CN110846372A - 一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法，先使用低浓度的硫酸预处理菊叶薯蓣，固液分离，固相部分再进行薯蓣皂素的水解。本发明避免了自然发酵的预处理周期长、具有产生杂质的潜在风险的问题；同时本发明避免了薯蓣皂素直接水解的过程中，由于淀粉和木质纤维素随着水解并进一步脱水，带来水解后废酸水中有机物含量的急剧增加，引起严重的环境污染问题；另外本发明提高了薯蓣皂素的水解得率明显提高。本方法具有显著优势，有很好的推广应用价值。

Description

一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法
技术领域
本发明涉及薯蓣皂素提取技术领域，更具体地，涉及一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法。
背景技术
菊叶薯蓣是薯蓣科薯蓣属植物。原产于墨西哥，20世纪70年代引入中国云南省试种成功，目前我国种植广泛。菊叶薯蓣皂素含量较高，其皂素含量约是盾叶薯蓣的两倍，是一种提取皂素合成其它皮质激素的重要原料。
薯蓣皂素的甾体结构简单，容易化学修饰，是合成仅次于抗生素类的第二大药物-甾体激素类药物的主要原料，被称为医药黄金，市场价值高。我国年是世界薯蓣皂素的主要生产国，随着皂素产业的发展和国际市场对薯蓣皂素需求量的增加，寻找薯蓣皂素含量高、产量高的薯蓣皂素制备方法，已成为解决当前薯蓣皂素产业发展的关键之一。
目前，当前菊叶薯蓣皂素水解生产面临的水解得率低和污染严重的问题的不足的问题，限制了薯蓣皂素的生产。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术当前薯蓣皂素水解生产面临的水解得率低和污染严重的问题的不足，提供一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法。
本发明的发明目的是提供一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
薯蓣皂素直接水解的过程中，由于淀粉和木质纤维素随着水解并进一步脱水，带来水解后废酸水中有机物含量的急剧增加，引起严重的环境污染问题，在薯蓣皂素水解前对其进行分离是解决污染的主要途径。发明人发现低酸预处理后，固液分离，固相部分再进行薯蓣皂素的水解，这既可以将呋甾烷皂苷转化为螺甾烷皂苷，提高薯蓣皂素水解得率，同时还可以降低废水中的有机物含量，有助于生产的清洁化。
因此本发明要求保护一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法，包括以下步骤：
S1.使用0.1～0.2mol/L的硫酸，菊叶薯蓣与硫酸按照料液比为1:4～6， 110～120℃进行预处理2～6h；
S2.固液分离，取固体与去离子水混合使得，液体：固体＝4～6ml：1g；
S3.固液分离，取固体与1.0～1.2mol/L硫酸混合，至固液比为1:4～6的进行薯蓣皂素的酸水解，水解温度为115～125℃，水解时间为4～6h；
S4.冷却至室温，然后中和至中性、滤纸过滤、干燥(105℃；过夜)得到水解物；
S5.水解物用石油醚索氏提取薯蓣皂素。
优选地，步骤S1中，使用0.1mol/L的硫酸，菊叶薯蓣与硫酸按照料液比为 1:6，105℃进行预处理6h；
优选地，步骤S2中，液体：固体＝6ml：1g。
优选地，步骤S3中，硫酸的浓度为1.0mol/L，固液比为1:6，水解温度为 120℃，水解时间为4h。
优选地，菊叶薯蓣采用菊叶块茎薯蓣冻干粉。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明避免了自然发酵的预处理周期长、具有产生杂质的潜在风险的问题；同时本发明避免了薯蓣皂素直接水解的过程中，由于淀粉和木质纤维素随着水解并进一步脱水，带来水解后废酸水中有机物含量的急剧增加，引起严重的环境污染问题；另外本发明提高了薯蓣皂素的水解得率明显提高。本方法具有显著优势，有很好的推广应用价值。
附图说明
图1为薯蓣皂素的标准曲线。
图2为在不同浓度硫酸下，菊叶薯蓣的薯蓣皂素得率随时间变化情况。
图3为四种甾体皂苷的含量在预酸解过程中的变化。
图4为不同时间预酸解处理对薯蓣皂素得率的影响。
图5为预酸解过程中葡萄糖含量的变化。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、菊叶薯蓣
菊叶薯蓣为2年生，由东莞市丰源华科生物科技有限公司提供，经华南农业大学农业部能源植物资源与利用重点实验室鉴定为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)菊叶薯蓣(Dioscorea composita Hemsl)。块茎挖出后洗净，自然晾干后切片，然后冻干、粉碎于干燥器内保存。
2、HPLC测定薯蓣皂素
HPLC测定薯蓣皂素的条件：色谱柱为Shimazu-GL intersustain C18 (30×150mm，S/N 8AR55067)，柱温为40℃；流动相为甲醇水(90％)，流速为 1mL/min；检测器为岛津ELSD-10A，(Gain 6；46℃；雾化气N2，压力为350 Mpa)。
分别取浓度为1.0mg/mL的薯蓣皂素标准溶液，用甲醇等梯度稀释为500 ug/mL，250ug/mL，125ug/mL，62.5ug/mL，31.25ug/mL的标准溶液，在HPLC 下测定峰面积，用origin2018进行线性拟合，得到标准曲线(图1)，其中线性回归曲线为y＝2675x+6970；相关系数R2＝0.9996。
3、COD的测定
水解后的废水采用重铬酸钾法测定其中的COD，是在一定条件下水样经重铬酸钾氧化处理时，其溶解性物质和悬浮物所消耗的重铬酸钾相对应的氧的质量浓度。在水样中加入已知量的重铬酸钾溶液，并在强酸介质下以银盐作催化剂，经沸腾回流2h后，以试亚铁灵为指示剂，用硫酸亚铁铵滴定水样中未被还原的重铬酸钾，由消耗的硫酸亚铁铵的量换算成消耗氧的质量浓度。
取1mL水样稀释至20.00mL，于250mL磨口的锥形瓶中回流，准确加入 10.00mL重铬酸钾标准溶液，慢慢加入30mL硫酸-硫酸银溶液，轻摇混匀后，加热回流2h(自开始沸腾时计时)。冷却后，加3滴试亚铁灵指示液，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量K。测定水样的同时，以20.00mL重蒸馏水，按同样操作步骤作空白试验。
COD＝C(V2-V1)×8×1000/V
式中：C——硫酸亚铁铵标准溶液的浓度，mol/L；
V1—滴定空白时硫酸亚铁铵标准溶液的耗量，mL；
V2—滴定水样时硫酸亚铁铵标准溶液的耗量，mL；
V——水样体积，mL；
8——氧(1/20)的摩尔质量，g/mol。
4、计算
薯蓣皂素的得率为每克菊叶薯蓣实际提取获得的薯蓣皂素的质量，其中薯蓣皂素的实际提取获得质量为提取溶液中的薯蓣皂素浓度与溶液体积的乘积，薯蓣皂素得率的单位为mg/g。
薯蓣产率为实际测定值与基于底物菊叶薯蓣干粉中薯蓣皂素的理论最大值的百分比；薯蓣皂素的理论含量为薯蓣皂素分子量为414与四种皂苷(Dioscin, protodioscin,Asperin和Asperoside)的比值进行计算，其中四种皂苷的分子量分别869,1049,1015和1195。
葡萄糖得率为每克菊叶薯蓣水解后实际提取获得的葡萄糖质量，葡萄糖的实际提取获得质量为水解后解后的葡萄糖浓度与水解反应体积，葡萄糖得率的单位为mg/g。
所有实验进行三次，结果以平均值的形式呈现。用方差分析(ANOVA)计算数据标准误差和误差线，表示数值范围；使用MS Excel，Origin 8.5和SPSS (Microsoft Corp.，USA)进行统计学分析；使用单因素方差分析(ANOVA)和 Student's t检验分析数据；当p值<0.05时，读数被认为是显着的。
5、菊叶薯蓣中的成分组成
菊叶薯蓣的成分组成如表1所示，其中总皂苷的含量占为104.4mg/g(其中薯蓣皂苷60.8mg/g，皂苷Pb37.9mg/g，原薯蓣皂苷4.6mg/g，原皂苷Pb1.1m/g)，通过理论推算薯蓣皂素的理论含量为46.2mg/g，所以以菊叶薯蓣为原料生产薯蓣皂素时，薯蓣皂素的得率是以理论含量为基础进行计算。除了甾体皂苷成分外，菊叶薯蓣冻干粉中含有348.2mg/g的淀粉，90.4mg/g的纤维素和110.2mg/g的半纤维素。
表1菊叶薯蓣组成成分：
Figure RE-GDA0002361831670000041
实施例1薯蓣皂素的酸水解条件的优化
一、薯蓣皂素的酸水解的方法
取菊叶薯蓣冻干粉与50mL反应釜中，按照1:6的料液比加入硫酸溶液， 120℃下加热，水解反应完成后，冷却至室温，然后用NaOH中和、过滤、干燥得到水解物。将水解物用索氏提取器，石油醚(沸程60～90℃)，在90℃水浴中回流提取，回收溶剂后的提取物用甲醇溶解定容，用HPLC测定薯蓣皂素的含量。
二、硫酸浓度对薯蓣皂素的酸水解的影响
分别选用不同浓度的硫酸(0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L和 1.6mol/L)，按照1:6的料液比，在120℃下，对菊叶薯蓣进行水解，测定随时间变化的薯蓣皂素得率，用HPLC测定薯蓣皂素的含量。
结果如图2，通过比较可以发现皂苷的水解速率随着硫酸浓度的增加而增加，而且水解速率的变化在整个过水解过程中是逐渐加快的。其中1.6mol/L在0-1h 薯蓣皂素的生成速率达到3.0mg/g.h，它浓度的硫酸条件下薯蓣皂素基本未有生成；在水解2h时，可以明显薯蓣皂素浓度和硫酸浓度间的相关性，在1-2h间的薯蓣皂素生成速率分别为2.1mg/g.h，7.6mg/g.h，8.0mg/g.h，11.3mg/g.h和20.9 mg/g.h，其说明薯蓣皂素的生成速率是随硫酸浓度的增加而提高的；在之后的 2-3h间，薯蓣皂素生成速率分别10mg/g.h，16mg/g.h，24mg/g.h，22mg/g.h和 12mg/g.h，其中最高浓度硫酸的反应速率降低，并且低于硫酸浓度为1.0mol/L的反应体系，此时说明在硫酸浓度为1.6mol/L的反应体系中薯蓣皂素的水解已经完成。
而硫酸浓度为1.0mol/L和1.2mol/L的水解条件下，薯蓣皂素的得率在4h 时达到最高值，其中最高薯蓣皂素得率为36.4mg/g。而硫酸浓度为0.6mol/L和 0.8mol/L的反应体系中，薯蓣皂素的得率在6h时达到最高值，薯蓣皂素的最高得率与高浓度硫酸体系的接近。因此，考虑时间和酸用量，菊叶薯蓣水解的最佳条件为：料液比为1:6，硫酸浓度为1.0mol/L，水解温度为120℃，水解时间为 4h。薯蓣皂素的最高水解得率为36.4mg/L，其薯蓣皂素产率率为78.8％。
实施例2一种经过低酸预处理后酸水解菊叶薯蓣生产薯蓣皂素
选择0.1mol/L浓度的硫酸，温度为105℃，料液比为1:6，进行预水解，预水解处理后，直接离心进行固液分离，取固体，然后用去离子水补足到6ml/g(水 /原料)，重新离心固液分离，测定剩余固形物含量，然后，以1:6的固液比进行薯蓣皂素的酸水解，预酸解对薯蓣皂素水解所消耗的酸和废酸水中的COD进行了分析，
具体的，选择0.1mol/L浓度的硫酸，温度为105℃，料液比为1:6，进行预水解6h，直接离心进行固液分离，取固体，然后用去离子水补足到6ml/g(水/ 原料)，重新离心固液分离，测定剩余固形物含量，然后，以1:6的固液比进行薯蓣皂素的酸水解，硫酸浓度为1.0mol/L，水解温度为120℃，水解时间为4h。水解反应完成后，冷却至室温，然后用NaOH中和、过滤、干燥得到水解物。将水解物用索氏提取器，石油醚(沸程60～90℃)，在90℃水浴中回流提取，回收溶剂后的提取物用甲醇溶解定容，用HPLC测定薯蓣皂素的含量。
实施例3预水解对皂苷的影响
一、实验方法
选择0.1mol/L浓度的硫酸，温度为105℃，料液比为1：6，进行预水解处理。检测预处理后甾体皂苷含量的含量。
二、实验结果
预处理后甾体皂苷含量(1.0g菊叶薯蓣水解体系)的变化结果如图3。
呋甾烷皂苷含量降低和螺甾烷皂苷增加是薯蓣皂素水解得率在得以提高的关键，低酸水解的过程中，呋甾烷皂苷(图3b和图3d)在体系中的含量都是降低的，其中25-O-原薯蓣皂苷的含量在4h时，含量基本为零，而含量更低的呋甾烷皂苷asperoside在3h后也转化完全；螺甾烷皂苷(图3a和图3c)的含量变化是不同的，其中薯蓣皂苷的含量是在0-2h时，增加最快，在2-6h增加趋于平缓，6h以后开始降低；而皂苷Pb的含量是一直降低的，其中0-3h减少速率较慢，3-7h降低速率则升高。另外，螺甾烷总含量在1-3h时是增加的，呋甾烷皂苷总含量是降低的，其中螺甾烷总量在3h达到最高，为100.2mg/g；说明低酸水解能够降低呋甾烷含量，提高螺甾烷含量，有助于提高薯蓣皂素水解得率。
实施例4预水解对薯蓣皂素水解得率的影响
一、实验方法
为了探究预酸解对薯蓣皂素水解得率的影响，分别将菊叶薯蓣预水解1h， 2h，3h，4h，5h，6h和7h后，离心去除水解液后，按照薯蓣皂素的酸水解条件进行水解，测定薯蓣皂素的水解得率。
二、实验结果
结果如图4，预酸解5h的薯蓣皂素水解得率的最高，其值为37.9mg/g，较直接水解的35.0mg/g提高2.9mg/g。其它时间的预酸解薯蓣皂素的水解得率与直接水解接近或者略高，差异不显著。虽然预酸解能够降低呋甾烷皂苷含量，提高螺甾烷皂苷含量，但是并未明显提高薯蓣皂素的水解得率，说明在水解过程中甾体皂苷含量的变化并不是薯蓣皂素水解得率提高的主要因素。
实施例5预水解对淀粉的影响
一、实验方法
选择0.1mol/L浓度的硫酸，温度为105℃，料液比为1：6，进行预水解处理。在预水解过程中检测葡萄糖的含量变化。
二、实验方法
结果如图5，在酸预处理的条件下，葡萄糖的含量是逐渐增加的，其中0-6h 葡萄糖的生成速率基本是一致的，在6h葡萄糖的含量达到最大值，6h之后葡萄糖含量不再增加，说明淀粉水解基本完成。葡萄糖的最终含量为319.4mg/g，菊叶薯蓣的淀粉含量为348mg/g，淀粉水解率达到92％。葡萄糖的生成速率是高于四种甾体皂苷的变化速率，这与淀粉糖苷键的水解难度是低于皂苷上的糖苷键。在0.1mol/L的硫酸浓度下，淀粉在6h后完成水解。考虑对淀粉的分离，实现薯蓣皂素水解的清洁化，因此选择水解6h作为预水解的处理时间。
实施例6预酸解对废水中有机物含量的影响
一、实验方法
预水解处理后，直接离心进行固液分离，然后用去离子水补足到6ml/g(水 /原料)，重新离心固液分离，测定剩余固形物含量，然后，以1:6的固液比进行薯蓣皂素的酸水解，检测预酸解对薯蓣皂素水解所消耗的酸和废酸水中的COD。
具体的，选择0.1mol/L浓度的硫酸，温度为105℃，料液比为1:6，进行预水解，直接离心进行固液分离，然后用去离子水补足到6ml/g(水/原料)，重新离心固液分离，测定剩余固形物含量，然后，以1:6的固液比进行薯蓣皂素的酸水解，硫酸浓度为1.0mol/L，水解温度为120℃，水解时间为4h。
同时，以直接酸水解作为对照，检测对薯蓣皂素水解所消耗的酸和废酸水中的COD。
二、实验结果
结果如下表2所示。
表2预水解对薯蓣皂素水解的影响：
Figure RE-GDA0002361831670000081
对于菊叶薯蓣预水解处理后提取薯蓣皂素的衡算分析可知，预水解可降低参与薯蓣皂素水解过程中固形物的40％左右，超过了菊叶薯蓣中淀粉的含量348 mg/g，说明除了淀粉以外，还有其他物质也被水解，半纤维素也极易在低酸的环境中被水解，。固形物的降低可以降低薯蓣皂素水解过程的酸耗，按照固相的去除效果，预水解的酸耗为3.1mmol/g，比直接酸水解方法降低了约40.0％。预水解后薯蓣皂素水解过程中单位原料产生的COD为215mg/g，较直接水解的828 mg/g降低了74.9％，降低废水中有机物含量的效果显著。

Claims (5)

1.一种菊叶薯蓣低酸预处理提高皂素得率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.使用0.1～0.2mol/L的硫酸，菊叶薯蓣与硫酸按照料液比为1:4～6，110～120℃进行预处理2～6h；
S2.固液分离，取固体与去离子水混合使得，液体：固体＝4～6ml：1g；
S3.固液分离，取固体与1.0～1.2mol/L硫酸混合，至固液比为1:4～6的进行薯蓣皂素的酸水解，水解温度为115～125℃，水解时间为4～6h；
S4.冷却至室温，然后中和至中性、滤纸过滤、干燥得到水解物；
S5.水解物用石油醚索氏提取薯蓣皂素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，使用0.1mol/L的硫酸，菊叶薯蓣与硫酸按照料液比为1:6，105℃进行预处理6h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，液体：固体＝6ml：1g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，硫酸的浓度为1.0mol/L，固液比为1:6，水解温度为120℃，水解时间为4h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，菊叶薯蓣采用菊叶块茎薯蓣冻干粉。
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