CN111346118A - 一种亚临界水提取和分离灵芝三萜提取物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种使用亚临界技术提取和分离灵芝三萜提取物的方法:将灵芝经过亚临界水提取技术,采用不同压力和温度条件,依次将灵芝中的活性成分:灵芝三萜酸性部位和灵芝三萜中性部位从灵芝子实体中提取并分离出来。本发明利用亚临界水提取技术高效和经济的得到灵芝中的不同活性提取物。所得活性提取物中灵芝三萜酸性部位DPPH清除率的抗氧化活性可达到88.38%,灵芝三萜中性部位对人的大细胞肺癌细胞H460的半抑制率IC50为95.0μg/ml,对人肝癌细胞HepG2的半抑制率IC50为77.7μg/ml。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取和食药用菌领域,涉及灵芝的加工利用技术领域,具体涉及一种亚临界水提取和分离灵芝三萜类活性提取物的方法
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)为多孔菌科真菌灵芝中的一种(中国药典2015版一部),味甘性平,扶正固本,主要活性成分为灵芝多糖和灵芝三萜,灵芝三萜具有抗氧化,增强免疫力,抗肿瘤,保肝等多种药理功效。灵芝三萜分为酸性部位和中性部位,其中酸性部位包含已有大量文献报道的灵芝酸A等五环三萜酸物质。中性部位包含目前较少研究的灵芝酮三醇等甾醇类物质。
目前对于灵芝(灵芝三萜)的加工利用仅限于乙醇提取等传统提取方法,方法简单,较为安全,但是传统提取方法耗时较长,提取效率低,成本较高,一般提取率为5~6%,灵芝三萜含量15~20%(以熊果酸或齐墩果酸计),也未有报道检测其中灵芝三萜酸性部位和灵芝三萜中性部位成分含量。
已有报道使用超声、酶解等辅助手段提取灵芝,但都仅限于优化传统提取方法,提取效率提升有限。
亦有报道使用超临界二氧化碳萃取技术提取灵芝中三萜活性成分,但二氧化碳不溶于水,超临界物料需事先干燥脱水,增加成本;超临界二氧化碳萃取技术用于萃取低分子、低极性、亲脂性、低沸点的化合物较为理想,但对萃取极性较强、相对分子质量大的化合物则有一定困难,在实际操作中往往需要加入提携剂来增加化合物的溶解度和选择性,不但增加了操作的繁琐性,也存在着有机溶剂的残留问题。超临界二氧化碳萃取灵芝三萜通常要在50Mpa以上的超高压状态下才能进行,超临界二氧化碳设备价格较高,流体又需要制冷液化,设备制造和运行成本较高。
CN102898539“一种使用亚临界水提取灵芝多糖的方法”使用的提取温度(100~200℃)和压力(1~20Mpa)范围过宽,导致提取产物成分复杂,需经过超滤,除蛋白,醇沉步骤得到灵芝多糖,且提取时间(10~80min)较长。未充分发挥亚临界水提取的高效特性。未说明其得到的灵芝多糖纯度和药理活性。邓辰辰等人(“亚临界水提取灵芝多糖的工艺研究”,邓辰辰等,河南工业大学学报(自然科学版),2016,37(2):105~108)虽然对亚临界水提取灵芝多糖的条件进行优化,但仍需经过超滤,除蛋白,醇沉步骤得到灵芝多糖,步骤繁琐,也未说明其得到的灵芝多糖纯度和药理活性。
徐瑞聆等人(“亚临界水提取灵芝子实体中灵芝酸类成分的工艺优化”,徐瑞聆等,华西药学杂志,2019,34(4):393~395)对亚临界提取灵芝酸类(即灵芝三萜酸性部位)成分进行优化,但其液相检测条件是以灵芝酸A和灵芝酸C2作为对照品,仅仅检测灵芝酸A和灵芝酸C2的总含量,由于它们在灵芝酸的酸性部位的占比过小,不易体现灵芝酸复杂性;由于也未对灵芝三萜中性部位进行检测,就难以真实反映亚临界提取灵芝三萜成分的提取率。同时也未说明其得到的灵芝三萜酸的纯度和药理活性。
发明内容
本发明目的在于克服传统提取和超临界提取灵芝中存在的缺陷,提供一种亚临界水提取和分离灵芝三萜提取物的方法,能使用水作为提取溶剂从灵芝中高效快速的提取出灵芝三萜的酸性部位和中性部位,从而得到纯度较高的提取物,经药理实验发现其具有良好的抗氧化活性和抑制肿瘤细胞生长活性。
本发明所采用的技术方案为一种亚临界水提取和分离灵芝三萜活性提取物的方法,其灵芝活性提取物是由如下步骤制得:
1将灵芝子实体粉碎,得到灵芝颗粒;
2将步骤1灵芝颗粒,加水,在第一恒定的亚临界压力和温度下提取,过滤,加水冲洗,合并得到滤液Ⅰ;滤液Ⅰ经浓缩,乙醇醇沉,离心,上清液浓缩干燥后得到灵芝三萜酸性部位;
3将步骤2提取后的灵芝颗粒,加水,在第二恒定的亚临界压力和温度下提取,过滤,加水冲洗,合并得到滤液Ⅱ;滤液Ⅱ经浓缩,乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯层浓缩干燥后得到灵芝三萜中性部位。
具体参数为:
所述步骤1的灵芝颗粒粒度为40~60目;
所述步骤2中所述的灵芝颗粒与提取时的水的重量比为1:10,所述的第一恒定的亚临界压力和温度的压力为5MPa,温度为170~190℃,提取时间10min,灵芝颗粒与冲洗时的水的重量比为1:10,滤液Ⅰ经浓缩后相对密度25℃时为1.00~1.10,乙醇浓度为95%,醇沉终浓度为70%,离心时分离因数6000~8000,上清液的浊度为100NTU以下。本发明的提取时间短,提取时间仅10min,生产效率高。
所述步骤3中所述的灵芝颗粒与提取时的水的重量比为1:10,所述的第二恒定的亚临界压力和温度的压力为8Mpa,温度为240~260℃,提取时间10min,灵芝颗粒与冲洗时的水的重量比为1:10,滤液Ⅱ经浓缩后相对密度25℃时为1.10~1.20,浓缩液与乙酸乙酯体积比为1:1,萃取次数3次。本发明的提取时间短,提取时间仅10min,生产效率高。
所述步骤2中所得的灵芝三萜酸性部位含量达到25%以上,DPPH清除率的抗氧化活性可达到88.38%,活性高于灵芝醇提取物。
所述步骤3中所得的灵芝三萜中性部位物质含量达到14%以上,对人大细胞肺癌细胞H460的半抑制率IC50为95.0μg/ml,对人肝癌细胞HepG2的半抑制率IC50为77.7μg/ml。
所述的灵芝为多孔菌科真菌灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)的干燥子实体;
所述的水为洁净水,乙醇为95%食用级乙醇,乙酸乙酯为分析纯试剂,纯度99.9%以上。
所述步骤2的灵芝三萜酸性部位的灵芝三萜酸类物质含量是以液相色谱进行检测,以灵芝酸A作为对照品,一测多评法计算12种灵芝三萜酸的总量得到的,其12种灵芝三萜酸峰面积占图谱内所有灵芝三萜酸峰面积的70%以上;抗氧化活性以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)清除率计算。
所述步骤3的灵芝三萜中性部位的灵芝甾醇类物质含量是以液相色谱进行检测,以灵芝酮三醇作为对照品,峰面积归一化法计算图谱内所有灵芝的酮醇醛类的总量;肿瘤细胞株系为人大细胞肺癌细胞H460和人肝癌细胞HepG2。
本发明通过亚临界水提取和分离灵芝三萜活性提取物,使用水作为提取溶剂从灵芝中高效快速的提取出灵芝三萜的酸性部位和中性部位,得到纯度较高的提取物,工艺过程简单,省时、提取效率高,成本较低,经药理实验发现其具有良好的抗氧化活性和抑制肿瘤细胞生长活性。
附图说明
图1灵芝酸A对照品液相谱图
图2灵芝三萜酸性部位供试品液相谱图
图3灵芝酮三醇对照品液相谱图
图4灵芝三萜中性部位供试品液相谱图
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明,以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制,在不背离本发明的精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换,均属于本发明的范围。
一种亚临界水提取和分离灵芝三萜提取物的方法,所述的亚临界水提取技术为:常温常压下,水是极性很大的溶剂,它能很好地溶解极性化合物,但对低极性化合物的溶解性很低。将水加热至沸点以上,临界点以下,并控制系统压力使水保持为液态,这种状态的水被称为亚临界水。水的临界压力是22.4MPa,临界温度是374℃,低于上述临界压力和(或)临界温度,水体仍然保持在液体状态,为本发明所述的亚临界水。亚临界水的物理、化学特性与常温常压下的水有较大差别,随着水温升高,大量的氢键结构开始断裂,使得亚临界水的极性降低,它的介电常数ε会下降,25℃的ε=80,温度升高到250℃的ε=27,与乙醇ε=24(25℃)的介电常数非常接近,因此许多弱极性物质都能溶解到亚临界水中。因此通过调节亚临界水的温度和压力,使水的极性在较大范围内变化,就可以选择性地提取不同种类的植物有效成分,也可以实现植物有效成分从水溶性成分到脂溶性成分的连续提取。由于亚临界水提取是以价廉、无污染的水作为萃取剂,而且具有较好的渗透与溶解能力,因此,亚临界水提取技术是一种绿色、无毒、安全、高效的提取分离技术,被视为绿色环保、前景广阔的一项高新技术。
本发明的灵芝活性提取物是由如下步骤制得:
1.将干燥的灵芝子实体粉碎,得到40~60目的灵芝颗粒;
2.将灵芝颗粒,加10倍重量水,在5Mpa的压力和170~190℃温度下,提取时间10min,过滤,加10倍重量水冲洗,合并得到滤液Ⅰ;滤液Ⅰ经浓缩后相对密度为1.00~1.10(25℃),加入95%乙醇醇沉,醇沉终浓度为70%,离心,离心时分离因数6000~8000,上清液的浊度为100NTU以下,上清液浓缩干燥后得到灵芝三萜酸性部位;
3.将步骤2提取后的灵芝颗粒,加10倍重量水,在8Mpa的压力和240~260℃温度下提取10min,过滤,加10倍重量水冲洗,合并得到滤液Ⅱ;滤液Ⅱ经浓缩后相对密度为1.10~1.20(25℃),加1倍体积的乙酸乙酯萃取,萃取次数3次,乙酸乙酯层浓缩干燥后得到灵芝三萜中性部位。
经提取实验和含量检测验证,当亚临界提取压力高于5Mpa,温度高于160℃时,能从灵芝中提取到灵芝多糖含量缓慢下降,灵芝三萜酸性部位含量缓慢下降;当亚临界提取压力高于8Mpa,温度高于240℃时,灵芝三萜中性部位含量明显上升。
经药理活性检测验证,当亚临界提取压力高于5Mpa,温度高于160℃时,能从灵芝中提取到的灵芝多糖药理活性接近于无,灵芝三萜酸性部位的药理活性超过常压醇提物中的灵芝三萜酸性部位;当亚临界提取压力高于8Mpa,温度高于240℃时,灵芝三萜中性部位药理活性接近常压醇提物中的灵芝三萜中性部位。
具体实施例1
1.将灵芝子实体粉碎,取40~60目的灵芝颗粒1kg;
2.将灵芝颗粒,加10kg重量水,在5Mpa的压力和170℃温度下提取10min,过滤,加10kg水冲洗,合并得到滤液Ⅰ;滤液Ⅰ经浓缩后在25℃时相对密度为1.00~1.10,加入95%乙醇醇沉,醇沉终浓度为70%,离心,离心时分离因数6000~8000,上清液的浊度为100NTU以下,上清液浓缩干燥后得到灵芝三萜酸性部位(样品1);灵芝三萜酸性部位含量达到29.2%。沉淀物干燥后得到灵芝多糖部位(样品5);
3.将步骤2提取后的灵芝颗粒,加10kg水,在8Mpa的压力和240℃温度下提取10min,过滤,加10kg水冲洗,合并得到滤液Ⅱ;滤液Ⅱ经浓缩后相对密度为1.10~1.20(25℃),加1倍体积的乙酸乙酯萃取,萃取次数3次,乙酸乙酯层浓缩干燥后得到灵芝三萜中性部位(样品9),灵芝三萜中性部位物质含量达到14.4%;总时长20min。
具体实施例2
1.将灵芝子实体粉碎,取40~60目的灵芝颗粒1kg;
2.将灵芝颗粒,加10kg重量水,在5Mpa的压力和180℃温度下提取10min,过滤,加10kg水冲洗,合并得到滤液Ⅰ;滤液Ⅰ经浓缩后相对密度为1.00~1.10(25℃),加入95%乙醇醇沉,醇沉终浓度为70%,离心,离心时分离因数6000~8000,上清液的浊度为100NTU以下,上清液浓缩干燥后得到灵芝三萜酸性部位(样品2),灵芝三萜酸性部位含量达到28.2%;沉淀干燥后得到灵芝多糖部位(样品6);
3.将步骤2提取后的灵芝颗粒,加10kg水,在8Mpa的压力和250℃温度下提取10min,过滤,加10kg水冲洗,合并得到滤液Ⅱ;滤液Ⅱ经浓缩后相对密度为1.10~1.20(25℃),加1倍体积的乙酸乙酯萃取,萃取次数3次,乙酸乙酯层浓缩干燥后得到灵芝三萜中性部位(样品10),灵芝三萜中性部位物质含量达到21.6%;总时长20min。
具体实施例3
1.将灵芝子实体粉碎,取40~60目的灵芝颗粒1kg;
2.将灵芝颗粒,加10kg重量水,在5Mpa的压力和190℃温度下提取10min,过滤,加10kg水冲洗,合并得到滤液Ⅰ;滤液Ⅰ经浓缩后相对密度为1.00~1.10(25℃),加入95%乙醇醇沉,醇沉终浓度为70%,离心,离心时分离因数6000~8000,上清液的浊度为100NTU以下,上清液浓缩干燥后得到灵芝三萜酸性部位(样品3),灵芝三萜酸性部位含量达到25.5%;沉淀干燥后得到灵芝多糖部位(样品7);
3.将步骤2提取后的灵芝颗粒,加10kg水,在8Mpa的压力和260℃温度下提取10min,过滤,加10kg水冲洗,合并得到滤液Ⅱ;滤液Ⅱ经浓缩后相对密度为1.10~1.20(25℃),加1倍体积的乙酸乙酯萃取,萃取次数3次,乙酸乙酯层浓缩干燥后得到灵芝三萜中性部位(样品11),灵芝三萜中性部位物质含量达到23.2%;总时长20min。
对比物制作:
样品4是灵芝醇提取物:取相同的40~60目1kg的灵芝颗粒,将灵芝颗粒,加10kg95%乙醇,在常压和80℃温度下提取2h,过滤,加10kg95%乙醇重复提取1次,过滤,合并得到滤液Ⅲ;滤液Ⅲ经浓缩干燥后得到灵芝醇提取物。总时长4h,灵芝多糖含量为0.0%,灵芝三萜酸性部位物质含量为13.2%,灵芝三萜中性部位含量为30.3%。
样品8是灵芝水提取物:取相同的40~60目1kg的灵芝颗粒,将灵芝颗粒,加10kg水,在常压和100℃温度下提取2h,过滤,加10kg水重复提取1次,过滤,合并得到滤液Ⅳ;滤液Ⅳ经浓缩干燥后得到灵芝水提取物。总时长4h,灵芝多糖含量为20.2%,灵芝三萜酸性部位物质含量为1.1%,灵芝三萜中性部位含量为0.0%。
实验检测例1:灵芝三萜酸性部位的HPLC检测
对照品的制备:精密称取适量灵芝酸A对照品,加入甲醇定容,配制成0.25mg/ml的对照品溶液,过0.45μm有机滤膜,制得对照品样品,灵芝酸A对照品液相谱图见图1,其中S为灵芝酸A。
供试品的制备:精密称取具体实施例1~3中的灵芝三萜酸性部位作为样品1~3,灵芝醇提取物作为样品4,灵芝水提取物作为样品8,各0.25g,加入100ml甲醇超声30min,滤过,滤液旋蒸干,加入甲醇溶解,定容25ml,过0.45μm有机滤膜,制得样品1~4,灵芝三萜酸性部位供试品液相谱图见图2,其中的标号:1.灵芝酸C2,2.灵芝酸G,3.灵芝烯酸B,4.灵芝酸B,5.灵芝酸LM2,S.灵芝酸A,6.灵芝酸H,7.赤芝酸A,8.灵芝烯酸D,9.灵芝酸C,10.灵芝酸D,11.灵芝酸F。
液相色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈为流动相A,0.04%甲酸水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波长257nm;柱温为30℃;流速1.0mL/min。理论塔板数按灵芝酸A峰计算应不低于10000。
表1流动相运行梯度条件
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,测定,以一测多评法计算。
根据所得对照品和供试品的峰面积,分别计算出被测定供试品溶液中各三萜的含量,灵芝三萜的含量以12种三萜的含量之和计。供试品中各三萜含量以质量分数W计,数值以%表示,按公式(E.1)计算。
表2相对校正因子表F
式中:
W—样品中灵芝三萜的含量,%;
Ax—样品中相关被分析物峰面积;
As—对照品溶液灵芝酸A峰面积;
Cs—对照品溶液中灵芝酸A浓度(mg/mL);
F—相对校正因子;
V—供试品溶液体积(mL);
M—用于制备供试品溶液的灵芝提取物质量(mg);
检测结果:
表3灵芝三萜酸性部位结果
结论:以本发明方法制作的灵芝三萜酸性部位含量高,是灵芝醇提取物的两倍以上,温度高于160℃时,灵芝三萜酸性部位含量缓慢下降,但含量仍高于灵芝醇提物,灵芝水提取物中灵芝三萜酸性部位的含量极少。
实验检测例2:灵芝多糖部位的紫外分光光度法检测
对照品溶液的制备:取无水葡萄糖对照品适量,精密称定,加水制成每lml含0.12mg的溶液,即得。
标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml,分别置10ml具塞试管中,各加水至2.0ml,迅速精密加入硫酸蔥酮溶液(精密称取蔥酮0.lg,加硫酸100ml使溶解,摇匀)6rnl,立即摇匀,放置15分钟后,立即置冰浴中冷却15分钟,取出,以相应的试剂为空白,照紫外-可见分光光度法在625nm波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
供试品溶液的制备:精密称取具体实施例1~3中的灵芝多糖部位作为样品5~7和灵芝水提取物作为样品8,用水5ml溶解,边搅拌边缓慢滴加乙醇75ml,摇匀,在4C放置12小时,离心,弃去上清液,沉淀物用热水溶解并转移至50ml量瓶中,放冷,加水至刻度,摇匀,取溶液适量,离心,即得。测定法精密量取供试品溶液2ml,置10ml具塞试管中,照标准曲线制备项下的方法,自“迅速精密加入硫酸蔥酮溶液6ml”起,同法操作,测定吸光度,从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量,计算,即得。
检测结果:
表4灵芝多糖部位结果
结论:温度为160℃时,灵芝多糖含量为灵芝水提取物的72.5%(14.5/20.2),高于160℃时,灵芝多糖部位的多糖含量缓慢下降,灵芝醇提物中不含灵芝多糖。
实验检测例3:灵芝三萜中性部位的HPLC检测
对照品的制备:精密称取适量灵芝酮三醇对照品,加入乙酸乙酯定容,配制成0.25mg/ml的对照品溶液,过0.45μm有机滤膜,制得对照品样品,灵芝酮三醇对照品液相谱图见图3,其中T为灵芝酮三醇。
供试品的制备:精密称取具体实施例1~3中的灵芝三萜中性部位作为样品9~11,灵芝醇提取物做为样品4,灵芝水提取物做为样品8,各0.25g,加入100ml乙酸乙酯超声30min,过滤,滤液旋蒸干,加入乙酸乙酯溶解,定容25ml,过0.45μm有机滤膜,制得液相色谱上机样品9~12,灵芝三萜中性部位供试品液相谱图见图4,其中T为灵芝酮三醇。
液相色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm,5μm);以甲醇为流动相A,0.5%乙酸水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波长243nm;柱温为30℃;流速1.0mL/min。理论塔板数按灵芝酮三醇峰计算应不低于10000。
表5流动相运行梯度条件
测定法:分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,测定,以峰面积归一化法计算。
根据所得对照品和供试品的峰面积,分别计算出被测定供试品溶液中所有酮醇类物质的含量,含量以质量分数W计,数值以%表示,按公式(E.2)计算。
式中:
W—样品中灵芝酮醇类的含量,%;
Ax—样品中被分析物峰面积;
As—对照品溶液灵芝酮三醇峰面积;
Cs—对照品溶液中灵芝酮三醇浓度(mg/mL);
V—供试校品溶液体积(mL);
M—用于制备供试品溶液的灵芝提取物质量(mg);
检测结果:
表6灵芝三萜中性部位结果
结论:灵芝三萜中性部位含量随温度升高而增加,逐渐接近灵芝醇提取物。温度为260℃时,灵芝多糖含量为灵芝水提取物的76.6%(23.2/30.3),灵芝水提取物中灵芝三萜中性部位含量为0。
实验检测例4:灵芝三萜酸性部位DPPH自由基清除能力检测
DPPH自由基清除能力的测定:将样品1~4用无水乙醇稀释1、2、3、4、5倍,取稀释后的样品溶液500μL,加入1500μL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液,摇匀,室温反应30min后于517nm测定吸光值,DPPH自由基清除率通过公式计算:
式中:As为样品溶液吸光值;Ac为乙醇(空白,代替样品溶液)的吸光值。
表7灵芝三萜酸性部位抗氧化活性
结论:灵芝三萜酸性部位抗氧化活性远高于灵芝醇提取物。最高为88.38%,最高可达灵芝乙醇提取物的10.59倍(77.42/7.31)。
实验检测例5:灵芝多糖部位DPPH自由基清除能力检测
DPPH自由基清除能力的测定:将样品5~8用水稀释1、2、3、4、5倍,取稀释后的样品溶液500μL,加入1500μL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液,摇匀,室温反应30min后于517nm测定吸光值,DPPH自由基清除率通过公式计算:
式中:As为样品溶液吸光值;Ac为乙醇(空白,代替样品溶液)的吸光值。
表8灵芝多糖部位抗氧化活性
结论:灵芝多糖部位抗氧化活性低于灵芝水提取物。
实验检测例6:灵芝三萜中性部位半数抑制率IC50检测
实验材料:按本方法实施例3制备的灵芝三萜中性部位样品11和灵芝醇提取物样品4,用乙酸乙酯溶解,离心,取上清,制备成不同浓度的乙酸乙酯溶液。
实验方法:取对数生长期的人大细胞肺癌细胞H460,人肝癌细胞HepG2细胞以2000~4000个/孔的细胞数接种于96孔板中,每孔180μL细胞液,置于37℃5%CO2饱和湿度培养箱中培养过夜,细胞完全贴壁后,加入20μL不同浓度上述实验材料,每个浓度3个复孔,放培养箱继续培养72h;药物作用72h后,每孔加入20μL 5mg/mL的MTT,继续培养4h;弃去培养基,加入150μL DMSO,室温震荡10min,待结晶完全溶解,用酶标仪570nm波长测定OD值,计算出各组分对细胞的IC50,对人大细胞肺癌细胞H460的半抑制率IC50为95.0μg/ml,对人肝癌细胞HepG2的半抑制率IC50为77.7μg/ml;
表8对不同癌细胞的半抑制率IC50
结论:灵芝中性部位的半数抑制率为灵芝醇提取物的2.09和1.42倍。
本发明提取时间短,提取两次,每次10min,总时长20min,而目前的灵芝水提取物和灵芝醇提物也是提取两次,每次2h,总时长4h。本提取物中灵芝各种有效含量丰富:灵芝三萜酸性部位含量高,是常规灵芝醇提取物的两倍以上,且灵芝三萜酸性部位抗氧化活性高于灵芝的常规乙醇提取物;灵芝三萜中性部位含量随温度升高而增加,逐渐接近灵芝醇提取物;灵芝多糖含量虽不及灵芝水提取物,但也有灵芝水提取物一半以上。而灵芝水提取物中灵芝三萜酸性部位的含量极少,不到本发明的十分之一,灵芝水提取物中灵芝三萜中性部位含量为0。灵芝醇提物中灵芝多糖的含量为0。
Claims (6)
1.一种亚临界水提取和分离灵芝三萜提取物的方法,其特征在于:灵芝三萜提取物是由以下步骤提取分离得到的:
1.1 将灵芝子实体粉碎,得到灵芝颗粒;
1.2 将1.1灵芝颗粒,加水,在第一恒定的亚临界压力和温度下提取,过滤,加水冲洗,合并得到滤液Ⅰ;滤液Ⅰ经浓缩,乙醇醇沉,离心,上清液浓缩干燥后得到灵芝三萜酸性部位;
1.3 将1.2提取后的灵芝颗粒,加水,在第二恒定的亚临界压力和温度下提取,过滤,加水冲洗,合并得到滤液Ⅱ;滤液Ⅱ经浓缩,乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯层浓缩干燥后得到灵芝三萜中性部位。
2.根据权利要求1所述的一种亚临界水提取和分离灵芝三萜提取物的方法,其特征在于:步骤1.1中所述的灵芝颗粒粒度为40~60目。
3.根据权利要求1所述的一种亚临界水提取和分离灵芝三萜提取物的方法,其特征在于:
步骤1.2中所述的灵芝颗粒与提取时的水的重量比为1:10,所述的第一恒定的亚临界压力和温度的压力为5MPa,温度为170~190℃,提取时间10 min,灵芝颗粒与冲洗时的水的重量比为1:10,滤液Ⅰ经浓缩后相对密度25℃时为1.00~1.10,乙醇浓度为95%,醇沉终浓度为70%,离心时分离因数6000~8000,上清液的浊度为100 NTU以下。
4.根据权利要求1所述的一种亚临界水提取和分离灵芝三萜提取物的方法,其特征在于:
步骤1.3中所述的灵芝颗粒与提取时的水的重量比为1:10,所述的第二恒定的亚临界压力和温度的压力为8Mpa,温度为240~260℃,提取时间10min,灵芝颗粒与冲洗时的水的重量比为1:10,滤液Ⅱ经浓缩后相对密度25 ℃时为1.10~1.20,浓缩液与乙酸乙酯体积比为1:1,萃取次数3次。
5.根据权利要求1所述的一种亚临界水提取和分离灵芝三萜活性提取物的方法,其特征在于:步骤1.2中所得的灵芝三萜酸性部位含量达到25%以上,DPPH清除率的抗氧化活性可达到88.38%。
6.根据权利要求1所述的一种亚临界水提取和分离灵芝三萜活性提取物的方法,其特征在于:步骤1.3中所得的灵芝三萜中性部位物质含量达到14%以上,对人大细胞肺癌细胞H460的半抑制率IC50为95.0μg/ml,对人肝癌细胞HepG2的半抑制率IC50为77.7μg/ml。
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