CN110818770B - 三元双相氯化铝水解制备薯蓣皂素方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三元双相AlCl₃水解制备薯蓣皂素的方法，将干燥后的薯蓣粉末投入到反应釜中，然后加入由三氯化铝水溶液、乙醇和石油醚组成的三元双相溶液，均匀，于130～180℃反应0.5～3.0h，将反应液过滤，滤去残渣，分离出石油醚层进行旋转蒸发，重结晶后得到薯蓣皂素。本发明采用非传统酸的易斯酸AlCl₃在三元双相体系中酸解制备菊叶薯蓣皂素，不仅提高了皂素得率，缩短了提取周期，同时消耗的酸用量大大减少，更重要的，在不使用浓硫酸的情况下，对环境的污染也将变得最小，具有较大的应用前景。

Description

三元双相氯化铝水解制备薯蓣皂素方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及利用薯蓣资源提取皂素，更具体地，涉及一种三元双相AlCl₃水解制备薯蓣皂素的方法。

背景技术

甾体激素类药物是仅次于抗生素的全球第二大药品种类，而薯蓣皂素的结构和甾体激素类药物相似，是合成甾体激素类药物的最理想前体。以薯蓣皂素为原料合成的肾上腺皮质激素、性激素和蛋白同化激素三大类甾体激素药物多达上百种。因此，对于薯蓣资源提取皂素的研究和生产制备具有良好的市场前景和发展价值。

薯蓣皂苷元和不同种类、数目的糖通过糖苷键结合形成不同的薯蓣皂苷，因此，薯蓣皂苷的水解是提取制备薯蓣皂素的关键。现行的制备薯蓣皂素的技术主要基于化学水解和生物水解两种方法，并由此衍生出一些辅助提取制备技术或者多种方法结合的技术。

化学水解法主要是指利用如硫酸、盐酸等传统无机强酸水解糖苷键释放出薯蓣皂素的提取制备方法。传统的酸水解提取薯蓣皂素的工艺由Rothrock等提出，即直接用无机酸水解薯蓣根茎，用水洗涤至中性后，烘干并用石油醚等有机溶剂进行水浴循环萃取，最后结晶得到皂素成品。张裕卿等考察了用硫酸水解提取盾叶薯蓣皂素的效果，结果表明：在2mol/L的浓度下水解4h，索式提取8h后可得皂素收率为1.28％。直接酸水解法工艺简单，操作简便，适用于大规模工业化生产。但无机酸水解工艺皂素得率一般较低，为1.6％左右，用无机强酸水解时，不仅会造成设备腐蚀和洗涤时耗水量大，排出的酸性废水难以进行回收处理，并且废渣中有一部分皂苷未能与大量存在的淀粉和纤维素类物质在酸解后分离。这直接造成了环境的污染和资源的浪费，同时还影响薯蓣皂素的得率。而生物水解法提取皂素是利用一些霉菌微生物产生的生物酶直接转化皂苷生成皂素，优点是对环境友好无污染。一些研究者分别用米曲霉、哈茨木霉、泡盛曲霉对盾叶薯蓣进行接种培养来发酵直接利用皂苷转化提取皂素，研究结果证实薯蓣皂素的产量从17.06mg/g～74.26mg/g不等，差异显著，生物转化利用皂苷水解的过程及机理复杂，皂素收率偏低，且生成的副产物较多。尽管因利用生物法和酶解相结合将皂苷生物转化为薯蓣皂素对环境无污染而受到众多研究者关注，然而，与传统的直接酸水解法相比，由于酶制剂成本的不经济性和生物转化的低效性导致其在薯蓣皂素工业中的应用有限。由于传统制备技术皂素面临着收率低、酸耗高、排污量大、淀粉废渣和酸性废液无法回收或回收成本高等资源消耗过巨等问题，因此，亟需找寻一种皂素收率高、酸耗低、排污量小的薯蓣皂素的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种三元双相AlCl₃水解制备薯蓣皂素的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种三元双相AlCl₃水解制备薯蓣皂素的方法，将干燥后的薯蓣粉末投入到反应釜中，然后加入由三氯化铝水溶液、乙醇和石油醚组成的三元双相溶液，混匀，于130～180℃反应0.5～3.0h，将反应液过滤，滤去残渣，分离出石油醚层进行旋转蒸发，重结晶后得到薯蓣皂素。

本发明方法采用非传统酸的易斯酸三氯化铝在乙醇/水/石油醚的三元双相体系中酸解制备菊叶薯蓣皂素，路易斯酸三氯化铝是水溶性的无机盐类，水溶液呈酸性，安全无毒易操作，可用来替代无机强酸硫酸水解制备皂素。由于薯蓣皂素的极性与甾体皂苷的极性有很大差异，与甾体皂苷相比，薯蓣皂素由于不存在糖链所以极性较弱，这使得难以同时提取皂素和各种薯蓣皂苷，通过往反应体系中加入石油醚，利用皂苷和皂素溶解性的差异在皂苷水解的同时同步萃取皂素到石油醚有机相中，使得酸解皂苷和提取皂素同步进行；同时，氯化铝的弱酸性和部分皂苷被淀粉包裹或者连接在细胞壁上难以被释放出来，菊叶薯蓣中甾体皂苷并未完全被利用来转化皂素，本发明通过选择乙醇和水的混合溶剂有利于总皂苷的萃取，使皂苷可以更大程度通过酸水解制备得到皂素。本发明乙醇提取剂辅助的三元双相AlCl₃水解制备皂素的方法显著的提高了皂素得率，缩短了提取周期，同时消耗的酸用量大大减少，在不使用浓H₂SO₄的情况下，对环境的污染也将变得最小。

优选地，所述反应温度为140～170℃。合适而有利的温度可以加速反应进程，与此同时还可以减少提取时间并提高提取效率。然而，极端过高的温度又有可能促使菊叶薯蓣中高含量的淀粉部分糊化，从而导致一些淀粉包裹的皂苷不能水解转化为皂素，引起皂素得率损失。更重要的是，适当的温度会降低三元双相溶剂的粘度，同时增加三元双相溶剂的扩散系数，从而加速水层中皂苷的水解并提高转移到石油醚中的薯蓣皂素的提取效率。

更优选地，所述反应温度140～160℃(优选150℃)。

优选地，所述反应时间为1～2.5h(优选2.0h)。

优选地，所述三氯化铝水溶液的浓度为1.25g/L～15g/L。

优选地，所述三氯化铝水溶液的浓度为2.5g/L～15g/L。

当AlCl₃浓度过低时，低浓度的AlCl₃溶液明显的不足以完全水解甾体皂苷，仅能断裂甾体皂苷部分糖苷键，使皂苷水解为一些中间产物，如薯蓣皂苷元-三糖苷、薯蓣皂苷元-二糖苷和延龄草苷等；而过高浓度AlCl₃溶液有可能引起了副反应的发生，使得皂素脱水环化进而影响了皂素的得率。因此，所述三氯化铝水溶液的浓度优选为3.75～6.25g/L(更优选为5.0g/L)。

优选地，乙醇/水/石油醚溶液体积比为6～15:16:8～32；例如6:16:32、10:16:25、15:16:20。

更优选地，乙醇/水/石油醚溶液体积比为15:16:20。

优选地，所述薯蓣粉末在反应体系中的添加量为18～20g/L。(优选19.6g)

优选地，所述薯蓣为菊叶薯蓣；由于菊叶薯蓣基于自身皂素含量高的特点，是更理想的皂素生产原料。

作为一种优选的实施方式，所述三元双相AlCl₃水解制备薯蓣皂素的方法为将干燥后的5.0g薯蓣粉末加入密闭反应器中，然后加入由80mL 5.0g/L三氯化铝水溶液、75mL乙醇、100mL石油醚，混匀，于160℃反应2.0h，将反应液过滤，滤去残渣，分离出石油醚层进行旋转蒸发，重结晶后得到薯蓣皂素，皂素得率可达到3.21％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明方法采用非传统酸的易斯酸三氯化铝在乙醇/水/石油醚的三元双相体系中酸解制备菊叶薯蓣皂素，使用本发明三元双相AlCl₃水解的新方法得到的皂素最高得率达到了3.21％，皂素得率增幅比传统硫酸法高22.05％，比没有使用乙醇的双相AlCl₃水解法高67.19％，甚至是双相硫酸水解法的2.7倍多。本发明乙醇提取剂辅助的三元双相AlCl₃水解制备皂素的方法显著的提高了皂素得率，缩短了提取周期，同时消耗的酸用量大大减少。更重要的，在不使用浓H₂SO₄的情况下，对环境的污染也将变得最小，具有较大的应用前景。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实验材料：三年生菊叶薯蓣块茎，取自广东省翁源县菊叶薯蓣种植基地。然后将三年生菊叶薯蓣根茎切成薄片，用冷冻干燥机冷冻干燥24h去除多余水分，之后用研磨机磨成粉，装入密封袋，置于恒温除水密封器保存备用。

薯蓣皂素标准品(≥99.9％，HPLC级)，购自美国Fluka公司；甲醇，色谱纯，购自美国Sigma–Aldrich公司；石油醚(60-90℃)，分析纯，购自天津富宇精细化工有限公司；无水乙醇、葡萄糖、三氯化铝，分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，分析纯，购自广州化学试剂厂；酒石酸钾钠、亚硫酸钠、重蒸酚、3,5-二硝基水杨酸，分析纯，均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。

实施例1

精确称取5.0g菊叶薯蓣粉末投入300mL Parr反应釜中，然后加入由80mL 4.0g/LAlCl₃水溶液、75mL的乙醇和100mL石油醚组成的三元双相溶液，搅拌均匀后，设置反应釜转速为150rpm，于150℃的提取温度下反应2.0h。结束后，将石油醚有机相中的薯蓣皂素提取物旋蒸、浓缩、结晶，用色谱级甲醇溶解制样备用。然后进行薯蓣皂素分析定量。收集底部的废水溶液，便于进行随后的COD 分析。

薯蓣皂素的分析方法为：将上述甲醇定容溶解后的薯蓣皂素提取物，稀释一定倍数后，用0.22μm的滤膜过滤后收集到1mL的样品瓶，制样备用。以Fluka 公司的皂素标准品(纯度≥99.9％)为对照，进行高效液相色谱检测。具体过程为：薯蓣皂素标准品用甲醇溶解后，用高效液相色谱对浓度为4.0×10^-3mg/mL、 2.0×10^-2mg/mL、1.0×10^-1mg/mL和0.5mg/mL的薯蓣皂素标准品进行测定，以皂素标准品的色谱峰面积为依据，绘制标准曲线，以峰面积作为样品定量依据，皂素得率的计算通过以下公式进行计算：

其中W：菊叶薯蓣原料重量，g；C：皂素浓度，mg/mL；N：稀释倍数。高效液相色谱法测定参数：UV检测器；C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；柱温箱温度： 40℃；流动相：甲醇/水；流速为1.0mL/min；上样体积为10μL。每次测定重复三次。

结果显示，实施例1所述方法制备得到的皂素得率可达到3.08％。

实施例2

本实施例考察温度对三元双相体系皂素得率的影响。精确称取5.0g菊叶薯蓣粉末投入300mL Parr反应釜中，然后加入由80mL 5.0g/L AlCl₃水溶液、75mL 的乙醇和100mL石油醚组成的三元双相溶液，搅拌均匀后，设置反应釜转速为 150rpm，，待反应釜温度上升至预定系列温度(130℃、140℃、150℃、160℃、 170℃、180℃)后开始计时，反应时间为2.0h。结束后，将石油醚有机相中的薯蓣皂素提取物旋蒸、浓缩、结晶，用色谱级甲醇溶解制样备用。按照实施例1 分析的方法对菊叶薯蓣皂素得率进行计算，考察温度对三元双相体系中AlCl₃提取皂素得率的影响。结果如表1所示：

表1

从表1可以看出，在130～150℃的温度范围内，薯蓣皂素得率随升高的温度显著提高，最大皂素得率为3.21％，而温度超过160℃时，皂素得率又缓慢降低。这是因为合适而有利的温度可以加速反应进程，与此同时还可以减少提取时间并提高提取效率。然而，极端过高的温度又有可能促使菊叶薯蓣中高含量的淀粉部分糊化，从而导致一些淀粉包裹的皂苷不能水解转化为皂素，引起皂素得率损失。更重要的是，适当的温度会降低三元双相溶剂的粘度，同时增加三元双相溶剂的扩散系数，从而加速水层中皂苷的水解并提高转移到石油醚中的薯蓣皂素的提取效率。因此，温度为150℃是最优提取温度并获得最大的薯蓣皂素得率，为3.21％。

实施例3

本实施例考察提取时间对三元双相体系皂素得率的影响。精确称取5.0g菊叶薯蓣粉末投入300mL Parr反应釜中，然后加入由80mL 5.0g/L AlCl₃水溶液、75mL的乙醇和100mL石油醚组成的三元双相溶液，搅拌均匀后，设置反应釜转速为150rpm，于150℃的提取温度下分别反应(0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、 3.0h)。结束后，将石油醚有机相中的薯蓣皂素提取物旋蒸、浓缩、结晶，用色谱级甲醇溶解制样备用。按照实施例1分析的方法对菊叶薯蓣皂素得率进行计算，考察反应时间对三元双相体系中AlCl₃提取皂素得率的影响。结果如表2所示：

表2

从表2可以看出，当提取时间为0.5h时，可以获得2.69％的皂素得率。当提取时间延长后，薯蓣皂素的得率缓慢增加，在提取时间2.0h时，皂素含量达到最大值3.21％，其余时间段皂素得率相差不大。随着提取时间的进一步延长，薯蓣皂素含量略有下降，表明皂素的甾体碳骨架长时间在高温溶液中很可能被逐渐破坏，但损失量不是很大。因此，反应时间选择2.0h为最佳反应时间。

实施例4

本实施例考察AlCl₃溶液浓度对三元双相体系皂素得率的影响。精确称取5.0 g菊叶薯蓣粉末投入300mL Parr反应釜中，然后加入由80mL不同浓度的AlCl₃水溶液(1.25g/L、2.5g/L、3.75g/L、5.0g/L、6.25g/L、10g/L、15g/L)、75mL 的乙醇和100mL石油醚组成的三元双相溶液，搅拌均匀后，设置反应釜转速为 150rpm，于150℃的提取温度下分别反应2.0h。结束后，将石油醚有机相中的薯蓣皂素提取物旋蒸、浓缩、结晶，用色谱级甲醇溶解制样备用。按照实施例1分析的方法对菊叶薯蓣皂素得率进行计算，考察不同浓度的AlCl₃溶液对三元双相体系中AlCl₃提取皂素得率的影响。结果如表3所示：

表3

从表3可以看出，随着AlCl₃溶液浓度从1.25g/L增加到3.75g/L，皂素得率大幅度上升，表明AlCl₃溶液浓度在皂苷水解中起重要作用，直接影响皂素的产量。当AlCl₃溶液浓度达到5.0g/L时，皂素的得率最高。可是当添加更多的三氯化铝作酸水解催化剂时，皂素得率明显下降，表明高浓度的AlCl₃溶液可能通过过量水解电离的氢离子破坏产生的皂素，导致副反应的发生，即皂素很容易脱水形成Δ3,5-脱氧替告皂苷元和打开F-螺缩醛环后被修饰成呋喃烷衍生物。因此，浓度为5.0g/L的AlCl₃溶液足以用来提取获得最高皂素得率。

实施例5

本实施例考察乙醇/水比例对三元双相体系皂素得率的影响。精确称取5.0g 菊叶薯蓣粉末投入300mL Parr反应釜中，然后加入由80mL 5.0g/L AlCl₃水溶液、不同体积的乙醇和100mL石油醚组成的三元双相溶液，搅拌均匀后，设置反应釜转速为150rpm，于150℃的提取温度下分别反应2.0h。结束后，将石油醚有机相中的薯蓣皂素提取物旋蒸、浓缩、结晶，用色谱级甲醇溶解制样备用。按照实施例1中的方法对菊叶薯蓣皂素得率进行计算，考察不同体积比的水/石油醚溶液对三元双相体系中AlCl₃提取皂素得率的影响。结果如表4所示：

表4

在很大程度上来说，更多的甾体皂苷被提取溶剂乙醇从薯蓣原料中提取并溶解在酸性水相中，就意味着皂苷水解生产的皂素含量更高。从表4可以看出，随着乙醇体积比例的增加，皂素的得率也在逐渐增加，皂素得率最大值为3.21％时，乙醇/水比例为15/16(v/v)；当乙醇的用量继续增加时，薯蓣皂素的得率略有下降，表示此时甾体皂苷溶解已达饱和。因此，选择比例为15/16(v/v)的乙醇水溶剂作为从菊叶薯蓣中提取皂素的最佳条件。

实施例6

本实施例考察水/石油醚体积比对三元双相体系皂素得率的影响。精确称取 5.0g菊叶薯蓣粉末投入300mL Parr反应釜中，然后加入由80mL 5.0g/L AlCl₃水溶液、75mL乙醇和不同比例的石油醚组成的三元双相溶液，搅拌均匀后，设置反应釜转速为150rpm，于150℃的提取温度下分别反应2.0h。结束后，将石油醚有机相中的薯蓣皂素提取物旋蒸、浓缩、结晶，用色谱级甲醇溶解制样备用。按照实施例1中的方法对菊叶薯蓣皂素得率进行计算，考察不同体积比的水/石油醚溶液对三元双相体系中AlCl₃提取皂素得率的影响。结果如表5所示：

表5

从表5可以看出，当水/石油醚为80mL/100mL时的体积比获得了最高的皂素产量，而随着消耗更多的石油醚则带来了皂素得率降低的结果；此外，如果石油醚的用量小于60mL，则皂素得率刚刚达到约2.69％。这表明较少的石油醚溶剂不足以提取和完全溶解水解生成的皂素，而消耗更多的石油醚溶剂是不切实际的且不经济的。因此，综合考虑石油醚在各个方面的影响，水/石油醚的最佳体积比例被确定为80mL/100mL。

实施例7

本实施例考察搅拌速率(转速)对三元双相体系皂素得率的影响。精确称取 5.0g菊叶薯蓣粉末投入300mL Parr反应釜中，然后加入由80mL 5.0g/L AlCl₃水溶液、75mL的乙醇和100mL石油醚组成的三元双相溶液，搅拌均匀后，分别设置反应釜转速为(50rpm、100rpm、150rpm、200rpm、250rpm)，于150℃的提取温度下分别反应2.0h。结束后，将石油醚有机相中的薯蓣皂素提取物旋蒸、浓缩、结晶，用色谱级甲醇溶解制样备用。按照实施例1中的方法对菊叶薯蓣皂素得率进行计算，考察不同体积比的水/石油醚溶液对三元双相体系中AlCl₃提取皂素得率的影响。结果如表6所示：

表6

从表6可以看出，与其他影响因素相比，搅拌速率对皂素得率仅产生很小的影响。在50～250rpm这些搅拌速度中，皂素得率在100rpm时达到最高，仅比其他更高的搅拌速率略高。较高搅拌速率得到较少的皂素产量的原因可归因于酸解底物与酸催化剂之间的接触和反应时间不足。可以看出，作为影响参数的搅拌速率对菊叶薯蓣皂素提取的影响程度是平缓和温和的，皂素得率最低的为3.01％，最高为3.21％。

通过上述实施例优化后的最佳提取技术参数为干燥的菊叶薯蓣粉末在150℃的温度下使用80mL浓度为5.0g/L的AlCl₃溶液和体积比为15/16/20(v/v/v) 乙醇/水/石油醚处理下(即80mL AlCl₃水溶液、75mL的乙醇和100mL石油醚)，该方法提取的菊叶薯蓣皂素得率达到了3.21％。

对比例1

方法一：双相酸水解法：用0.5mol/L的浓硫酸代替三氯化铝，在最优的反应条件下即140℃下水解1.5h，重复三氯化铝提取菊叶薯蓣皂素的步骤。

方法二：传统直接酸水解法：将20.0g菊叶薯蓣粉末在200mL 2mol/L浓硫酸水溶液中水解2.0h。过滤混合物后，用200mL热水洗涤固体残余物并在 80℃下干燥。然后使用固体残余物通过索氏提取器用石油醚反复回流提取薯蓣皂素4小时。

方法三：双相AlCl₃：将干燥后的5.0g菊叶薯蓣粉末加入密闭反应器中，依次加入4.0g/L三氯化铝溶液80mL，混匀，再加入100mL石油醚，于160℃反应2h，将反应液过滤，滤去残渣，分离出石油醚层进行旋转蒸发，重结晶后得到薯蓣皂素。

1、按照本发明优化后的最佳提取技术参数提取薯蓣皂素，并与上述方法一～方法三制备得到的菊叶薯蓣皂素得率进行比较，并考察了得率增幅，固体残留量，酸消耗量和其他相关变量，其结果如表7所示：

表7

表7结果表明，本发明使用三元双相AlCl₃溶液的方法得到的皂素得率增幅比传统硫酸法高22.05％，甚至是双相硫酸水解法的2.7倍多。与传统硫酸法中要经过6小时的提取时间消耗相比，使用三元双相AlCl₃溶液水解的薯蓣皂素提取过程仅需2小时，仅比双相硫酸水解法多0.5h。类似地，在不使用硫酸进行皂素提取的情况下，三元双相AlCl₃溶液水解皂素得率比没有使用乙醇的双相AlCl₃水解法进行对比要高67.19％。

与传统硫酸法中要经过6小时的提取时间消耗相比，使用三元双相AlCl₃水解制备薯蓣皂素的过程仅需2小时。本发明的三元双相AlCl₃水解法使用的酸用量为0.5g的AlCl₃，明显低于传统硫酸法的39.21g的浓H₂SO₄用量，这也使得其废液pH值要高于传统硫酸法，使其更易处理以便于后续的发酵实验。使用乙醇提取剂辅助的三元双相AlCl₃水解制备皂素的方法显著的提高了皂素得率，缩短了提取周期，同时消耗的酸用量大大减少，更重要的，在不使用浓H₂SO₄的情况下，对环境的污染也将大大降低。也表明了乙醇提取剂辅助的三元双相AlCl₃水解提皂素的方法显著的改善了皂素得率并缩短了酸水解时间，同时没有浓H₂SO₄的使用和消耗意味着环境污染也将变得最小。

因此，本发明乙醇提取剂辅助的三元双相AlCl₃水解制备皂素的方法显著的提高了皂素得率，缩短了提取周期，同时消耗的酸用量大大减少。更重要的，在不使用浓H₂SO₄的情况下，对环境的污染也将变得最小，具有较大的应用前景。

Claims (2)

1.一种三元双相AlCl₃水解制备薯蓣皂素的方法，其特征在于，将干燥后的菊叶薯蓣粉末投入到反应釜中，然后加入由三氯化铝水溶液、乙醇和石油醚组成的三元双相溶液，混匀，于140～160℃反应1～2.5h，将反应液过滤，滤去残渣，分离出石油醚层进行旋转蒸发，重结晶后得到薯蓣皂素；所述三氯化铝水溶液的浓度为3.75～6.25g/L；乙醇/水/石油醚溶液体积比为6～15:16:8～32；所述菊叶薯蓣粉末在反应体系中的添加量为18～20g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将干燥后的5.0g菊叶薯蓣粉末加入密闭反应器中，然后加入由80mL 5.0g/L三氯化铝水溶液、75mL乙醇、100mL石油醚，混匀，于160℃反应2h，将反应液过滤，滤去残渣，分离出石油醚层进行旋转蒸发，重结晶后得到薯蓣皂素。