CN101985459A - 从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺，其特征是：以新鲜的或晒干处理过的枇杷叶为原料经切丝→醇提过滤→浓缩沉淀→离心过滤→醇溶过滤→离子交换树脂纯化→调中浓缩→洗涤干燥→硅胶精制→脱色过滤→浓缩沉淀→结晶→真空干燥制成。本发明的优点是：(1)建立了工业化生产熊果酸的标准生产线以及配套设备，找寻一条切实可行的工艺路线，批量生产出了优质熊果酸产品；(2)解决了现有的熊果酸纯度问题，经分析检测，熊果酸的含量达到HPLC级98%以上；(3)提高了枇杷叶的附加值，变废为宝。

Description

从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺

技术领域

本发明涉及熊果酸的提取，具体是从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺。

背景技术

熊果酸，又名乌索酸、乌苏酸，属α-香树脂醇型五环三萜化合物。白色，棱柱状结晶（无水乙醇），细毛样针状结晶（稀乙醇）。熔点285℃~287℃，比旋光度[α]D 25±67.5°（C=1，1mol/L氢氧化钠中）。熊果酸为乌苏烷型五环三萜，分子式C₃₀H₄₈O₃，分子量456.68，其结构式如下：

熊果酸具有显著的保肝、抗肝炎作用。临床表现具有显著而迅速地降低谷丙转氨酶、血清转氨酶、消退黄疽、增进食欲、抗纤维化和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定的特点。“抗肝炎中药一类新药乌索酸及其制剂的研究开发”课题被列入2002年国家“863”计划，以熊果酸为主要成分的女贞叶提取物制成的胶囊剂主要用于肝肾阴虚、阴虚阳亢症所致的原发性高脂血症，是我国批准的二类新药。

近年的研究发现熊果酸能明显抑制HL－60细胞增殖，可诱导其凋亡；能使小鼠的巨噬细胞吞噬功能显著提高。体内试验证明，熊果酸可以明显增强机体免疫功能。说明熊果酸的抗肿瘤作用广泛，极有可能成为低毒有效的新型抗癌药物。

熊果酸还具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒；降血脂、抗动脉粥样硬化、降血糖、抗糖尿病；抑制艾滋病毒；镇静、安定、增强免疫等显著生物活性。

此外，熊果酸对精子有一定毒性作用，它能破坏胆间桥的肌动蛋白，打开桥键，产生共质体，抑制精子的形成, 利用这一作用有望开发成男性避孕药。

目前国内有很多生产熊果酸的文献报导，原料来源也多种多样。如有枇杷叶、毛泡桐叶、苦丁茶叶等；工艺也多种多样，如超临界萃取法、沉淀吸附法、超声波提取法、常温超高压提取法等。但

1、不易实现工业化生产：

熊果酸在植物中的含量低，只有0.1~1.0%，考虑到原料来源的可持续性和经济性，目前比较可行的是从枇杷叶中分离提取熊果酸，因其含量相对较高而适宜生产推广。但是由于原料含量低，又是以叶为原料，叶中富含叶绿素等强亲脂性成分，超临界萃取法并不能有效将叶绿素等杂质与熊果酸等有效成分有效分离开来，而只能得到低含量混合品。沉淀吸附法工艺过程非常简单，生产中只需加入一种试剂即可解决亲脂性成分，至于其适用性，还有待于进一步研究。目前生产中尚未有超声波提取设备，并且此法噪声大，易损害听力，不利于劳动安全与保护。常温超高压提取法由于需要高压，在生产过程中存在不安全因素，需要防爆车间与耐高压设备，不仅投入大，也不易于在生产中实现。

文献普遍报导分离熊果酸用到石油醚、氯仿、丙酮等有毒、易燃易爆的溶剂，在生产中不易于控制，安全要求特高。而且这些溶剂带有毒性，对人危害大，又易于挥发，极大地提高了生产成本。也有文献报导用制备薄层、硅胶层析分离制备熊果酸，但是这些一方面制备量非常小，另一方面生产周期特别长，再者需要用有毒有害溶剂来洗脱或展开，属于实验室的分离制备方法，根本无法在生产中实现。

2、提取技术不够完善：

文献所报导的多数分离提取熊果酸，均停留在简单的正交设计等方案得到熊果酸粗提物，含量不到10%。这对于植物提取分离而言，只是一个开端。为生产出高附加值的产品，需要自原料开始，分离制备到纯度95%以上的有效成分单体。

3、纯度不高：

目前多数文献报导的能在生产中实现的熊果酸产品，含量为92%~97%，少见有98%以上的报导。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，而提供一种从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺。这种提取工艺为工业化寻找了一种切实可行的工艺路线，提取纯度高，熊果酸的含量达到HPLC级98%以上，可以变废为宝，提高资源利用率。

本发明从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺，是以新鲜的或晒干处理过的枇杷叶为原料经切丝→醇提过滤→浓缩沉淀→离心过滤→醇溶过滤→离子交换树脂纯化→调中浓缩→洗涤干燥→硅胶精制→脱色过滤→浓缩沉淀→结晶→真空干燥制成。其提取工艺包括如下步骤：

（1）切丝：取将鲜的或晒干处理过的枇杷叶切丝；

（2）醇提过滤：将切丝后的枇杷叶投入提取罐中，用80%-85%乙醇溶液提取3次，提取温度为70-80℃，过滤，合并前2次滤液，第3次滤液套提，作为下批物料的第1次提取液，残渣弃去；

（3）浓缩沉淀：将前2次合并滤液真空减压浓缩至料液比1︰0.7-1.2，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃，然后静置沉淀5h以上；

（4）离心过滤：沉淀完全以后，将混合液先过三足沉降离心，滤液再过管式离心，收集沉降离心渣与管式离心渣，合并，得沉淀；

（5）醇溶过滤：将沉淀投入搅拌罐中，在不断搅拌下加入沉淀重量10-14倍浓度为80-85%的乙醇溶液，将溶解后的混合液过管式离心机，得滤液；

（6）离子交换树脂纯化：将滤液通过型号为D900弱碱性阴离子交换树脂层析柱，待滤液全部通过树脂柱以后，先用80%~85%乙醇洗至液出液呈色极浅，此部分乙醇液送回收乙醇；然后用浓度80-85%乙醇加4%稀盐酸解吸，至流出液颜色由深变极浅；再用浓度80-85%乙醇加4%氢氧化钠洗脱，至流出液颜色变浅，合并酸性乙醇与碱性乙醇解液，得解吸液；

（7）调中浓缩：将解吸液PH调至6.0~7.0后真空减压浓缩，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃，然后静置沉淀5h以上；

（8）抽滤洗涤干燥：沉淀完全以后，将混合液抽滤，得沉淀；用水将沉淀洗涤至中性；真空干燥，控制真空度≥0.08Mpa，温度50℃~60℃，得粗品熊果酸；

（9）硅胶精制：将粗品熊果酸粉碎，加入2倍重量的硅胶混匀，装入硅胶柱的顶端，硅胶柱中硅胶装填重量为粗品熊果酸的6倍，用无水乙醇洗脱，自检识浓缩液有沉淀起开始收集，至沉淀极少止，合并此段乙醇洗脱液；

（10）脱色过滤：将乙醇洗脱液转入搅拌罐中，在不断搅拌下加入溶液量0.5%的活性碳脱色，搅拌10min后，板框过滤，得滤液；

（11）浓缩沉淀：将滤液真空减压浓缩至无醇味，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃；静置沉淀4h；

（12）结晶：沉淀完全以后，抽滤，得类白色沉淀；再加入沉淀重量15倍浓度80%~85%乙醇，加热至沸腾，在结晶罐中逐渐放冷至结晶完全；分取结晶，母液继续浓缩，同法操作得二次结晶，以此类推，合并第1次与第2次结晶，送真空干燥，其余送下批精制；

（13）真空干燥：将结晶真空干燥，控制真空度≥0.08Mpa，温度50℃~60℃，得成品-熊果酸。

产品经检测，成品为白色结晶，熊果酸含量达到HPLC级98%以上。

本发明的优点是：

（1）建立了工业化生产熊果酸的标准生产线以及配套设备，找寻一条切实可行的工艺路线，批量生产出了优质熊果酸产品；

（2）解决了现有的熊果酸纯度问题，经分析检测，熊果酸的含量达到HPLC级98%以上；

（3）提高了枇杷叶的附加值，变废为宝。

附图说明

图1为本发明实施例从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但不是对本发明保护内容的限定。

实施例1

从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺，包括如下步骤：

（1）切丝：取新鲜或晒干处理过的枇杷叶800kg，用切药机切丝，宽度0.5-2.0cm；

（2）醇提过滤：将切丝后的枇杷叶原料投入6cm³提取罐中，用80%乙醇溶液提取3次，加入提取溶媒的量为药材重量的6、4、6倍，即第1次加入4800L，第2次加入3200L，第3次加入4800L，提取时间为2.0、1.5、0.5h，提取温度为70℃~80℃。过滤，合并前2次滤液，第3次滤液套提，作为下批物料的第1次提取液，残渣弃去；

（3）浓缩沉淀：将前2次合并滤液真空减压浓缩至料液比1:0.7~1.2，即800kg原料的提取液浓缩至560L~960L左右，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃，然后静置沉淀5h以上，使沉淀良好；

（4）离心过滤：沉淀完全以后，将混合液先过三足沉降离心，滤液再过管式离心，收集沉降离心渣与管式离心渣，合并，得沉淀；

（5）醇溶过滤：将沉淀投入搅拌罐中，在不断搅拌下加入沉淀重量10~14倍浓度80%乙醇溶液，搅拌使沉淀溶解；将混合液过管式离心机，得滤液；

（6）离子交换树脂纯化：将滤液通过装有120kg型号为D900弱碱性阴离子交换树脂的层析柱，待滤液全部通过树脂柱以后，先用80%乙醇洗至液出液呈色极浅，此部分乙醇液送回收乙醇；然后用乙醇80%~85%，稀盐酸4%解吸，至流出液颜色由深变极浅；再用乙醇80%~85%，氢氧化钠4%洗脱，至流出液颜色变浅，合并酸性乙醇与碱性乙醇解液，得解吸液；

（7）调中浓缩：将解吸液PH调至6.0~7.0后真空减压浓缩，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃，然后静置沉淀5h以上，使沉淀良好；

（8）抽滤洗涤干燥：沉淀完全以后，将混合液抽滤，得沉淀；用自来水将沉淀洗涤至中性；真空干燥，控制真空度≥0.08Mpa，温度50℃~60℃，得粗品熊果酸；

（9）硅胶精制：将粗品熊果酸粉碎，加入2倍重量的硅胶混匀，装入硅胶柱的顶端，硅胶柱中硅胶装填重量为粗品熊果酸的6倍，用无水乙醇洗脱，自检识浓缩液有沉淀起开始收集，至沉淀极少止，合并此段乙醇洗脱液；

（10）脱色过滤：将乙醇洗脱液转入搅拌罐中，在不断搅拌下加入溶液量0.5%的活性炭，搅拌10min后，板框过滤，得滤液；

（11）浓缩沉淀：将滤液真空减压浓缩至无醇味，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃；静置沉淀4h，使沉淀分层良好；

（12）结晶：沉淀完全以后，抽滤，得类白色沉淀；再加入沉淀重量15倍浓度80%乙醇，加热至沸腾，在结晶罐中逐渐放冷至结晶完全；分取结晶，母液继续浓缩，同法操作得二次结晶。以此类推，合并第1次与第2次结晶，送真空干燥，其余送下批精制；

（13）真空干燥：将结晶真空干燥，控制真空度≥0.08Mpa，温度50℃~60℃，得成品-熊果酸2.3~3.0kg。

产品经检测为白色结晶，收率0.28-0.38%，熊果酸含量≥98%。其结构式为：

 

实施例2

按所述的相同步骤重复进行实施例1，但是：步骤（2）是用85%的乙醇提取3次；步骤（5）是在不断搅拌下加入沉淀重量10~14倍浓度85%乙醇溶液；步骤（6）用85%的乙醇洗至液出液呈色极浅；步骤（12）加入沉淀重量15倍浓度85%乙醇。

Claims (2)

1.从枇杷叶中分离提取≥98%熊果酸的工艺，其特征是：包括如下步骤：

（1）切丝：取将鲜的或晒干处理过的枇杷叶切丝；

（2）醇提过滤：将切丝后的枇杷叶投入提取罐中，用80%-85%乙醇溶液提取3次，提取温度为70-80℃，过滤，合并前2次滤液，第3次滤液套提，作为下批物料的第1次提取液，残渣弃去；

（3）浓缩沉淀：将前2次合并滤液真空减压浓缩至料液比1︰0.7-1.2，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃，然后静置沉淀5h以上；

（4）离心过滤：沉淀完全以后，将混合液先过三足沉降离心，滤液再过管式离心，收集沉降离心渣与管式离心渣，合并，得沉淀；

（5）醇溶过滤：将沉淀投入搅拌罐中，在不断搅拌下加入沉淀重量10-14倍浓度为80-85%的乙醇溶液，将溶解后的混合液过管式离心机，得滤液；

（6）离子交换树脂纯化：将滤液通过型号为D900弱碱性阴离子交换树脂层析柱，待滤液全部通过树脂柱以后，先用80%~85%乙醇洗至液出液呈色极浅，此部分乙醇液送回收乙醇；然后用浓度80-85%乙醇加4%稀盐酸解吸，至流出液颜色由深变极浅；再用浓度80-85%乙醇加4%氢氧化钠洗脱，至流出液颜色变浅，合并酸性乙醇与碱性乙醇解液，得解吸液；

（7）调中浓缩：将解吸液PH调至6.0~7.0后真空减压浓缩，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃，然后静置沉淀5h以上；

（8）抽滤洗涤干燥：沉淀完全以后，将混合液抽滤，得沉淀；用水将沉淀洗涤至中性；真空干燥，控制真空度≥0.08Mpa，温度50℃~60℃，得粗品熊果酸；

（9）硅胶精制：将粗品熊果酸粉碎，加入2倍重量的硅胶混匀，装入硅胶柱的顶端，硅胶柱中硅胶装填重量为粗品熊果酸的6倍，用无水乙醇洗脱，自检识浓缩液有沉淀起开始收集，至沉淀极少止，合并此段乙醇洗脱液；

（10）脱色过滤：将乙醇洗脱液转入搅拌罐中，在不断搅拌下加入溶液量0.5%的活性碳脱色，搅拌10min后，板框过滤，得滤液；

（11）浓缩沉淀：将滤液真空减压浓缩至无醇味，控制真空度≥0.07Mpa，温度50℃~60℃；静置沉淀4h；

（12）结晶：沉淀完全以后，抽滤，得类白色沉淀；再加入沉淀重量15倍浓度80%~85%乙醇，加热至沸腾，在结晶罐中逐渐放冷至结晶完全；分取结晶，母液继续浓缩，同法操作得二次结晶，以此类推，合并第1次与第2次结晶，送真空干燥，其余送下批精制；

（13）真空干燥：将结晶真空干燥，控制真空度≥0.08Mpa，温度50℃~60℃，得成品-熊果酸。

2.用权利要求1所述的分离提取工艺制成的含量≥98%的熊果酸。

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