CN104557967B - 一种高纯度米尔贝霉素的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度米尔贝霉素的生产方法，将含米尔贝霉素α1和α3的发酵液的菌渣用第一溶媒水溶液进行提取，提取液经非极性大孔树脂层析纯化，将解吸液超滤，并纳滤浓缩小体积后加入水通过第二溶媒反萃，得到的萃取液浓缩后，在8～13℃用第三溶媒水溶液洗涤，得到的第三溶媒水溶液浓缩后再次加水和用第二溶媒反萃。反萃液浓缩，降温结晶，潮晶用无水乙醇溶解，过滤膜后滴加到纯化水中再次结晶，分离晶体，减压干燥得到高纯度米尔贝霉素的类白色粉末。该方法产品纯度高，生产工艺简单，对设备要求较低，通用性好，适于工业化大生产。

Description

一种高纯度米尔贝霉素的生产方法

技术领域

本发明属于生物发酵制药领域，涉及一种生物农药的生产方法，尤其涉及到一种高纯度米尔贝霉素α1和α3混合物的生产方法。

背景技术

米尔贝霉素是由链霉菌属的一些菌株产生的一系列在结构上非常类似的十六元大环内酯类抗生素。目前已经在发酵液中分离出了20多种米尔贝霉素。这些米尔贝霉素组分大多数对农业害虫具有广谱防治活性，如蚜、螨、黄褐天幕毛虫、肠道寄生虫以及其他危害作物及家畜的寄生虫。它抗寄生虫的特点是：作用强烈，用药量少，并且对人安全、无毒害、不污染环境，只杀害虫，不杀害虫天敌，也不易产生抗性，可以作为防止该类药物产生抗性的复配及轮换用药。米尔贝霉素是目前最有前途的广谱、高效、新型、抗虫无交叉抗性的生物杀虫剂。

根据米尔贝霉素中是否具有氢化苯并呋喃结构，可将其简单分为α-型和β-型两类结构，其中米尔贝霉素α1和α3的结构式如下：

发明内容

本发明的目的在于提供一种工业化生产高纯度米尔贝霉素的方法，获得高纯度的米尔贝霉素α1和α3混合物。

本发明的技术方案如下：

一种高纯度米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：

1)将菌种发酵培养得到的含有米尔贝霉素α1和α3的发酵液固液分离，取菌渣用第一溶媒的水溶液进行提取，然后固液分离并过滤，得澄清提取液；

2)将步骤1)所得提取液上大孔树脂，用第一溶媒和水配制的解吸液进行解吸，并收集解吸液；

3)通过高压液相色谱检测，合并米尔贝霉素α1和α3组分HPLC含量之和≥75％的解吸液，经超滤机超滤后进行纳滤浓缩，至浓缩液中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和为5～7g/L停止浓缩；

4)向纳滤浓缩液中加入1.5～3倍体积的第二溶媒混合均匀，并加入3～5倍纳滤浓缩液体积的去离子水，搅拌均匀后静置分层，分离出第二溶媒层并浓缩至其中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和为40～50g/L；

5)将步骤4)所得第二溶媒浓缩液降温至8～13℃，用同样温度的第三溶媒水溶液萃取多次，直到第二溶媒浓缩液中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和小于0.3g/L；

6)将经步骤5)萃取的第三溶媒水溶液合并并浓缩到溶液呈乳白浑浊状，向其中加入等体积的去离子水，再加入1.5～3倍体积的第二溶媒进行萃取；

7)将步骤6)所得第二溶媒萃取液减压浓缩到其中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和为200～300g/L，然后慢速搅拌并降温到8-13℃结晶，离心分离潮晶；

8)将潮晶用无水乙醇溶解，用微孔滤膜过滤，将滤液缓慢滴加到水中并搅拌，析出晶体，离心分离晶体并干燥得高纯度米尔贝霉素α1和α3混合物的类白色粉末。

上述步骤1)和步骤2)中，所述第一溶媒优选为乙醇；步骤1)所述第一溶媒的水溶液中乙醇的体积百分比含量为60％～65％；步骤2)中第一溶媒和水配制的解吸液中乙醇的体积百分比含量为70％～75％。

在步骤1)，优选的，每千克菌渣用15～20L的第一溶媒的水溶液进行提取，固液分离后的提取液过除菌板过滤，得澄清提取液。

步骤2)中所述大孔树脂为非极性大孔树脂，优选日本三菱HP20、上海华震HZ-818树脂、上海华震色谱-3#树脂。解吸时可按照1倍树脂体积收集一份解吸液的方式收集解吸液，以便在步骤3)检测其中的米尔贝霉素α1和α3组分含量之和。

步骤3)将合并的解吸液倒入超滤机超滤，超滤出来的液体再进入纳滤机进行纳滤浓缩。

步骤4)所述第二溶媒优选为正庚烷或者正己烷。

步骤5)所述第三溶媒优选为甲醇，其水溶液中甲醇的体积百分比含量为80～85％。

通常，在步骤5)需要用第三溶媒水溶液萃取第二溶媒浓缩液2～3次，每次萃取所用第三溶媒水溶液的体积优选为第二溶媒浓缩液体积的1.5～3倍。

步骤7)减压浓缩后，慢速搅拌并缓慢降温到8-13℃后保持4～5小时结晶。

步骤8)优选的，每千克潮晶用4.5～5.5L的无水乙醇溶解，过0.45μm的微孔有机滤膜；滤液向3倍无水乙醇体积的纯化水(通过0.45μm的微孔滤膜纯化)中缓慢滴加，并搅拌；滴加完成后再搅拌30分钟，离心分离析出晶体；减压干燥晶体得到含高纯度米尔贝霉素α1和α3混合物的类白色结晶粉末。该类白色粉末中米尔贝霉素α1和α3混合物的含量之和≥95％。

本发明提供的高纯度米尔贝霉素的生产方法产品纯度高，生产工艺简单，对设备要求较低，通用性好，适于工业化大生产。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1：

发酵液放罐，通过常规固液分离得到含有米尔贝霉素的菌渣833kg，通过液相检测其中米尔贝霉素α1和α3混合物6kg。

用16660L的60％乙醇对菌渣进行萃取，萃取完成后，通过常规固液分离得到萃取液，通过高压液相色谱检测其中含有米尔贝霉素α1和α3混合物5.8kg。

萃取液通过除菌板过滤，得到的澄清滤液上HP20树脂；上柱完成后用70％浓度乙醇进行解吸，通过高压液相色谱检测，收集色谱纯度≥75％以上的解吸液，其中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3含量为5kg。解吸液通过超滤膜过滤和纳滤膜浓缩，得到米尔贝霉素α1和α3混合物浓度为5g/L的浓缩液1000L。

向浓缩液中加入1500L的正庚烷，搅拌均匀后再加入3000L去离子水，并搅拌均匀静置分层。分离的庚烷溶液再次减压浓缩到米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分浓度之和为40g/L后停止，浓缩液体积125L。

开启降温，将浓缩后的庚烷溶液温度降低到8℃，加入375L同样温度80％浓度的甲醇水溶液，搅拌均匀后静置分层，分离下层甲醇水溶液。同样的操作再进行1次，检测庚烷溶液中米尔贝霉素α1和α3混合物浓度＜0.3g/L。

合并萃取的甲醇水溶液，高压液相色谱检测其中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分4.7kg。常规减压浓缩到溶液乳白浑浊，停止浓缩，加入等体积的去离子水，再加入1.5倍去离子水体积的庚烷，搅拌萃取。

将萃取液分离并进行常规减压浓缩，浓缩到溶液中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分浓度之和为300g/L后停止浓缩，体积15.6L。慢速搅拌并且缓慢降温到8℃，保温结晶4小时，离心机分离潮晶5.1kg。高压液相色谱检测，潮晶中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3纯含量为3.76kg。

用25L的无水乙醇将潮晶溶解，过0.45μm微孔有机滤膜。滤液向通过0.45μm的微孔滤膜的75L纯化水中缓慢滴加，并搅拌。滴加完成后搅拌30分钟，离心分离析出晶体。晶体进行减压干燥得到米尔贝霉素α1和α3混合物的类白色结晶粉末3.81g，通过高压液相色谱检测其含量为96.5％。

实施例2：

发酵液放罐，通过常规固液分离得到含有米尔贝霉素的菌渣1000kg，通过液相检测其中米尔贝霉素α1和α3混合物8.6kg。

用15000L的65％乙醇对菌渣进行萃取，萃取完成后，通过常规固液分离得到萃取液，通过高压液相色谱检测其中含有米尔贝霉素α1和α3混合物8.2kg。

萃取液通过除菌板过滤，得到的澄清滤液上HZ-818树脂；上柱完成后用75％浓度乙醇进行解吸，通过高压液相色谱检测，收集色谱纯度≥75％以上的解吸液，其中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3含量为7.2kg。解吸液通过超滤膜过滤和纳滤膜浓缩，得到米尔贝霉素α1和α3混合物浓度为7g/L的浓缩液1001L。

向浓缩液中加入3000L的正己烷，搅拌均匀后再加入5000L去离子水，并搅拌均匀静置分层。分离的正己烷溶液再次减压浓缩到米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分浓度之和为50g/L后停止，浓缩液体积144L。

开启降温，将浓缩后的正己烷溶液温度降低到13℃，加入432L同样温度85％浓度的甲醇水溶液，搅拌均匀后静置分层，分离下层甲醇水溶液。同样的操作再进行2次，检测正己烷溶液中米尔贝霉素α1和α3混合物浓度＜0.3g/L。

合并萃取的甲醇水溶液，高压液相色谱检测其中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分6.9kg。常规减压浓缩到溶液乳白浑浊，停止浓缩，加入等体积的去离子水，再加入3倍去离子水体积的正己烷，搅拌萃取。

将萃取液分离并进行常规减压浓缩，浓缩到溶液中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分浓度之和为200g/L后停止浓缩，体积34.5L。慢速搅拌并且缓慢降温到13℃，保温结晶5小时，离心机分离潮晶5.94kg。高压液相色谱检测，潮晶中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3纯含量为5.65kg。

用30L的无水乙醇将潮晶溶解,过0.45μm微孔有机滤膜。滤液向通过0.45μm的微孔滤膜的90L纯化水中缓慢滴加，并搅拌。滴加完成后搅拌30分钟，离心分离析出晶体。晶体进行减压干燥得到含米尔贝霉素α1和α3混合物的类白色结晶粉末5.7kg，通过高压液相色谱检测其含量为97.1％。

实施例3：

发酵液放罐，通过常规固液分离得到含有米尔贝霉素的菌渣965kg，通过液相检测其中米尔贝霉素α1和α3混合物7.2kg。

用15440L的63％乙醇对菌渣进行萃取，萃取完成后，通过常规固液分离得到萃取液，通过高压液相色谱检测其中含有米尔贝霉素α1和α3混合物7.06kg。

萃取液通过除菌板过滤，得到的澄清滤液上色谱-3#树脂；上柱完成后用73％浓度乙醇进行解吸，通过高压液相色谱检测，收集色谱纯度≥75％以上的解吸液，其中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3含量为6kg。解吸液通过超滤膜过滤和纳滤膜浓缩，得到米尔贝霉素α1和α3混合物浓度为6g/L的浓缩液1000L。

向浓缩液中加入1800L的正庚烷，搅拌均匀后再加入4000L去离子水，并搅拌均匀静置分层。分离的正庚烷溶液再次减压浓缩到米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分浓度之和为45g/L后停止，浓缩液体积133L。

开启降温，将浓缩后的庚烷溶液温度降低到10℃，加入400L同样温度85％浓度的甲醇水溶液，搅拌均匀后静置分层，分离下层甲醇水溶液。同样的操作再进行2次，检测正己烷溶液中米尔贝霉素α1和α3混合物浓度＜0.3g/L。

合并萃取的甲醇水溶液，高压液相色谱检测其中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分5.86kg。常规减压浓缩到溶液乳白浑浊，停止浓缩，加入等体积的去离子水，再加入1.5倍去离子水体积的正己烷，搅拌萃取。

将萃取液分离并进行常规减压浓缩，浓缩到溶液中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3组分浓度之和为220g/L后停止浓缩，体积26.64L。慢速搅拌并且缓慢降温到10℃，保温结晶4.5小时，离心机分离潮晶5kg。高压液相色谱检测，潮晶中米尔贝霉素α1和米尔贝霉素α3纯含量为4.8kg。

用25L的无水乙醇将潮晶溶解,过0.45μm微孔有机滤膜。滤液向通过0.45μm的微孔滤膜的75L纯化水中缓慢滴加，并搅拌。滴加完成后搅拌30分钟，离心分离析出晶体。晶体进行减压干燥得到含米尔贝霉素α1和α3混合物的类白色结晶粉末4.9kg，通过高压液相色谱检测其含量为98.2％。

Claims (8)

1.一种高纯度米尔贝霉素的生产方法，包括以下步骤：

1)将菌种发酵培养得到的含有米尔贝霉素α1和α3的发酵液固液分离，取菌渣用第一溶媒的水溶液进行提取，然后固液分离并过滤，得澄清提取液；

2)将步骤1)所得提取液上非极性大孔树脂，用第一溶媒和水配制的解吸液进行解吸，并收集解吸液；

3)通过高压液相色谱检测，合并米尔贝霉素α1和α3组分HPLC含量之和≥75％的解吸液，经超滤机超滤后进行纳滤浓缩，至浓缩液中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和为5～7g/L停止浓缩；

4)向纳滤浓缩液中加入1.5～3倍体积的第二溶媒混合均匀，并加入3～5倍纳滤浓缩液体积的去离子水，搅拌均匀后静置分层，分离出第二溶媒层并浓缩至其中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和为40～50g/L；

5)将步骤4)所得第二溶媒浓缩液降温至8～13℃，用同样温度的第三溶媒水溶液萃取多次，直到第二溶媒浓缩液中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和小于0.3g/L；

6)将经步骤5)萃取的第三溶媒水溶液合并并浓缩到溶液呈乳白浑浊状，向其中加入等体积的去离子水，再加入1.5～3倍体积的第二溶媒进行萃取；

7)将步骤6)所得第二溶媒萃取液减压浓缩到其中米尔贝霉素α1和α3组分浓度之和为200～300g/L，然后慢速搅拌并降温到8-13℃结晶，离心分离潮晶；

8)将潮晶用无水乙醇溶解，用微孔滤膜过滤，将滤液缓慢滴加到水中并搅拌，析出晶体，离心分离晶体并干燥得高纯度米尔贝霉素α1和α3混合物的类白色粉末。

2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述第一溶媒为乙醇；步骤1)所述第一溶媒的水溶液中乙醇的体积百分比含量为60％～65％；步骤2)所述第一溶媒和水配制的解吸液中乙醇的体积百分比含量为70％～75％。

3.如权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，步骤1)中每千克菌渣用15～20L的第一溶媒的水溶液进行提取。

4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述第二溶媒为正庚烷或者正己烷。

5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤5)中所述第三溶媒为甲醇，其水溶液中甲醇的体积百分比含量为80～85％。

6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤5)用第三溶媒水溶液萃取第二溶媒浓缩液2～3次，每次萃取所用第三溶媒水溶液的体积为第二溶媒浓缩液体积的1.5～3倍。

7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤7)减压浓缩后，慢速搅拌并缓慢降温到8-13℃后保持4～5小时结晶。

8.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，在步骤8)每千克潮晶用4.5～5.5L的无水乙醇溶解，过0.45μm的微孔有机滤膜；滤液向3倍无水乙醇体积的纯化水中缓慢滴加，并搅拌；滴加完成后再搅拌30分钟，离心分离析出晶体；减压干燥晶体得到含高纯度米尔贝霉素α1和α3混合物的类白色结晶粉末。