终制得的黄酮类化合物进行测定,结果表明本次实验得到的黄酮类化合物的质量百分比含量为58%。
实施例2本发明化合物的提取方法
首先取菠萝皮渣经水洗后加热恒温干燥,然后用植物粉碎机粉碎过80目筛收集粉末,取100g菠萝皮粉末,加入300mL的水,再加入纤维素酶在30℃进行酶解,酶解3h后,加入乙醇至终浓度为60%(v/v),进行功率为250W的超声波浸提30min,再置于50℃水浴条件下超声浸提4h;将浸提液浓缩、干燥,制成粗提物。将粗提物用70%(v/v)乙醇溶液配制成浓度为10mg/mL的溶液,用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为5mg/mL的乙酸锌盐溶液100mL,设置络合反应温度为60℃,用10%NaOH将溶液pH值调为10,反应35min后,收集沉淀,该沉淀即为黄酮-金属络合物;将金属络合物均匀分散溶解于浓度为35%(v/v)的乙醇溶液中,加入EDTA使溶液中EDTA浓度达到30mg/mL,设置解络合反应温度为60℃,振荡反应至沉淀完全溶解,冷却至室温,旋转蒸干,用甲醇溶解过滤,将滤液浓缩、干燥得到黄酮类化合物粗品。将制得的黄酮类化合物粗品用浓度为20%(v/v)的清洗液清洗,清洗液由无水乙醇和丙酮配制,其中无水乙醇与丙酮的体积比为2:1,旋转蒸干得到纯化的黄酮类化合物。
采用与实施例1相同的检测方法对最终制得的黄酮类化合物进行测定,结果表明本次实验得到的黄酮类化合物的质量百分比含量为56%。
实施例3本发明化合物的提取方法
首先取菠萝皮渣经水洗后加热恒温干燥,然后用植物粉碎机粉碎过70目筛收集粉末,取100g菠萝皮粉末,加入300mL的水,再加入纤维素酶在30℃进行酶解,酶解1h后,加入乙醇至终浓度为75%(v/v),进行功率为250W的超声波浸提30min,再置于50℃水浴条件下超声浸提3.5h;将浸提液浓缩、干燥,制成粗提物。将粗提物用75%(v/v)乙醇溶液配制成浓度为15mg/mL的溶液,用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为5mg/mL的乙酸锌盐溶液100mL,设置络合反应温度为50℃,用10%NaOH将溶液pH值调为9,反应45min后,收集沉淀,该沉淀即为黄酮-金属络合物;将金属络合物均匀分散溶解于浓度为30%(v/v)的乙醇溶液中,加入EDTA使溶液中EDTA浓度达到15mg/mL,设置解络合反应温度为55℃,振荡反应至沉淀完全溶解,冷却至室温,旋转蒸干,用甲醇溶解过滤,将滤液浓缩、干燥得到黄酮类化合物粗品。将制得的黄酮类化合物粗品用浓度为20%(v/v)的清洗液清洗,清洗液由无水乙醇和丙酮配制,其中无水乙醇与丙酮的体积比为2:1,旋转蒸干得到纯化的黄酮类化合物。
采用与实施例1相同的检测方法对最终制得的黄酮类化合物进行测定,结果表明本次实验得到的黄酮类化合物的质量百分比含量为53%。
实施例4本发明化合物的提取方法
首先取菠萝皮渣经水洗后加热恒温干燥,然后用植物粉碎机粉碎过60目筛收集粉末,取100g菠萝皮粉末,加入300mL的水,再加入纤维素酶在30℃进行酶解,酶解1h后,加入乙醇至终浓度为90%(v/v),进行功率为250W的超声波浸提30min,再置于50℃水浴条件下超声浸提3h;将浸提液浓缩、干燥,制成粗提物。将粗提物用75%(v/v)乙醇溶液配制成浓度为20mg/mL的溶液,用磁力搅拌器边搅拌边加入浓度为5mg/mL的乙酸锌盐溶液100mL,设置络合反应温度为55℃,用10%NaOH将溶液pH值调为8,反应30min后,收集沉淀,该沉淀即为黄酮-金属络合物;将金属络合物均匀分散溶解于浓度为35%(v/v)的乙醇溶液中,加入EDTA使溶液中EDTA浓度达到27.5mg/mL,设置解络合反应温度为65℃,振荡反应至沉淀完全溶解,冷却至室温,旋转蒸干,用甲醇溶解过滤,将滤液浓缩、干燥得到黄酮类化合物粗品。将制得的黄酮类化合物粗品用浓度为20%(v/v)的清洗液清洗,清洗液由无水乙醇和丙酮配制,其中无水乙醇与丙酮的体积比为2:1,旋转蒸干得到纯化的黄酮类化合物。
采用与实施例1相同的检测方法对最终制得的黄酮类化合物进行测定,结果表明本次实验得到的黄酮类化合物的质量百分比含量为57%。
实施例5本发明化合物抗氧化活性研究
将通过上述方法提取的黄酮类化合物进行抗氧化活性实验。具体实验步骤如下:
精密称取DPPH粉末14.6mg,加入无水乙醇定容至50mL容量瓶中,得DPPH储备液。将储备液再稀释10倍,得浓度为0.074mmol/L、吸光度约为0.7的DPPH工作液。
精密称取上述实施例1提取的黄酮类化合物样品粉末适量,加水配制成0.32mmol/L储备液,测定时用水稀释成0.16mmol/L、0.08mmol/L、0.04mmol/L、0.02mmol/L、0.005mmol/L。
吸取样品溶液0.4mL,不同样品浓度溶液和2.6mLDPPH工作液于比色管中,避光反应1h后,于517nm处测定吸光度值。以水代替样品溶液作为空白,以无水乙醇代替样品和DPPH溶液作为空白对照,以相同浓度的Vc和BHT为阳性对照,清除率按下式计算。
式中As为空白,即70%(v/v)乙醇加DPPH溶液的吸光度;Ai为不同浓度样品溶液和DPPH溶液的吸光度;A0为空白对照的吸光度。
样品与阳性对照物Vc和BHT对DPPH的清除率见图2。
结果显示,本文提取的黄酮类化合物清除自由基的能力要强于Vc和BHT,具有很好的抗氧化活性。
上述参照具体实施方式对该一种提取菠萝皮黄酮类化合物的方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种菠萝皮黄酮类化合物的提取方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
a)将菠萝皮渣经水洗后加热恒温干燥;
b)将干燥后的菠萝皮渣通过植物粉碎机粉碎,过筛制成菠萝皮粉末;
c)在菠萝皮粉末中加入水和纤维素酶进行酶解反应,反应结束后,加入乙醇至终浓度为60~90%(v/v),进行超声波浸提,浸提后得到浸提液;
d)将浸提液浓缩、干燥,制成粗提物;
e)将粗提物用乙醇溶解,制成浓度为10~20mg/mL的溶液,搅拌同时加入乙酸锌盐溶液,调节溶液的pH值为8~10,进行络合反应,反应结束后得到金属络合物沉淀;
f)将络合物沉淀溶解于乙醇中,加入EDTA进行解络合反应,震荡反应至沉淀完全溶解,冷却至室温,旋转蒸干,用甲醇溶解过滤,得到滤液;
g)将滤液浓缩、干燥得到黄酮类化合物粗品;
h)将得到的黄酮类化合物粗品用清洗液进行清洗,最终得到纯化的黄酮类化合物。
2.根据权利要求1所述的一种菠萝皮黄酮类化合物的提取方法,其特征在于所述的步骤(b)中粉末过筛为60~80目。
3.根据权利要求1所述的一种菠萝皮黄酮类化合物的提取方法,其特征在于所述的步骤(c)中酶解时间为1~3h,所述的酶解温度为25~35℃,所述的超声波浸提为250W,常温浸提30~60min,50~60℃浸提3~4h。
4.根据权利要求1所述的一种菠萝皮黄酮类化合物的提取方法,其特征在于所述的步骤(e)中乙醇浓度为70~75%(v/v),乙酸锌盐溶液浓度为5mg/mL,所述的络合反应条件为络合反应温度50~60℃,反应时间30~60min。
5.根据权利要求1所述的一种菠萝皮黄酮类化合物的提取方法,其特征在于所述的步骤(f)中乙醇浓度为30~35%(v/v),所述的EDTA加入终浓度为15~40mg/mL,所述的解络合反应温度为55~65℃。
6.根据权利要求1所述的一种菠萝皮黄酮类化合物的提取方法,其特征在于所述的步骤(h)中清洗液浓度为20%(v/v)的乙醇丙酮水溶液,其中乙醇和丙酮的体积比为2:1。
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