CN103204800B

CN103204800B - 一种1‑脱氧野尻霉素的提取方法

Info

Publication number: CN103204800B
Application number: CN201310051701.3A
Authority: CN
Inventors: 汤世江
Original assignee: CHENGDU KEYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHENGDU KEYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2017-07-04
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: CN103204800A

Abstract

本发明公开了一种高纯度1‑脱氧野尻霉素的提取方法，包括如下步骤：原料预处理，酶解浸提，酸化滤液，将酸化滤液上强酸性阳离子树脂柱、用氨水洗脱、得氨水洗脱液，对氨水洗脱液进行膜分离除杂、浓缩，浓缩液经过弱酸性阳离子树脂柱进行柱层析、氨水洗脱、分段收集洗脱液，浓缩结晶、干燥，得1‑脱氧野尻霉素精品；所述酶解浸提步骤使用了组合酶，其成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3‑5∶2‑4∶1。本发明高纯度1‑脱氧野尻霉素的提取方法采用酶解手段，与本发明除杂、纯化等技术特征的有机结合，使得本发明提取方法具有目标产物的提取率和纯度均较高，纯度高于98％；环保无污染，提高了产品质量安全等优点。

Description

一种1-脱氧野尻霉素的提取方法

技术领域

本发明涉及从植物中提取天然物质的方法，特别涉及一种1-脱氧野尻霉素的提取方法。

背景技术

桑叶为桑科(Moraceae)桑属植物(Morus L.)的叶，是国家卫生部公布的药食两用植物，全国大部分地区均有栽培生产，以南方蚕桑生产地区产量最多，如江苏、广西、浙江、安徽、四川等。桑叶味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏散风热，清肺润燥，平肝明目，凉血止血之功效。历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴症。现代医学在研究桑叶化学成分和动物实验基础上，发现桑叶具有降血压、降血糖、降低胆固醇、抗肿瘤、抗过敏及利尿等功能。

在桑叶、桑枝中起到主要药理作用的成分是1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)是一种哌啶类多羟基生物碱，英文名称1-Deoxynojirmycin，简称1-DNJ，化学名称是3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C₆H₁₃NO₄，分子量为163，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤转移等多种生物活性。到目前为止的研究成果中，自然界以桑叶中天然含量最高。1-DNJ作为一种糖苷酶抑制剂具有良好的开发前景和用价值因而由桑叶中提取1-DNJ已成为国内外学者研究的焦点。在我国，1-脱氧野尻霉素产品尚未进行工业化生产。国内虽然有大学院校、科研院所进行小试的报道，但主要集中于对粗产品的研制和应用的研究，极少有对高纯度1-脱氧野尻霉素提取工艺的研究报道，高纯度1-脱氧野尻霉素的工业化生产进展缓慢。

中国专利200910192542.2公开了一种1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的提取方法，主要步骤为：

(1)将桑叶和40％-80％乙醇按照料液比1∶6-40投料，混合于50-70℃搅拌1-3小时，离心过滤得到滤液A；

(2)滤渣按料液比1∶6-40投料，混合于50-70℃搅拌1-3小时，离心过滤得到滤液B，合并滤液A和B，在50-70℃下减压浓缩得浓缩液，同时回收乙醇；

(3)浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀；

(4)压滤除去沉淀，滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱；

(5)滤液加入结束后用纯净水洗，待大孔树脂流出液无色时，将其断开，再用0.1-0.5mol/L的氨水或含氨0.1-0.5mol/L的5％-50％乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ)，将洗脱液用酸调节至pH3-5，再上阳离子树脂柱，待洗脱液上完后，用纯净水洗至流出液无色，再用10％-70％的乙醇溶液洗；

(6)乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0.1-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液，用纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质，浓缩液喷雾干燥，得到黄棕色粉末1-脱氧野尻霉素。

该专利方法通过乙醇水溶液提取，经絮凝剂沉淀，再经由连续阳离子交换树脂和大孔吸附树脂方法除杂，浓缩，干燥得黄棕色粉末1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。该方法最大的缺陷在于，对桑叶中所含的主要功效成分1-脱氧野尻霉素的提取率不高，而且仅能制取纯度低的含1-脱氧野尻霉素的生物总碱，无法提取含量高达98％以上的高纯度1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。

中国专利200910167602.5中公开了一种提取高纯度1-DNJ的方法，其主要步骤为：

(1)桑叶经洗涤烘干后粉碎，过40目筛。称取桑叶粉50Kg，加入400L65％乙醇，60℃800Hz超声提取30分钟，过滤，滤渣加入200L65％乙醇，60℃800Hz超声提取30分钟，过滤，合并的滤液A，滤渣待用；

(2)滤液A加入2mol/L盐酸，调节pH＝2，减压浓缩至20L，抽滤，滤渣待用；将滤液加入100Kg717阴离子交换树脂，搅拌15分钟，闷置6小时后将放出液体，流出液加入原阴离子树脂，重复3次，加入300L水洗脱，收集流出液和洗水，浓缩至20L，得到浓缩液B；

(3)将浓缩液B以300Kg732树脂柱层析纯化上样后，纯化水洗至洗水无色，以0.5mol/L氨水洗脱，收集pH9-12段洗脱液，膜浓缩至10L。加入2mol/L盐酸，调节pH＝7；分3次加入3L氯仿萃取，保留水相、减压浓缩至6L，分6＝5次加入10L正丁醇液萃取；

(4)将正丁醇萃取液浓缩至1L，抽滤，滤渣以无水乙醇结晶，析出物溶于100ml纯化水，通过SepHdex LH-20凝胶柱层析，纯化水洗脱，以99％纯度1-脱氧野尻霉素标准品对照，收集薄层色谱Rf值和斑点颜色均一致部分，浓缩至干，得成品31.82，其中目标产物1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量98.68％。

中国专利200910167602.5公开的上述方法通过超声波提取，经由酸化，阴离子树脂柱交换，阳离子树脂柱层析纯化得洗脱液，由有机萃取剂多次萃取，结晶，浓缩干燥，得到较高纯度的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。但该方法大量且多次的使用了氯仿以及正丁醇等有毒有机溶剂，而有毒溶剂难以去除，非常容易混入最终产品中，使该方法存在着加重环保负担，终产品毒性不确定，产品安全性难以得到保证的缺陷；且提取率较低，仅约为0.06％。

综上，现有提取1-DNJ的方法，主要存在着产品提取率和纯度低，产品毒性较大，不利于环保的缺点，并且现有提取方法对原料要求较高，主要选用1-脱氧野尻霉素含量较高的桑叶或桑皮部分，未能对桑树的其它部位或蚕桑废弃物加以利用；进一步的，现有提取方法对原料的利用率极低，未能将附加值产品得到充分利用，对资源造成了较大浪费。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中所存在的产品提取率和纯度低、产品毒性大的不足，提供一种提取率高、产品安全、利于环保的高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括如下步骤：

(1)原料预处理：取桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蚕桑废弃物，经由干燥后粉碎，得原料粉末；

(2)酶解浸提：向原料粉末加入8-12倍重量水，升温至45-60℃后，加入原料粉末重量0.5％-1％的组合酶，保温，酶解浸提8-12小时，过滤，得滤液；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3-5∶2-4∶1；

(3)调节浸提滤液pH值为4-5，得酸化滤液；

(4)将酸化滤液上强酸性阳离子树脂柱，用2-4倍树脂体积量的纯化水冲洗，收集得到水洗液，然后用2-4倍树脂柱体积量的0.1-0.5mol/L氨水进行洗脱，收集pH＝9-12的洗脱液，得到氨水洗脱液；

(5)将氨水洗脱液经过纳滤膜(200D)进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜蒸发器浓缩器除氨后得到浓缩液；

(6)将浓缩液经过弱酸性阴离子树脂柱进行柱层析，使用浓度为0.1-0.5mol/L氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，得成品。

本发明所述蚕桑废弃物可以是喂养蚕结束后的桑叶，或蚕的排泄物(蚕砂)等。

为了提高上述提取方法对目标产物的提取率和提取效率，上述步骤(2)所述组合酶的成分及其重量比优选为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝4∶3∶1。

为了进一步提高上述提取方法对目标产物的提取率和提取效率，上述步骤(2)中组合酶的用量优选为0.6-0.8％，以0.7％为最佳。

上述步骤(2)中水的用量优选为10倍原料粉末重量。

为了充分利用原料，并为了提高上述提取方法对目标产物的提取率，上述步骤(2)优选对原料粉末进行两次酶解浸提。

为了在上述步骤(6)柱层析前对酸化滤液充分除杂，降低上述步骤(5)中纳米滤膜负荷，利于上述步骤(6)中层析分离的进行，提高目标产物纯度，上述步骤(4)中的强酸性阳离子交换树脂，优选使用苯乙烯系大孔型阳离子交换树脂，如D001大孔强酸性阳离子交换树脂、D-101大孔强酸性阳离子交换树脂或HD-8，以D001大孔强酸性阳离子交换树脂为最佳。

为了使上述步骤(6)中层析分离效果佳，进一步提高目标产物纯度，上述步骤(6)中的弱酸性大孔阳离子树脂柱使用的树脂优选D151、D152或D113弱酸性大孔阳离子树脂，其中以D152弱酸性大孔阳离子树脂为最佳。

上述步骤(1)中粉碎原料后，优选过10-40目筛。

上述提取方法中干燥优选使用烘箱干燥、真空干燥或者喷雾干燥，以烘箱干燥为最佳。

为了充分利用原料，从原料中提取高附加值产品桑叶多糖，上述高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法优选将步骤(4)中收集的水洗液浓缩加入4-8倍浓缩液体积量的乙醇，所述乙醇的浓度在95％以上，通过在5℃条件下静置6-24h、析出沉淀、过滤沉淀的沉淀方法，得到桑叶多糖沉淀；用2倍所述桑叶多糖沉淀重量的水溶解，加入5％水溶液重量的活性碳脱色，过滤，向滤液中加入4-8倍体积量的95％乙醇，离心过滤，真空干燥，粉碎，得到灰白色桑叶多糖粉末。所述沉淀方法可以用离心分离、絮凝沉淀、常压过滤或者减压过滤替代。

上述步骤(2)中所述过滤，优选采用离心过滤。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法采用酶解手段，选用利于桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蚕桑废弃物原料酶解的酶进行复配得组合酶，并与本发明除杂、纯化等技术特征的有机结合，使得本发明提取方法具有如下优点：

1、极大程度上提高了1-脱氧野尻霉素的提取率和提取效率，提取率不低于0.1％；

2、本发明提取方法环保无污染，在酶解和纯化过程中使用具有安全、环保无污染优点的酶和水，不仅利于环保，而且提高了产品质量安全；

3、本发明方法目标产物1-脱氧野尻霉素纯度高，高于98％；

4、本发明方法在1-脱氧野尻霉素的提取过程中，还对桑叶多糖进行了分离提纯，本发明方法通过对多组分的逐步提取，不但能够有效提高1-脱氧野尻霉素的纯度，同时还得到了高附加值的桑叶多糖，充分利用了原料，减少了提取后废弃物并降低了环保负担；并且，分离提取得到的桑叶多糖纯度高，经检测多糖含量高于80％，应用价值高。

附图说明

图1为实施例1一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法流程图。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括如下步骤：

1.原料预处理：取桑枝经由干燥后粉碎，过40目筛，得到提取用原料粉末；

2.酶解浸提：

(1)向原料粉末加入8倍重量的水，升温至47±2℃后，加入原料粉末重量0.5％的组合酶，保温，酶解浸提8小时，然后经过离心过滤得到滤渣和滤液；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3∶2∶1；

(2)对滤渣重复酶解浸提，操作同步骤(1)，过滤；

(3)合并步骤(1)和步骤(2)两次浸提滤液；

3.浸提滤液用离心机离心除渣后用酸调节PH值为4-5；

4.将经过酸化后的滤液上强酸性阳离子树脂柱，纯化水冲洗3倍树脂体积，收集得到水洗液，然后用3倍树脂柱体积的0.2mol/L的氨水进行洗脱，收集PH＝9-12的部分，得到氨水洗脱液；

5.纯化水洗液浓缩后加入相当于其体积5倍体积的乙醇，5℃条件下静置过夜，析出沉淀，然后离心过滤沉淀，得到桑叶多糖沉淀，多糖用2倍体积水溶解，加入5％活性碳脱色，过滤，滤液加入5倍体积95％乙醇，过滤多糖沉淀，真空干燥，粉碎，得到灰白色多糖粉末，经检测(硫酸-苯酚法)多糖含量为85％；

6.将氨水洗脱液经过纳滤膜进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜蒸发器浓缩后得到浓缩液；

7.将浓缩液经过弱酸性阳离子树脂柱进行柱层析，用浓度为0.2mol/L的氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，得成品；经HPLC检测，目标产物1-脱氧野尻霉素含量为98.5％，提取率为0.21％。

本例步骤7中使用的标准品购于Sigma-Aldrich公司生产的1-Deoxynojirimycin(1-DNJ)试剂。

实施例2

一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括如下步骤：

1.原料预处理：取桑叶经由干燥后粉碎，过40目筛，得到提取用原料粉末；

2.酶解浸提：向原料粉末加入12倍重量的水，升温至58±2℃后，加入原料粉末重量0.8％的组合酶，保温，酶解浸提10小时，然后经过离心过滤得浸提滤液；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝5∶4∶1；

3.浸提滤液用离心机离心除渣后用酸调节PH为4-5；

4.将经过酸化后的滤液上强酸性阳离子树脂柱，纯化水冲洗4倍树脂体积，收集得到水洗液，然后用4倍树脂柱体积的0.1mol/L的氨水进行洗脱，收集PH＝9-12的部分，得到氨水洗脱液；

5.水洗液浓缩后中入相当于其体积4倍体积的乙醇，5℃条件下静置过夜，析出沉淀，然后过滤沉淀，得到桑叶多糖沉淀，多糖用2倍体积水溶解，加入5％活性碳脱色，过滤，滤液加入4倍体积95％乙醇，过滤多糖沉淀，真空干燥，粉碎，得到灰白色多糖粉末，经检测(硫酸-苯酚法)多糖含量为81％；

6.将氨水洗脱液经过纳滤膜(200D)进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜浓后得到浓缩液；

7.将浓缩液经过弱酸性阳离子树脂柱进行柱层析，用浓度为0.1mol/L的氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品(与实施例1相同)对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，得成品；经HPLC检测，目标产物1-脱氧野尻霉素含量为98.2％，提取率为0.12％。

实施例3

一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括如下步骤：

1.原料预处理：取蚕桑废弃物(蚕砂)经由干燥后粉碎，过30目筛，得到提取用原料粉末；

2.酶解浸提：

(1)向原料粉末加入10倍重量的水，升温至55±2℃后，加入原料粉末重量0.5％的组合酶，保温，酶解浸提12小时，然后经过离心过滤得浸提滤液；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝4∶3∶1；

(2)对滤渣重复酶解浸提，操作同步骤(1)，过滤；

(3)合并步骤(1)和步骤(2)两次浸提滤液；

3.浸提滤液用离心机离心除渣后用酸调节PH为4-5；

4.将经过酸化后的滤液上强酸性阳离子树脂柱，纯化水冲洗3倍树脂体积，收集得到水洗液，然后用3倍树脂柱体积的0.5mol/L的氨水进行洗脱，收集PH＝9-12的部分，得到氨水洗脱液；

5.水洗液浓缩后中入相当于其体积8倍体积的乙醇，5℃条件下静置过夜，析出沉淀，然后过滤沉淀，得到桑叶多糖沉淀，多糖用2倍体积水溶解，加入5％活性碳脱色，过滤，滤液加入8倍体积95％乙醇，过滤多糖沉淀，真空干燥，粉碎，得到灰白色多糖粉末，经检测(硫酸-苯酚法)多糖含量为83％；

6.将氨水洗脱液经过纳滤膜(200D)进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜蒸发器浓缩后得到浓缩液；

7.将浓缩液经过弱碱性阴离子树脂柱进行柱层析，用浓度为0.5mol/L的氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品(与实施例1相同)对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，得成品；经HPLC检测，目标产物1-脱氧野尻霉素含量为98.5％，提取率为0.15％。

Claims

1.一种1-脱氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)酶解浸提：向原料粉末加入8-12倍重量水，升温至45-60℃后，加入原料粉末重量0.5％-1％的组合酶，保温，酶解浸提8-12小时，过滤；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3-5∶2-4∶1；

(3)调节浸提滤液pH值为4-5，得酸化滤液；

(4)将酸化滤液上强酸性阳离子树脂柱，用2-4倍树脂体积量的纯水冲洗，收集得到水洗液，然后用2-4倍树脂柱体积量的0.1-0.5mol/L氨水进行洗脱，收集pH＝9-12的洗脱液，得到氨水洗脱液；

(5)将氨水洗脱液经过纳滤膜进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜蒸发器浓缩后得到浓缩液；

(6)将浓缩液经过弱酸性阳离子树脂柱进行柱层析，用浓度为0.1-0.5mol/L的氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，得成品。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝4∶3∶1。

3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述组合酶的用量为0.6-0.8％。

4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述组合酶的用量为0.7％。

5.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中水的用量为10倍原料粉末重量。

6.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中对原料粉末进行两次酶解浸提。

7.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述强酸性阳离子树脂柱为D001、D-101或HD-8强酸性阳离子树脂。

8.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(6)中所述弱酸性阳离子树脂柱为D151、D152或D113弱酸性阳离子树脂。

9.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中粉碎原料后，过10-40目筛，得原料粉末。