CN107309438A - 一种余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，属于纳米材料技术领域，所述的方法包括余甘多糖的制备和纳米银制备。本发明制备的复合粒子抑菌实验测得抑菌圈直径大小为27.9±0.01mm，理论值与试验值基本吻合，说明利用响应面优化法制备的AgNPs制备工艺绿色可靠。

Description

一种余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法

技术领域

本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法。

背景技术

纳米材料由于颗粒尺寸小，比表面积大，表面能高，表面原子所占比例大，因此，表现出特有的表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应三大效应，所以粒子具有很好地抗菌活性。因此纳米银的研究受到越来越多科研工作者的关注和青睐,特别是其中的银纳米粒子被证明对细菌、病毒以及其它原核生物有明显的抑制作用。化学合成法是合成纳米银最常用的方法，该方法条件简单、成本低、产量大、纳米粒可控、操作简便，因而得到广泛使用。化学合成常用的化学还原剂有柠檬酸、硼氢化物以及其他有机化合物。这些有机无机的还原剂可能会带来环境污染或者具有生物毒性。此外，在合成过程中，为了避免银纳米粒子的团聚，常常还需要加入分散剂来降低纳米粒子的表面活性，这也带来了环境污染问题，同时也影响了合成的纳米粒子的使用性能。

随着社会对于环境问题的重视，可持续发展逐渐提到日程上，因此绿色化学的概念被提出，人们期待利用更加环保、更加绿色的合成方法来合成纳米银。近年来，人们提出了一种新的绿色方法合成纳米银——多糖为还原剂和稳定剂制备纳米银粒子。

余甘(Phyllanthus emblica)是大戟科叶下珠属的落叶果树，果实属于药食两用水果。而余甘多糖是余甘中有效的活性成分之一，有研究表明，余甘中多糖提取得率约为10.33％。多糖中含有较多的羧基和羟基，可以作为合成纳米银的还原剂，同时对生成的纳米银起到稳定作用。

多糖(polysaccharide)是除核酸、蛋白质、脂类之外的第四类重要的生物大分子。多糖的研究是四种生物大分子的研究中起步最晚的，但是近年来其在生物医药、食品生产、化妆品等方面的应用不断被人们挖掘出来，因此越来越多的科研工作者从事天然多糖的研究。余甘多糖是一种原料来源广泛的植物活性多糖，具有极高的生物可降解性和生物安全性。而余甘提取液中含有大量的多糖，采用余甘多糖制备纳米银复合粒子，将为多糖的高值化利用及开发多糖－纳米金属复合材料提供基础。同时通过本技术制备纳米银过程绿色、环保，无需添加稳定剂这是在纳米银制备上的一个很大的改进。

发明内容

纳米银的制备受多种因素影响，其中AgNO₃与多糖体积比例、紫外照射时间、NaCl体积这三因素不仅会影响纳米银生成的形状及粒径大小，而且在各因素的互作下会影响生成纳米银的抑菌性。本文用天然产物余甘多糖作为还原剂绿色合成纳米银，来探讨各因素如何影响纳米银制备以及纳米银的抑菌效果，并利用响应面分析的方法来优化纳米银的制备工艺。

为了优化绿色合成的余甘多糖制备纳米银复合粒子的制备，以余甘多糖为还原剂和稳定剂，将AgNO₃中的Ag⁺还原为纳米级别的银单质。以AgNPs对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为响应值，研究AgNO₃与多糖体积比、NaCl体积、紫外照射时间对AgNPs制备工艺的影响，根据Box-Benhnken中心组合试验的原理采用三因素三水平的分析方法确定最佳工艺。本发明的目的是提供一种余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法。

本发明采取的技术方案是：

本发明的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法的具体步骤如下： (1)余甘多糖的制备：

首先选新鲜无病害的余甘果实，洗净、晾干、去核、冻干、过筛得到余甘粉末，热水浸提离心取上清液得到余甘提取液，在经旋蒸浓缩，乙醇脱水、乙醚反复干燥得到余甘粗多糖，最后经冻融分级、 Sevage法除蛋白、透析、旋蒸浓缩冻干制得余甘多糖；

(2)纳米银制备：

称取AgNO₃、多糖、NaCl分别配成溶液；将AgNO₃溶液、多糖溶液和NaCl溶液混合，将混合后的溶液加入氨水调节pH为7-10；室温下把混合液置于磁力搅拌器上搅拌，并用紫外线照射辅助生成 AgNPs；反应完成后，反复离心收集沉淀，将沉淀进行水洗，再次反复离心直到上清液变澄清，去除澄清液得到棕褐色沉淀，沉淀部分冻干后置于-4℃冰箱备用。

步骤(1)中，过40目筛。

步骤(1)中，沸水浸提5小时。

步骤(2)中，将AgNO₃、多糖、NaCl分别配成0.03-0.07mol/L、0.5-1.5mg/mL、0.5-1.5mg/L的溶液，混合液中三者的体积比是1-3：1： 1-2。

作为优选的技术方案之一：将AgNO₃、多糖、NaCl分别配成 0.05mol/L、1mg/mL、1mg/L的溶液，混合液中三者的体积比是2.09： 1：1.57。

作为优选的技术方案之二：将AgNO₃、多糖、NaCl分别配成 0.05mol/L、1mg/mL、1mg/L的溶液，混合液中三者的体积比是2：1： 1.5。

步骤(2)中，优选加入氨水调节pH为8.7。

步骤(2)中，紫外线波长365nm，照射时间为1h。

本发明的积极效果如下：

第一，余甘子由于口感不佳作为鲜果并没有什么市场，而余甘中含有大量的多糖，所以将余甘多糖提取出来作为纳米银合成的还原剂，这大大的提高了余甘的利用价值。第二，余甘多糖作为天然产物绿色健康且具有很强的还原性及很好地研究前景，该多糖蛋白复合物具有安全、免疫活性及抗氧化等功能。第三，掌握余甘多糖-银纳米粒子简便绿色的制备方法及其不同条件对余甘多糖-银纳米粒子物理特性的影响规律。解析余甘多糖与银纳米单质的相互作用力，阐述余甘多糖-银纳米粒子形成原因。总而言之，国内外将余甘多糖制备纳米银的研究少之又少。因此，本试验可有效、完整地利用其余甘多糖的功能活性制备纳米银，同时本项目的工艺过程绿色、环保，操作简单易懂大大提高了纳米银的制备效率。

附图说明

图1是AgNO₃与多糖体积比条件下合成的AgNPs的抑菌效果。

图2是不同NaCl(ml)条件下合成AgNPs的抑菌效果。

图3是不同光照时间条件下合成AgNPs的抑菌效果。

图4是Y＝f(A,B)的响应面与等值线。

图5是Y＝f(A,C)的响应面与等值线。

图6是Y＝f(B,C)的响应面与等值线。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

以下是本发明的实例，但不限于下述的方法与用量，任何与之相似的过程、方法、变化都是本发明的保护范围。

实施例1余甘多糖及纳米银的制备

第一步：余甘多糖的制备：余甘(粉甘)样品采自福建省泉州市惠安县紫山镇蓝田村。余甘多糖(Emblica Polysaccharide，EPS)的制备，首先选新鲜无病害的余甘果实，洗净、晾干、去核、冻干、过 40目筛得到余甘粉末，热水浸提5小时离心取上清液得到余甘提取液，在经旋蒸浓缩，乙醇脱水、乙醚反复干燥得到余甘粗多糖，最后经冻融分级、Sevage法除蛋白、透析、旋蒸浓缩冻干制得余甘多糖。

第二步：纳米银制备：称取一定量的AgNO₃、多糖、NaCl分别配成0.05mol/L、1mg/mL、1mg/L的溶液各100mL备用。每次试验取不同体积的AgNO₃、多糖和NaCl溶液混合，将混合后的溶液加入适量氨水调节pH为8.7。室温下把混合液置于磁力搅拌器上反应一定的时间，并用波长365nm的紫外线照射辅助生成AgNPs。反应完成后，反复离心收集沉淀，将沉淀进行水洗，再次反复离心直到上清液变澄清，去除澄清液得到棕褐色沉淀，沉淀部分冻干后置于-4℃冰箱备用。

实施例2抑菌试验的进行

第一步：平板法检测抑菌试验：本试验选取AgNO₃与多糖体积比例、反应时间时间、NaCl体积三个因素进行单因素抑菌试验，每个因素分别取五个水平。取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为试验菌株，采用平板法进行抑菌试验检测AgNPs抑菌能力。分别将不同条件制备好的AgNPs粉末，用双蒸水配成10μg/mL的AgNPs溶液，超声30min，使溶液均匀分散，待用。在抑菌试验中，将已活化好的菌液按1％的比例加入LB固体培养基中，待培养基平板凝固后，将6mm 的圆形滤纸片置于LB培养基正中央，并在滤纸片上方分别点样15μL 配制好的不同AgNPs溶液。最后置于30℃的恒温培养箱中倒置培养 24h，从培养箱中取出后，用游标卡尺测量抑菌圈大小并记录。每个处理重复试验3次。

第二步：在NaCl浓度和反应时间不变的条件下，在室温环境下，研究不同的AgNO3与多糖体积比制备出的纳米银粒子对金黄色葡萄球菌抑制效果的影响。其中AgNO₃与多糖体积比选取1:1(mL/mL)、 1.5:1(mL/mL)、2:1(mL/mL)、2.5:1(mL/mL)、3:1(mL/mL)五个水平按第一步的方法抑菌试验，每个试验水平重复三次。

第三步：NaCl中的氯离子是影响纳米银制备的一个重要因素，因此在第二步中通过抑菌试验确定最佳的AgNO₃与多糖体积比，其他制备条件不变的情况下，NaCl体积选取0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL 五个水平按第一步的方法抑菌试验，每个试验水平重复三次，通过抑菌试验选出最佳抑菌的试验组。

第四步：通过第二步和第三步的试验分别确定最佳的AgNO₃与多糖体积比和NaCl体积，在其它的制备条件不变的情况下，研究365 nm紫外灯照射下反应时间选取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h五个水平按第一步的方法抑菌试验，每个试验水平重复三次。最终确定最佳的 AgNO₃与多糖体积比例、反应时间时间、NaCl体积的三因素抑菌试验组合。

实施例3响应面试验

第一步：根据单因素的试验结果和Box-Benhnken中心组合试验设计原理，继续在试验范围内优化余甘多糖制备AgNPs的条件。其中以抑菌圈的大小(Y)为响应值，根据实施例2得到的最佳三因素组合，分别是AgNO₃与多糖体积比(A)、NaCl体积(B)、时间(C)为三个因素，采用3因素3水平进行响应面优化试验，每个试验重复三次。响应面分析试验共有17个试验点，其中包括5个零点和12个分析点试验，用来估计试验误差。试验因素和水平见表1。

表1响应面分析因素及水平

第二步：数据分析：单因素试验数据采用SPSS19.0版软件进行分析，采用Duncan法进行多重比较分析，显著性差异P<0.05。响应面优化试验数据采用Design Expert 8.06版软件进行分析。每组试验均重复3次。

实施例4以下为试验效果图，表格和结论

图1至图3各因素抑菌试验；图1AgNO₃与多糖体积比条件下合成的AgNPs的抑菌效果；图2不同NaCl(ml)条件下合成AgNPs的抑菌效果；图3不同光照时间条件下合成AgNPs的抑菌效果。

响应面分析方案中17个试验点数据结果见表2回归方程各项的方差分析结果见表3，在此基础上得到的回归方程为：

Y＝+2.86+0.021*A+0.100*B-0.064*C-0.037*A*B+0.055*A*C-0.012*B*C-0.025*A₂-0.32*B₂-0.24*C₂。

表2抑菌圈响应值结果

表3响应面回归方程方差分析

抑菌圈响应面结果图：在方差分析的基础之上，利用国际通用统计软DesignExpert 8.06绘制变量之间对抑菌效果的响应面和等高线图，从响应面分析图上可形象的看出最佳参数及各参数之间的相互作用。各因素之间的相互作用如图4-6所示。

结论：综上所述在试验范围内，通过对回归方程的一阶偏导求解可以得出AgNPs制备工艺的最佳条件，当AgNO3与多糖体积比2.09:1 (mL/mL)、NaCl体积为1.57mL、紫外照射时间为0.94h，响应值抑菌圈的理论值达到最大，为28.7mm。根据仪器条件和实际情况进行验证试验，将上述条件调整为AgNO3与多糖体积比2:1(mL/mL)、 NaCl体积为1.5mL、紫外照射时间为1h，为了验证理论值的可靠性，按照最佳条件进行验证试验，试验重复三次，测得抑菌圈直径大小为 27.9±0.01mm，理论值与试验值基本吻合，说明利用响应面优化法制备的AgNPs制备工艺绿色可靠。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:所述方法的具体步骤如下：

(1)余甘多糖的制备：

首先选新鲜无病害的余甘果实，洗净、晾干、去核、冻干、过筛得到余甘粉末，热水浸提离心取上清液得到余甘提取液，在经旋蒸浓缩，乙醇脱水、乙醚反复干燥得到余甘粗多糖，最后经冻融分级、Sevage法除蛋白、透析、旋蒸浓缩冻干制得余甘多糖；

(2)纳米银制备：

称取AgNO₃、多糖、NaCl分别配成溶液；将AgNO₃溶液、多糖溶液和NaCl溶液混合，将混合后的溶液加入氨水调节pH为7-10；室温下把混合液置于磁力搅拌器上搅拌，并用紫外线照射辅助生成AgNPs；反应完成后，反复离心收集沉淀，将沉淀进行水洗，再次反复离心直到上清液变澄清，去除澄清液得到棕褐色沉淀，沉淀部分冻干后置于-4℃冰箱备用。

2.如权利要求1所述的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:步骤(1)中，过40目筛。

3.如权利要求1所述的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:步骤(1)中，沸水浸提5小时。

4.如权利要求1所述的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:步骤(2)中，将AgNO₃、多糖、NaCl分别配成0.03-0.07mol/L、0.5-1.5mg/mL、0.5-1.5mg/L的溶液，混合液中三者的体积比是1-3：1：1-2。

5.如权利要求1所述的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:步骤(2)中，将AgNO₃、多糖、NaCl分别配成0.05mol/L、1mg/mL、1mg/L的溶液，混合液中三者的体积比是2.09：1：1.57。

6.如权利要求1所述的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:步骤(2)中，将AgNO₃、多糖、NaCl分别配成0.05mol/L、1mg/mL、1mg/L的溶液，混合液中三者的体积比是2：1：1.5。

7.如权利要求1所述的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:步骤(2)中，加入氨水调节pH为8.7。

8.如权利要求1所述的余甘多糖制备纳米银复合粒子的方法，其特征在于:步骤(2)中，紫外线波长365nm，照射时间为1h。