CN108586412A

CN108586412A - 一种阴离子催化水解苷类化合物的方法

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Publication number: CN108586412A
Application number: CN201810558823.4A
Authority: CN
Inventors: 肖永坤; 王东明; 栾桂花
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2018-09-28

Abstract

本发明提供了一种阴离子催化水解苷类化合物的方法，包括如下步骤：向底物苷类中加入阴离子溶液、溶剂在反应温度为30～130℃的温度下反应0.5h～24h，之后将反应产物进行纯化。本发明所述的方法以多糖基天然苷类为底物，利用阴离子对天然苷类进行动态可控地催化，生成低糖基次苷、苷元等成分。该方法操作简单，成本低，过程易于控制。纯化后的产物可应用于药品、保健品、食品及化妆品的开发。

Description

一种阴离子催化水解苷类化合物的方法

技术领域

本发明属于制备低糖基苷及苷元的方法领域，尤其是涉及一种阴离子催化水解苷类化合物的方法。

背景技术

苷类，又称为配糖体，是由非糖基的配基与与糖或糖的衍生物通过糖苷键连接而成，属于二次代谢产物。苷类物质的共性在于糖基部分，苷元部分几乎包含各类型的天然成分，如萜类、甾体、芳香类、生物碱类等。配糖体与糖结合成苷类以后，水溶性变大，稳定性变强，但是生物活性下降。苷类化合物不仅维持植物的特性与特征，而且最为重要的是苷类化合物是非常重要的药物资源，目前是天然药物化学主要的研究对象之一。

虽然苷类化合物是许多中草药的活性物质基础，但是其并不是最佳的活性结构，确切的说，天然苷类物质是前提药物，在动物口服以后，需要在消化系统中进行代谢、水解，脱去糖基以后才能发挥药效。这种在体内的代谢是在消化液、酶、肠道微生物的作用下完成的，而人体内的这种转化并不是高效的，以人参皂苷为例，仅约5％的天然皂苷能被水解掉糖基进而被吸收，其他的95％白白浪费掉。而由于天然物质的结构复杂，采用化学合成法难以实现，且化学合成法环境不友好，副产物多，后期分离困难，远没有天然来源的化合物安全。因此，为了提高人体利用率，提高药效，将天然苷类化合物在体外进行水解脱糖是开发天然药物极其重要及有效的途径。

目前常用的水解糖苷键的方法有物理法、化学法和酶解法。物理法如热解法可以对糖苷键不稳定的糖苷键进行水解，例如传统的红参加工正是利用了部分糖苷键的热不稳定性，使一小部分人参皂苷在加工过程中发生了转化，但是这种转化率极低，仅为2％左右(发明专利《高活性红参的制作方法》公开号：CN1846720A)。

化学法包括酸解、碱解以及今年来新报道的金属阳离子水解法。酸碱水解法反应条件苛刻，强酸或强碱环境，对设备具有相当严重的腐蚀性，对生态环境污染也比较大，有时还会需要高压条件，对设备要求高，这些因素都在一定程度上限制了工业上的广泛应用。

例如，发明专利《人参二醇皂苷元的制备方法》(申请公布号CN104892715A，赵树民等)公开了一种制备人参二醇皂苷元的方法，用5mol/L的氢氧化钠水溶液，在260℃条件下水解人参皂苷反应1.5小时，反应结束后将产物用95％乙醇溶解，用20％盐酸的乙醇溶液调节pH至中性，过滤，滤饼用99％以上的乙醇溶解再过滤、干燥可得人参二醇皂苷元。此方法需要260℃的高温，且用到大量的强碱强酸，而反应产物仅有皂苷元，并未涉及低糖基的次生苷。

发明专利《一种催化热解制备低极性人参皂苷及其苷元的方法》(公开号CN1508147A，中国科学院大连化学物理研究所)公开了一种以酸作为催化剂水解人参皂苷制备低极性人参皂苷及其苷元的方法，人参皂苷与催化剂的摩尔比为1:0.01～1:1，加热至110～180℃，保持0.5～10h。同样是反应条件苛刻，且大量的使用酸类催化剂难以回收重复利用，造成环境的破坏。

发明专利《金属离子催化水解天然苷类化合物的方法》(公布号CN101830965A，金凤燮等)公开了一种以金属阳离子作为催化剂催化苷类化合物的方法，此法反应温度为20～80℃，反应时间为24小时以内，可以生成低糖基次生苷。此法可转化柴胡皂苷、白头翁皂苷生成皂苷元，但是却不能将人参皂苷转化成皂苷元。

酶解法以其高效性、专一性等特点受到越来越多的重视，不同的糖基需要不同的酶。但是目前工业化生产的糖苷酶，例如淀粉酶、糖化酶、纤维素酶等是水解糖类化合物的普通糖苷键，对苷类化合物的β构型的糖苷键水解效率并不高。而近年来也有不少关于水解苷类的糖苷酶的报道，但是酶的制备增加了工业化生产的难度和成本。例如发明专利《超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷CK制备中的应用》(公布号CN104480127A，长春中医药大学)公开了一种利用基因工程的方法将超嗜热糖苷酶突变体的基因进行克隆表达，利用所产酶制备人参皂苷CK。由于酶的专一性，产物只有CK，且酶的活力较低，转化0.1％的底物，在70℃下反应12小时转化率仅67％以下。

总之，目前为止在催化天然苷类化合物生成低糖基次苷及苷元的领域中，还未有使用阴离子作为催化剂催化天然苷类化合物的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种阴离子催化水解苷类化合物的方法，利用阴离子对天然苷类进行动态可控地催化，生成低糖基次苷、苷元等成分。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种阴离子催化水解苷类化合物的方法，包括如下步骤：

向底物苷类中加入阴离子溶液、溶剂在反应温度为30～130℃的温度下反应0.5h～24h，之后将反应产物进行纯化。

优选地，所述阴离子溶液中的阴离子为OH^-、F^-、Cl^-、Br^-、I^-、SO₄ ^2-、SO₃ ^2-、S₂O₃ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-、CO₃ ^2-、HCO₃ ^-、ClO^-、ClO₄ ⁺、Ac^-、-SO₃H、C₅H₇O₅COO^-、COOH^-、Cl₃CCOO^-、CH₃CHOHCOO^-、^-OOCCH(OH)COO^-形成的盐、碱或酸中一种或几种。

优选地，所述溶剂为水、有机溶剂、一种有机溶剂的水溶液或几种有机溶剂的水溶液。

优选地，所述有机溶剂为二甲亚砜、乙二醇、甲醇、乙醇、异丙醇、环己烷、乙腈、氯仿、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、丙酮、吡啶、苯酚、异丙醇或二氯甲烷。

优选地，所述底物苷类为皂苷、黄酮苷、异黄酮苷中一种或几种的混合物。

进一步的，所述底物苷类的浓度为0.1～20％，阴离子的摩尔浓度为20mmol/L～5000mmol/L。

进一步的，所述纯化的具体操作为：将反应产物通过大孔吸附树脂柱纯化或通过有机溶剂萃取纯化。

进一步的，所述大孔吸附树脂柱纯化的具体步骤为：将反应产物直接上柱或加水稀释后上柱或减压除去有机溶剂后上柱，然后用水洗去离子和糖，再用质量分数为25～95％的乙醇洗脱吸附的苷类。达到纯化的目的。

进一步的，所述有机溶剂萃取纯化的具体步骤为：将反应产物降温后，直接与低极性有机溶剂混合萃取；或者将反应产物先除去有机溶剂，然后加水或不加水，再加入低极性有机溶剂萃取，所述低极性有机溶剂添加量为反应产物体积的0.4～1倍，萃取3～4次，合并萃取液，再加水对萃取液洗涤2～3次，最后蒸干有机溶剂可得纯化后的产物。

进一步的，所述低极性有机溶剂包括正丁醇、石油醚、乙醚、氯仿、己烷、环己烷或乙酸乙酯。

纯化后的产物可应用于药品、保健品、食品及化妆品的制备。

相对于现有技术，本发明所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法具有以下优势：

本发明所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法以多糖基天然苷类为底物，利用阴离子对天然苷类进行动态可控地催化，生成低糖基次苷、苷元等成分。该方法操作简单，成本低，过程易于控制。纯化后的产物可应用于药品、保健品、食品及化妆品的开发。

附图说明

图1为实施例1中阳离子选用Na⁺时产物的TLC图；

图2为实施例1中阳离子选用K⁺时产物的TLC图；

图3为实施例2中阴离子选用NO₃ ^-时产物的TLC图；

图4为实施例3中阴离子选用SO₄ ^2-时产物的TLC图；

图5为实施例4中阴离子选用Cl^-时产物的TLC图；

图6为实施例5中阴离子选用Cl₃CCOO^-时产物的TLC图；

图7为实施例6中阴离子选用SO4^2-时产物的TLC图；；

图8为实施例5产物纯化后的TLC图；

图9为Rb1对各细胞存活率的影响图；

图10为实施例7的纯化后产物对各细胞存活率的影响图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1

以阳离子Na⁺和K⁺为例，对比加入不同阴离子(Ac^-、CO₃ ^2-、HPO₄ ^-、PO₄ ^2-)对人参二醇皂苷催化效率的影响，以排除阳离子对催化作用的影响。二醇类人参皂苷结构如下：

实验药品：NaAc、Na₂CO₃、NaCl、K₂HPO₄、KH₂PO₄、KCl、原人参二醇皂苷(PPD)。

实验方法：配制100mg/mL的底物人参二醇皂苷PPD，加入等体积的1mol/L的上述盐溶液，也就是反应体系中的底物PPD浓度是5％，盐浓度为0.5mol/L。在80℃反应1h，然后放入冷水中迅速冷却，加入等体积的水饱和正丁醇萃取，取正丁醇层用薄层层析法(TLC)检测反应结果。

薄层层析法：切取适合尺寸的TLC板，下端划线，将样品溶液用毛细管吸取，沿线点按固定距离点在TLC板上，点好后置于事先装有适宜溶剂作为展开剂的密闭槽中。当溶剂被吸上沿板向上移动时，会带动样品中各组分向上移动，不同性质的各组分会移动不同的距离，达到分离的效果。如组分本身有颜色，即可直接观察，否则可喷显色试剂或在紫外灯下观察荧光。本次实验所用的TLC板为merck公司生产的TLC Silica Gel 60F254。展开剂为氯仿：甲醇：水＝7:3:0.5，展开以后喷洒10％的硫酸溶液然后105℃加热显色。

检测结果如图1和图2所示，由图1和图2可知，在相同的反应条件下，作为同样含有Na⁺的NaAc、Na₂CO₃和NaCl，NaAc和Na₂CO₃对底物PPD的转化率较低，而与NaAc相同摩尔浓度的NaCl对底物的转化率却高很多，即使是摩尔浓度高一倍的Na₂CO₃催化效果并不比NaCl好。与之类似的，同样含有K⁺的K₂HPO₄与KH₂PO₄对底物的催化效果明显不如相同摩尔浓度的KCl。即使是K⁺摩尔浓度高一倍的催化效果仍较低。

由此可以判断，对皂苷起催化作用的是阴离子而不是阳离子，而Cl^-对皂苷PPD的转化效果要明显好于Ac^-、CO₃ ^2-、HPO₄ ^-、PO₄ ^2-。

实施例2

检验阴离子对异黄酮苷的作用。

以大豆总异黄酮为底物，检验NO₃ ^-对异黄酮苷的水解作用。大豆总异黄酮主要含有的是大豆苷和染料木苷，水解掉糖基以后会生成对应的苷元，分别为大豆苷元和染料木素，反应过程如下：

先将2mg大豆总异黄酮溶于0.1ml乙醇，再加入0.4ml水，加入0.5ml配制好的2mol/L的Cu(NO₃)₂，使反应体系中底物大豆异黄酮的浓度为0.2％，NO₃ ^-离子浓度为2mol/L。反应温度90℃，分别于反应1h和3h时取样，薄层层析法检测反应结果。TLC展开剂为氯仿：甲醇：冰乙酸＝7：3：1，放置254nm紫外灯下荧光显色。结果如图3所示，图中“苷元”为大豆异黄酮苷元，“苷”为大豆苷，“总”为底物，“1h”是反应1h的结果，“3h”是反应3h的结果。可以看出随着反应的进行，大豆总异黄酮被NO₃ ^-逐渐水解生成了苷元。反应过程是连续化的，可以通过控制反应条件来控制反应产物。

实施例3

检验阴离子对黄酮苷的水解作用。

以芦丁为底物，SO₄ ^2-为催化剂。芦丁为3号碳上连接一个葡萄糖基和一个鼠李糖基，芦丁脱掉一个鼠李糖基生成异槲皮素，再脱掉一个葡萄糖基生成苷元槲皮素。反应过程如下：

将10mg芦丁溶于0.2ml甲醇，再加入0.8ml水，混合均匀后，加入0.12g的Mg SO₄溶解以提供SO₄ ^2-离子。在110℃加热反应，每隔一个小时取样TLC检测。TLC展开剂为氯仿：甲醇：冰乙酸＝7：3：1，放置254nm紫外灯下荧光显色。结果如图4所示。

随着反应的进行，芦丁逐渐脱去3号碳上的糖基，生成了异槲皮苷和槲皮素。说明SO₄ ^2-离子对黄酮苷类具有水解作用。反应过程是连续化的，可以通过控制反应条件来控制反应产物。

实施例4

检验阴离子对甾体皂苷的作用。

以穿山龙薯蓣皂苷为底物，以Cl^-为催化剂。穿山龙薯蓣皂苷带有3个糖基，内部一个葡萄糖基，外部两个鼠李糖基，外部两个鼠李糖基随机水解，再水解掉另外一个鼠李糖基，然后再水解内部的葡萄糖基，最终生成苷元。反应机理如下所示：

称取10mg薯蓣苷元溶于0.2mg乙醇，再加入0.8ml水，然后加入1ml2mol/L的FeCl₃溶液以提供Cl^-离子，于90℃反应，每小时取样检测，由图6可以看出，穿山龙薯蓣皂苷被Cl^-离子逐渐水解掉3碳上的糖基，最终生成苷元。证实了Cl^-离子对甾体类皂苷的水解作用。也证实了反应过程的连续化，也可以通过控制反应条件来控制反应产物。

实施例5

检验阴离子对单一成分的原人参二醇皂苷的水解作用。以人参皂苷Rb1为底物，Cl₃CCOO^-为催化剂。称取0.16gCl₃CCOOH溶于1ml水以提供Cl₃CCOO^-离子，再加入200mg皂苷Rb1，于60℃反应，反应结果见图6。

由结果可知，Rb1首先被水解成Rg3、Rg5，然后随着反应时间的延长，逐渐生成了Rh2和Rk2，以及苷元。验证了Cl₃CCOO^-对二醇类人参皂苷的作用。也可以通过控制反应条件来控制反应产物。

实施例6

检验阴离子对原人参三醇类皂苷的作用。以皂苷Re为底物，检验SO₄ ^2-离子的催化作用。将底物20mgRe溶于1ml二甲亚砜，加入1ml的Na₂SO₄以提供SO4^2-离子。100℃进行反应。反应结果见图7。

产物中可能有Rg1、Rg2、Rh1，Rh4和苷元。推测反应机理如下：

实施例7

取10g底物Rb1，按照实施例5中的方法反应5h，反应结束后，将反应产物加5倍水，上200ml大孔吸附树脂柱，反复上柱，使皂苷全部被吸附，然后用水洗去离子、糖类等杂质，然后用90％的乙醇进行洗脱，洗脱完全后，蒸干得产物6.25g。检测结果如图8所示，产物中有Rg3组和Rh2组以及苷元。

试验例

检验实施例7的产物的抗体外抗肿瘤活性。实验方案如下：

使用的肿瘤细胞为人白血病细胞K-562细胞、人乳肺癌细胞95-D、人恶性黑色素瘤细胞A375和人结肠癌细胞HCT-8。每种细胞包括以下四组培养实验：

(1)空白对照组：细胞培养液

(2)DMSO对照组：DMSO和细胞培养液；

(3)产物组：培养液中含有5、10、20、50、100、200μg/L的提取物浓度；

(4)皂苷Rb1组：培养液中5、10、20、50、100、200μg/L的提取物浓度；

实验方法：精密称取实验药品，溶于二甲基亚砜(DMSO)；将对数生长期的细胞用0.5％的胰酶消化，反应结束时加入血清终止反应，然后离心，将细胞沉淀制成细胞悬液，细胞浓度为1×10⁵个/mL，然后接种于96孔板，每孔接100μL。边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。培养24h后，加入各药品的DMSO溶液(每组浓度加入的体积为1μL)，使药品的浓度为5、10、20、50、100、200μg/L。在37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h之后，每孔加入15μL的5mg/mL DTT的PBS溶液，继续培养5h后终止培养。小心除去孔内培养液，加入150μL的DMSO并振荡，蓝色甲瓒晶体充分溶解后，用酶标仪检测各孔在540nm的吸光值。平行进行3组实验。最后计算细胞的存活率，存活率％＝样品A值/对照细胞A值×100％。

实验结果如下：

对K-562细胞的影响如下表所示：

对95-D细胞的影响如下表所示：

对A375细胞的影响如下表所示：

对HCT-8细胞的影响如下表所示：

Rb1对各细胞的影响对比结果如图9所示：产物对各细胞的影响对比结果如图10所示，由图9和图10可以看出产物对四种肿瘤细胞都有明显的抑制作用，而底物Rb1对四种细胞几乎不具有抑制作用。因此，用阴离子催化水解皂苷Rb1的产物是一种潜在的治疗肿瘤的药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述阴离子溶液中的阴离子为OH^-、F^-、Cl^-、Br^-、I^-、SO₄ ^2-、SO₃ ^2-、S₂O₃ ^2-、NO₃ ^-、NO₂ ^-、PO₄ ^3-、CO₃ ^2-、HCO₃ ^-、ClO^-、ClO₄ ⁺、Ac^-、-SO₃H、C₅H₇O₅COO^-、COOH^-、Cl₃CCOO^-、CH₃CHOHCOO^-、^-OOCCH(OH)COO^-形成的盐、碱或酸中一种或几种。

3.根据权利要求1所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述溶剂为水、有机溶剂、一种有机溶剂的水溶液或几种有机溶剂的水溶液。

4.根据权利要求3所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述有机溶剂为二甲亚砜、乙二醇、甲醇、乙醇、异丙醇、环己烷、乙腈、氯仿、正丁醇、醋酸乙酯、乙醚、丙酮、吡啶、苯酚、异丙醇或二氯甲烷。

5.根据权利要求1所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述底物苷类为皂苷、黄酮苷、异黄酮苷中一种或几种的混合物。

6.根据权利要求1所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述底物苷类的浓度为0.1～20％，阴离子溶液的摩尔浓度为20mmol/L～5000mmol/L。

7.根据权利要求1所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述纯化的具体操作为：将反应产物通过大孔吸附树脂柱纯化或通过有机溶剂萃取纯化。

8.根据权利要求7所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂柱纯化的具体步骤为：将反应产物直接上柱或加水稀释后上柱或减压除去有机溶剂后上柱，然后用水洗去离子和糖，再用质量分数为25～95％的乙醇洗脱吸附的苷类。

9.根据权利要求7所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述有机溶剂萃取纯化的具体步骤为：将反应产物降温后，直接与低极性有机溶剂混合萃取；或者将反应产物先除去有机溶剂，然后加水或不加水，再加入低极性有机溶剂萃取，所述低极性有机溶剂添加量为反应产物体积的0.4～1倍，萃取3～4次，合并萃取液，再加水对萃取液洗涤2～3次，最后蒸干有机溶剂可得纯化后的产物。

10.根据权利要求9所述的阴离子催化水解苷类化合物的方法，其特征在于：所述低极性有机溶剂包括正丁醇、石油醚、乙醚、氯仿、己烷、环己烷或乙酸乙酯。