CN108014143B - 一种牛樟芝总三萜和多糖的同步提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牛樟芝总三萜和多糖的同步提取方法，所述方法为：取牛樟芝子实体粉末，加入碱性助磨剂进行球磨处理，获得球磨后的粉末；将球磨后的粉末加入蒸馏水中，在30‑70℃恒温下，于5000‑10000rmp高速剪切反应5‑20min，离心，获得上清液；将上清液调节pH至酸性，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀，滤液浓缩干燥后即为总多糖提取物，沉淀自然晾干后即为总三萜提取物。本发明樟芝总三萜的提取率高达13.72％，提取率提高近2倍，多糖提取率高达12.94％，提取率提高近1倍。

Description

一种牛樟芝总三萜和多糖的同步提取方法
(一)技术领域
本发明涉及一种真菌有效成分的提取方法，具体涉及一种牛樟芝总三萜和多糖的组合提取方法。
(二)背景技术
牛樟芝，是台湾特有的腐木真菌，研究发现，牛樟芝含有多种生理活性成分，最主要的两种是三萜和多糖。已发现的牛樟芝总三萜有200多种，其具有抗癌，抗炎，抗病毒和保肝等功效，牛樟芝多糖具有抗癌、增强免疫力、抗氧化等功效。
牛樟芝总三萜易溶于有机溶剂，多糖易溶于水。目前，制备三萜和多糖的传统方法大都使用溶剂热回流提取法和水煮法。
(1)中国专利CN104352533，乙醇热回流法提取牛樟芝有效成分，其提取工艺为40-75％的乙醇，60-75℃条件下回流3-4次，每次2-3h，得提取液。该方法提取时间在6-12h，提取时间过长。
(2)陆震鸣(陆震鸣，樟芝深层液态发酵及其三萜类化合物的研究，江南大学博士学位论文)比较了不同有机溶剂提取三萜的得率，最终确定樟芝三萜提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度86％，提取温度75℃，液固比37∶1，提取2次，在此条件下樟芝三萜得率理论最大值3.23％，提取时间长、使用有机溶剂且提取率低。
(3)中国专利CN104479044，从牛樟芝中提取多糖，乙醇热回流提取3次，热水60℃浸提料渣1h，樟芝多糖的提取率为3.93％，该方法需要大量消耗乙醇，操作复杂，提取时间长，多糖提取率低。
(4)张仲欣(张仲欣，张宏海，马海乐。樟芝菌丝体胞内多糖提取条件的研究，食品研究与开发，2008，10，29(10)：17-19)，采用二次通用旋转组合设计方法，研究樟芝菌丝体多糖提取工艺条件中最优组合，当提取时间为4.7h、液固比46倍、提取温度76.8℃时，樟芝菌丝体胞内多糖提取率的理论值为8.8％，该方法提取时间长，提取率低。
(5)CN104193843，樟芝菌丝体胞内多糖提取的最佳参数，提取时间为4.7h、提取温度为75℃左右时，提取率理论值为8.8％，同样存在提取时间长，提取率低的问题。
(6)刘华等(刘华，周堃等，药用真菌樟芝菌丝体多糖提取工艺及活性的研究，食品科学，2007,28(06)：243-245)优化了樟芝菌丝体粗多糖的提取工艺，最佳条件为料液比1:30，温度90℃，时间2h，多糖提取率为10％，该方法提取温度高，多糖提取率相对提高，但高温易破坏多糖活性。
(7)中国专利CN103655641，依次对樟芝进行热水浸提和乙醇浸提，樟芝多糖和三萜均被一定程度的提取出来，但分步浸提所需时间长，且未给出提取率。
由以上文献专利可以看出，牛樟芝总三萜传统提取法均需要消耗大量的有机溶剂，提取时间长，效率低，同时造成环境污染。多糖水煮法提多糖，提取温度高，时间长，但高温易破坏多糖结构，使其活性降低。除传统的提取方法，超声提取法能有效缩短提取时间，多用于牛樟芝总三萜和多糖的提取中，但随着超声处理时间延长会使多糖长链降解。
(1)郭丹钊等(郭丹钊,郑威等.超声波辅助提取樟芝菌丝体活性物质的工艺研究,食品与机械,2016,1(32):158-161)以牛樟芝菌丝体为原料，超声法提取牛樟芝总三萜和多糖，提取率分别为3.8％和2.63％，该方法相比较于传统提取方法，提取时间短，但在提取率上并没有显著的提高。
(2)王宫等(王宫，王瑾，徐蔚.牛樟芝总三萜提取工艺研究，现代中药研究与实践，2011，25(6):67-68)以牛樟芝子实体为原料，摸索超声提取法最佳工艺条件，三萜提取率最佳条件下为10.2％，该方法超声溶剂为乙醇，不够环保。
(3)中国专利CN105998091，超声条件下，利用乙醇提取-水沉淀对牛樟芝中三萜类物质进行提取，该方法操作简单，但仍使用乙醇等有机溶剂，不够环保，且未给出提取率。
(4)中国专利CN104189021，提取牛樟芝总三萜，将牛樟芝粉碎后，直接加水制得待测样品溶液，后加入活性炭，微孔过滤膜过滤得滤液，然后加入乙醚超声提取，正丁醇超声提取，得三萜粗提液。该方法，加入活性炭可除去部分杂质，但也同时降低了三萜得率，有机溶剂的大量使用，污染环境。
(5)中国专利CN104127407，牛樟芝粉末与硅藻土混合，加入5％-10％的NaHCO3，超声提取3-5次，每次5-10min，加入甲醇或氯仿定容挥干溶剂，得三萜粗提取浸膏。该方法，加入硅藻土可除去部分杂质，但也同时降低了三萜得率，该方法未给出提取率，提取时间长。
超声提取法，提取时间相对较短，但提取率较传统提取法未有显著提高，且超声提取对设备要求高，也不适用于工业化生产。为了寻找相对高效的牛樟芝总三萜和多糖的提取方法，国内学者也对牛樟芝总三萜和多糖的几种单一提取方法进行了比较研究。
王光磊等人(1、王光磊，洪华炜，王宫.几种提取技术在樟芝总三萜提取中的应用和比较，海峡药学，2014,26(8):31-32；2、王光磊，王瑾，王宫.樟芝总多糖提取方法的研究和筛选，海峡药学，2014,26(11):105-107)分别比较了超声提取法、索氏提取法、闪式提取法和酶解提取法在牛樟芝多糖和三萜中的提取效果，酶解法最高，索氏提取次之，超声和闪式提取提取率低，但酶解法成本高，索氏提取时间达4h，提取时间长。
单一的提取方法各有利弊，随着牛樟芝提取技术的发展，超声提取法，超临界流体萃取、酶解法间的相互结合的方法，被运用到牛樟芝有效成分的提取中。
(1)中国专利CN104435005，牛樟芝前处理后对三萜类化合物超临界CO2萃取、结合超声提取、减压蒸馏得到三萜类化合物粗提物浸膏。超临界CO2萃取虽然减少了有机溶剂的污染，但萃取时间长达4h，超声提取的次数为3次，每次15min，总提取所需时间长，且未给出提取率，操作复杂，成本高。
(2)中国专利CN104987429，采用酶解、超临界萃取、离子交换色谱、膜分离超滤和层析法纯化相结合的技术实现牛樟芝化合物组分的分离提取，酶解法破除细胞壁，相对增加了三萜和多糖的溶出率，但该方法未给出提取率，且三萜多糖分离精制过程操作复杂，酶解法运营成本更高，需要进一步论证其应用的价值。
樟芝子实体由纤维素、半纤维素和木质素等主要成分构成，结构紧密，直接将其简单粉碎处理，进行提取，樟芝中有效成分很难被完全充分的提取出来。近年来，机械力化学技术在天然物质改性及植物有效成分提取领域中得到实际应用。将机械力化学的原理和方法引入到天然生物活性成分的提取，形成了机械化学提取技术。实验结果表明机械力作用可以破坏细胞壁，达到超微粉碎，使有效物质更加容易释放，提高提取率。
(1)中国专利CN1290554，采用机械力化学结合超临界CO2提取灵芝中有效活性成分，提取的有效活性成分占灵芝孢子粉的37％-37.6％，但该方法旨在机械力破坏细胞壁或结合酶解法破除细胞壁，增大有效成分的溶出率，对三萜和多糖的提取没有针对性，也未提到有效成分的组成和提取率，提取物成分复杂，超临界CO2萃取中仍用到有机溶剂乙醇为夹带剂，不够环保。
(2)中国专利CN104231105，采用恒温高速剪切法结合酶解法提取海葵多糖，恒温高速剪切法破碎原料，海葵多糖的得率提高，但该方法，酶解成本较高，恒温高速剪切后，水浸提2-4h，提取时间长，效率低。
(三)发明内容
本发明目的是克服上述现有技术的不足，提供一种工艺简单、操作方便、环境友好、易于实现工业化生产的牛樟芝总三萜和总多糖的同步提取方法，牛樟芝三萜提取率高达13.72％，多糖提取率高达12.94％。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种牛樟芝总三萜和总多糖的同步提取方法，所述方法为：(1)取牛樟芝子实体粉末，加入碱性助磨剂进行球磨处理，获得球磨后的粉末；所述碱性助磨剂为无机碱化合物；(2)将步骤(1)球磨后的粉末加入蒸馏水中，在30-70℃恒温下，于5000-10000rmp高速剪切反应5-20min，离心(优选3000-5000rmp，离心5-15min)，获得上清液；(3)将步骤(2)上清液调节pH至酸性，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和滤渣，滤液浓缩干燥后即为总多糖提取物，滤渣自然晾干后即为总三萜提取物。
进一步，步骤(1)所述牛樟芝子实体粉末是将牛樟芝子实体在为35-60℃烘干至恒重，过60-80目筛获得的，优选45℃，60目筛。
进一步，步骤(1)碱性助磨剂为下列一种或几种的任意组合：氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸氢二钠、硼砂或水滑石，优选水滑石(Mg6Al2(OH)16CO3·4H2O)或碳酸氢钠。
进一步，步骤(1)碱性助磨剂与牛樟芝子实体粉末质量比为0.08-0.2:1，优选0.1:1。
进一步，步骤(1)球磨在Retsch PM-200行星式研磨仪中进行，球磨罐填充率范围为25％-35％(优选30％)；球磨时间为5-30min(优选10min)；球磨转速为200-500rmp(优选300rpm)。
进一步，步骤(2)蒸馏水体积用量以球磨后的粉末重量计为15-25ml/g，优选20ml/g。
进一步，步骤(2)离心条件为3000-5000rmp离心5-15min，优选4700rpm离心10min。
进一步，步骤(3)酸性是指pH值为2-4(优选3)，优选调节pH值的无机酸推荐为下列之一或几种的任意组合：盐酸、冰醋酸、碳酸、磷酸，更优选的无机酸为盐酸、冰醋酸中的一种。
本发明利用机械化学反应同步提取牛樟芝总三萜和多糖，首次将机械球磨技术(仅需10min)与恒温高速剪切法相结合(仅需5分钟)，不仅大大缩短了提取时间，同时破除细胞壁，增加了三萜和多糖的溶出率，使其提取率提高。在机械化学处理过程中加入固相碱试剂(助磨剂的使用及选用，是机械化学反应的关键，对三萜溶解性的改变是至关重要的，机械球磨技术早有应用，其区别于本实验机械化学的关键就在于助磨剂的使用，而助磨剂的选用，直接影响三萜结构)，机械力的作用促使其透过细胞壁与牛樟芝总三萜发生机械化学反应，改变了三萜传统的提取原理，使牛樟芝三萜反应成盐而易溶于水，反应完全且迅速，溶解性能改变，使三萜更易被提取出来。三萜溶解性改变以后，以水为提取溶剂，便可一步同时提出总三萜和多糖，使牛樟芝有效成分得到最大限度的提取利用，整个提取过程操作简单，无需使用有机溶剂，该方法在牛樟芝总三萜和多糖提取中有显著优势。樟芝总三萜的提取率高达13.72％，相同原料参照陆震鸣乙醇热回流法提取，最优条件下三萜提取率为4.72％，参照王宫超声提取法，最优条件下三萜得率5.13％，提取率提高均近2倍，同时，该方法提取温度低(40-60℃)，相对于常规水煮(100-110℃)的高温，多糖结构不易被破坏，具有更高的药理活性。牛樟芝多糖提取率高达12.94％，相同原料参照刘华热水提法，多糖得率6.01％，参照郭丹钊超声法提多糖，多糖得率为7.77％，提取率提高均近1倍。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)本发明首次将机械球磨技术与恒温高速剪切相结合，使整个提取过程仅需15min便可完成，大大缩短了提取时间，在相同提取时间下，其他提取方法的提取效果与此方法相比较，均望尘莫及。
(2)本发明通过机械化学反应，改变了传统的提取原理，使樟芝三萜反应成盐而易溶于水，整个提取过程以水为提取溶剂，避免了有机溶剂的大量使用，经济、环保、安全。
(3)机械力的作用使细胞壁破碎，增加了三萜和多糖的溶出率，樟芝总三萜和总多糖提取率显著提高。樟芝总三萜的提取率高达13.72％，提取率提高近2倍，多糖提取率高达12.94％，提取率提高近1倍。
(4)本发明同步提取牛樟芝总三萜和多糖，避免了传统法需要依次用有机溶剂和水提取的弊端，操作简单，提取高效，能使牛樟芝有效成分得到更充分的利用。
(5)本发明优选的固相碱试剂为水滑石，能显著提高三萜的提取率，同时，碱性较弱，不易破坏牛樟芝的有效成分，且容易除去，廉价易得，目前有关牛樟芝有效成分提取的文献专利中也未见报道。
(6)本发明提取温度低(40-50℃)，相较于常规水煮(100-110℃)的高温，多糖结构不易被破坏，能更好的保持其药理活性。
(7)樟芝三萜和多糖分离精制，仅需粗提液调酸和过滤，操作简单、快捷。
(四)附图说明
图1为本发明牛樟芝多糖和三萜的组合提取方法流程图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述室温是指25-30℃。
本发明所述牛樟芝中总三萜提取率的测定方法：
(1)熊果酸标准曲线：本试验主要采用熊果酸作为标准品建立标准曲线对牛樟芝三萜进行含量检测。称取熊果酸标准品2.0mg，用乙醇溶解定容至10mL。分别量取熊果酸标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于100mL试管中，常压水浴蒸干。依次加入体积浓度5％香草醛-冰乙酸溶液0.4mL，振摇溶解混匀。加高氯酸1.0mL，振摇混匀，于70℃水浴中显色15min，冰水浴冷却5min，流动自来水调节至室温后，用移液管准确移取冰乙酸10mL，稀释摇匀，30min内用1cm的比色皿在545nm下测定吸光度。以吸光度(X)为横坐标，样品浓度Y(mg/mL)为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归，得到标准品的线性回归方程：Y＝0.125X－0.010(R2＝0.998)。
(2)样品检测：取2g三萜粗提物用氯仿溶解并定容于50mL容量瓶中，精密吸取氯仿液10mL，置分液漏斗中，用饱和NaHCO3水溶液萃取4次，每次10mL，合并萃取液，置50mL量瓶中，用饱和NaHCO3稀释至刻度，制得样品溶液，吸取1ml的样品溶液，常压水浴蒸干，依次加入体积浓度5％香草醛-冰乙酸溶液0.4mL，振摇溶解混匀，加高氯酸1.0mL，振摇混匀，于70℃水浴中显色15min，冰水浴冷却5min，流动自来水调节至室温后，用移液管准确移取冰乙酸10mL，稀释摇匀，30min内用1cm的比色皿在545nm下测定吸光度。测定样品溶液在545nm处的吸光度，利用步骤(1)熊果酸标准曲线计算样品中三萜含量。
三萜提取率计算公式：
Figure BDA0001481585830000071
C1：根据标准曲线计算所得三萜的浓度(mg/mL)
N：稀释倍数
V：提取液体积(mL)
M：牛樟芝质量(g)
本发明所述牛樟芝中多糖提取率的测定方法：
(1)葡萄糖标准曲线：本试验主要采用葡萄糖作为标准品建立标准曲线对牛樟芝多糖进行含量检测。精确称取葡萄糖标准品3.0mg，用纯净水溶解定容至50mL。分别量取葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL置于10mL具塞试管中，用蒸馏水补至1mL，然后依次加入体积浓度5％苯酚水溶液1.0mL，振摇混匀，迅速加入加质量浓度98％浓硫酸5.0mL，迅速振摇混匀，于40℃水浴中放置15min，冷却至室温。用1cm的比色皿，在490nm下测定吸光度。以吸光度(X)为横坐标，样品浓度Y(mg/mL)为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得到葡萄糖对照品的线性回归方程：Y＝0.0123x+0.0015(R2＝0.998)。
(2)样品多糖的检测：称取2.0mg粗多糖样品，用水定容于25mL容量瓶中，吸取粗多糖样品液1mL，置于10mL具塞试管中，然后依次加入体积浓度5％苯酚水溶液1.0mL，振摇混匀，迅速加入质量浓度98％浓硫酸5.0mL，迅速振摇混匀，于40℃水浴中放置15min，冷却至室温。用1cm的比色皿，在490nm下测定吸光度。利用步骤(1)葡萄糖标准曲线计算多糖含量。
所述牛樟芝中多糖提取率的测定方法：
多糖提取率计算公式：
Figure BDA0001481585830000072
C1：根据标准曲线计算所得多糖的浓度(mg/mL)
N：稀释倍数
V：提取液体积(mL)
M：牛樟芝质量(g)
实施例1：
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1g水滑石加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，在10000rpm、50℃下反应5min，反应液以4700rpm转速离心10min，上清液即为牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和滤渣，取滤液浓缩至原体积的1/10后，浓缩物在-50℃下冷冻干燥得粗多糖。滤渣室温下自然晾干后即为三萜粗提物，测得总三萜提取率为13.72％，总多糖提取率为12.94％。
实施例2：
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1g硅胶(助磨剂非固相碱)加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，在10000rpm、50℃下反应5min，反应液以4700rpm转速离心10min，得牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和滤渣。取滤液为粗多糖提取液，浓缩至原体积的1/10后，-50℃冷冻干燥得粗多糖。滤渣室温下晾干即为粗三萜。由于硅胶仅为助磨剂，不能与三萜酸在机械力作用下反应成盐，难用水提取出，因此测得总三萜提取率仅为1.76％，总多糖提取率为12.14％。
实施例3：
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1.0g水滑石加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以100rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取球磨后的牛樟芝粉末10g，加入200mL蒸馏水，在10000rpm、50℃下反应10min，反应液以4700rpm转速离心10min，得牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和滤渣。取滤液浓缩至原体积的1/10后，取浓缩物-50℃冷冻干燥，得粗多糖。滤渣室温下自然晾干后得粗三萜。测得总三萜提取率为5.09％，总多糖提取率为7.85％。由于球磨转速低，有效成分未能完全暴露，机械化学反应不完全，所以提取率会降低。
实施例4
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1g水滑石加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨5min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，在8000rpm、50℃下反应10min，反应液以4700rpm转速离心10min，得牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀。取滤液浓缩至原体积的1/10后，取浓缩物-50℃冷冻干燥得粗多糖，沉淀室温下晾干后得粗三萜。测得总三萜提取率为8.35％，总多糖提取率为10.73％。由于球磨时间短，有效成分未能充分提取，有效成分提取率有所降低。
实施例5
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1.0g水滑石加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为20％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，10000rpm、50℃下剪切5min，提取混合物以4700rpm转速离心10min，得牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀。取滤液浓缩至原体积的1/10后，浓缩物-50℃冷冻干燥得粗多糖，沉淀室温下晾干后得粗三萜。本次实验测得总三萜提取率为8.13％，总多糖提取率为11.10％。球磨罐体积填充率过大或过小，球磨均不能充分进行，会导致有效成分提取率降低。
实施例6
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1.0g水滑石加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，10000rpm、90℃下剪切5min，提取混合物以4700rpm转速离心10min，得牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCL将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀。取滤液浓缩至原体积的1/10后，浓缩物-50℃冷冻干燥得粗多糖，沉淀室温下晾干后得粗三萜。本次实验测得总三萜提取率为12.13％，总多糖提取率为9.87％。提取温度过高，会破坏三萜、多糖的结构，导致提取率降低。
实施例7
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1gNaHCO3加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，在10000rpm、50℃下反应5min，反应液以4700rpm转速离心10min，上清液即为牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀，取滤液浓缩至原体积的1/10后，浓缩物在-50℃下冷冻干燥得粗多糖。沉淀室温下晾干后即为三萜粗提物,测得总三萜提取率为12.72％，总多糖提取率为11.94％，NaHCO3碱性较弱，不易破坏三萜结构，也是较为理想的碱性助磨剂之一。
实施例8
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1gNaOH加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，在10000rpm、50℃下反应5min，反应液以4700rpm转速离心10min，上清液即为牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀，取滤液浓缩至原体积的1/10后，浓缩物在-50℃下冷冻干燥得粗多糖。沉淀室温下晾干后即为三萜粗提物,测得总三萜提取率为10.72％，总多糖提取率为10.94％，NaOH碱性较强，较易破坏三萜结构，是可选的碱性助磨剂之一，但非最佳。
实施例9：
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和0.5g水滑石加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，在10000rpm、50℃下反应5min，反应液以4700rpm转速离心10min，上清液即为牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀，取滤液浓缩至原体积的1/10后，浓缩物在-50℃下冷冻干燥得粗多糖。沉淀室温下晾干后即为三萜粗提物,测得总三萜提取率为6.72％，总多糖提取率为10.94％，固相碱试剂量过少，不利于机械化学反应充分进行，三萜的提取率降低。
实施例10：
1)原料预处理：将牛樟芝子实体切成薄片，45℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛筛选，制得牛樟芝子实体粉末。
2)机械化学处理：称取10g牛樟芝子实体粉末和1.8g水滑石加入Retsch PM-200行星式球磨机球磨罐中球磨，球磨罐填充率为30％，以300rpm，球磨10min。
3)恒温高速剪切提取三萜和多糖：取步骤2)球磨后的牛樟芝粉末，加入200mL蒸馏水，在10000rpm、50℃下反应5min，反应液以4700rpm转速离心10min，上清液即为牛樟芝粗提液。
4)牛樟芝总三萜、多糖的分离精制：用2mol/L HCl将步骤3)牛樟芝粗提液调节pH至3，搅拌均匀后置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和沉淀，取滤液浓缩至原体积的1/10后，浓缩物在-50℃下冷冻干燥得粗多糖。沉淀室温下晾干后即为三萜粗提物,测得总三萜提取率为9.72％，总多糖提取率为9.94％，固相碱试剂过量，在水提过程中会导致水溶液碱性较强，破坏三萜、多糖结构，使两者提取率降低。

Claims (4)

1.一种牛樟芝总三萜和总多糖的同步提取方法，其特征在于所述方法为：(1)取牛樟芝子实体粉末，加入碱性助磨剂进行球磨处理，获得球磨后的粉末；所述球磨在Retsch PM-200行星式研磨仪中进行，球磨罐体积填充率范围为25％-35％；球磨时间为5-30min；球磨转速为200-500rpm ；所述碱性助磨剂为碳酸氢钠或水滑石；所述碱性助磨剂与牛樟芝子实体粉末质量比为0.1:1；(2)将步骤(1)球磨后的粉末加入蒸馏水中，在30-70℃恒温下，于5000-10000rpm 高速剪切反应5-20min，离心，获得上清液；(3)将步骤(2)上清液调节pH至2-4，搅拌均匀后，置4℃冰箱中静置至沉淀完全，过滤，获得滤液和滤渣，滤液浓缩冷冻干燥后即为总多糖提取物，滤渣自然晾干后即为总三萜提取物。
2.如权利要求1所述的牛樟芝总三萜和总多糖的同步提取方法，其特征在于步骤(1)所述牛樟芝子实体粉末是将牛樟芝子实体在为35-60℃烘干至恒重，过60-80目筛获得的。
3.如权利要求1所述的牛樟芝总三萜和总多糖的同步提取方法，其特征在于步骤(2)蒸馏水体积用量以球磨后的粉末重量计为15-25ml/g。
4.如权利要求1所述的牛樟芝总三萜和总多糖的同步提取方法，其特征在于步骤(2)离心条件为3000-5000rpm 离心5-15min。
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