CN110904181A - 一种菊叶薯蓣经自然发酵提高皂素得率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种菊叶薯蓣经自然发酵提高皂素得率的方法，菊叶薯蓣经自然发酵后再进行酸水解；酸水解反应完成后，冷却至室温，然后中和、过滤、干燥得到水解物；水解物用石油醚提取薯蓣皂素。本发明将菊叶薯蓣自然发酵后在进行酸水解，相较于直接水解薯蓣皂素得率提高了10％，大大提高了薯蓣皂素的水解得率和产率。本制备方法有很好的应用前景，值得大力推广。

Description

一种菊叶薯蓣经自然发酵提高皂素得率的方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，更具体地，涉及一种菊叶薯蓣经自然发酵提高皂素得率的方法。

背景技术

菊叶薯蓣是薯蓣科薯蓣属植物。原产于墨西哥，20世纪70年代引入中国云南省试种成功，目前我国种植广泛。菊叶薯蓣皂素含量较高，其皂素含量是同等重量盾叶薯蓣的两倍，是一种提取皂素合成其它皮质激素的重要原料。

薯蓣皂素的甾体结构简单，容易化学修饰，是合成仅次于抗生素类的第二大药物-甾体激素类药物的主要原料，被称为医药黄金，市场价值高。我国年是世界薯蓣皂素的主要生产国，随着皂素产业的发展和国际市场对薯蓣皂素需求量的增加，寻找薯蓣皂素含量高、产量高的薯蓣皂素制备方法，已成为解决当前薯蓣皂素产业发展的关键之一。

目前，当前菊叶薯蓣皂素水解生产面临的水解得率低和污染严重的问题，限制了薯蓣皂素的生产。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有菊叶薯蓣皂素水解生产面临的水解得率低的技术的不足，提供一菊叶薯蓣经自然发酵提高皂素得率的方法。

本发明的目的是提供一种菊叶薯蓣经自然发酵提高皂素得率的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护一种制备薯蓣皂素的方法，菊叶薯蓣进行自然发酵后进行酸水解；酸水解反应完成后，冷却至室温，然后中和至pH中性、滤纸过滤、干燥得到水解物；水解物用石油醚索氏提取薯蓣皂素。

优选地，所述室温为25℃。

优选地，干燥条件为105℃干燥过夜。

优选地，所述自然发酵为：菊叶薯蓣加入水，恒温培养进行自然发酵；其中，菊叶薯蓣与水的料液比为1：2～5，发酵时间为44～52h，发酵温度为40～50℃。

优选地，所述自然发酵，菊叶薯蓣与水的料液比为1：4。

优选地，所述自然发酵，发酵时间为48h。

优选地，所述自然发酵，发酵温度为45℃。

优选地，酸水解的条件为：料液比为1：4～6，硫酸浓度为0.8～1.4mol/L，水解温度为105～130℃，水解时间为2～6h。

优选地，酸水解的条件为：料液比为1：6，硫酸浓度为1.0mol/L，水解温度为120℃，水解时间为4h。

优选地，菊叶薯蓣采用薯蓣冻干粉。

优选地，所述薯蓣冻干粉的制备方法为在105℃烘干过夜。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明将菊叶薯蓣自然发酵后在进行酸水解，相较于直接水解薯蓣皂素得率提高了10％，大大提高了薯蓣皂素的水解得率和产率。本制备方法有很好的应用前景，值得大力推广。

附图说明

图1为自然发酵时间对薯蓣皂素水解得率的影响。

图2为自然发酵料液比对薯蓣皂素水解得率的影响。

图3为自然发酵温度对薯蓣皂素水解得率的影响。

图4为在不同浓度硫酸下，菊叶薯蓣的薯蓣皂素得率随时间变化情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

菊叶薯蓣为2年生，由东莞市丰源华科生物科技有限公司提供，经华南农业大学农业部能源植物资源与利用重点实验室鉴定为薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(Dioscorea)菊叶薯蓣(Dioscorea composita Hemsl)。块茎挖出后洗净，自然晾干后切片，然后冻干、粉碎于干燥器内保存。

实施例1 菊叶薯蓣的自然发酵

一、菊叶薯蓣的自然发酵的方法

准确称量一定质量的菊叶薯蓣粉末，在105℃烘箱中过夜，然后称重，测定菊叶薯蓣冻干粉的水分；

称取菊叶薯蓣冻干粉10.0g(DW)，按照一定料液比，在一定温度下，进行特定时长发酵，即置于恒温培养箱中培养，发酵后按照薯蓣皂素的水解方法进行水解和提取薯蓣皂素。

具体的，薯蓣皂素的水解方法为：直接添加浓硫酸，使得料液比为1:6，硫酸浓度为1.0mol/L；水解温度为120℃，水解时间为4h。

具体的，薯蓣皂素的提取方法为：

水解反应完成后，冷却至室温；

然后用NaOH中和至pH中性；

滤纸过滤；

干燥(105℃过夜)得到水解物；

将水解物用索氏提取器，石油醚(沸程60～90℃)，在90℃水浴中回流提取，回收溶剂后的提取物用甲醇溶解定容，用HPLC测定薯蓣皂素的含量。

二、发酵时间对菊叶薯蓣的自然发酵的影响

1、实验方法

称取菊叶薯蓣冻干粉10.0g(DW)，按照料液比为1:4，温度为40℃，分别发酵12h，24h，36h，48h，54h，发酵后按照薯蓣皂素的水解方法进行水解和提取薯蓣皂素，分别提取不同发酵时间阶段的总皂苷，然后用HPLC-ELSD方法测定其中各个皂苷的含量。

2、实验结果

结果如图1，相对于直接进行酸水解，自然发酵是能够提高薯蓣皂素水解得率，并且在48h以前，薯蓣皂素的水解得率是随着发酵时间的延长而增加的；薯蓣皂素的水解得率在自然发酵48h达到最高，后趋于平缓，因此48h是自发酵的最佳时间。

三、料液比对菊叶薯蓣的自然发酵的影响

为了优化最佳的发酵初始浓度，对料液比进行考察，其中料液比为水是菊叶薯蓣粉的倍数。

1、实验方法

称取菊叶薯蓣冻干粉10.0g(DW)，分别按照料液比为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5，温度为40℃，发酵48h，发酵后按照薯蓣皂素的水解方法进行水解和提取薯蓣皂素，分别提取不同料液比的总皂苷，然后用HPLC-ELSD方法测定其中各个皂苷的含量。

2、实验结果

结果如图2所示，随着水量增加，3倍和4倍体积的水，薯蓣皂素的水解得率最高，当加到5倍体积水时，薯蓣皂素的得率明显下降，说明初始物料浓度低，反应体系中的发酵反应较为缓慢，而1倍体积水中，薯蓣皂素的水解得率最低，说明反应体系物料浓度较高，不利于发酵的进行。因此，选择1:4为最佳料液比。

四、温度条件比对菊叶薯蓣的自然发酵的影响

1、实验方法

自然发酵中起作用的多为微生物参与的生物酶反应，相较于化学催化剂，生物酶的催化活一般具有最佳反应的温度范围，对菊叶薯蓣自然发酵的温度条件进行分析，料液比为1:4，发酵时间为48h，发酵后按照薯蓣皂素的水解方法进行水解和提取薯蓣皂素，分别提取不同温度的总皂苷，然后用HPLC-ELSD方法测定其中各个皂苷的含量。

2、实验结果

发酵结果如图3所示。通过比较发现，随着温度的升高，薯蓣皂素的水解得率也在逐渐升高，当温度达到45℃时，薯蓣皂素的水解得率达到最高，而温度达到50℃时，薯蓣皂素的水解得率明显下降，且低于40℃时的薯蓣皂素水解得率，也与酶活性的一般适用温度范围接近，在适用范围内，高于最佳温度的酶催化活性收到的抑制较明显。在菊叶薯蓣自然发酵中，选择45℃为最佳发酵温度。

五、菊叶薯蓣的自然发酵的最适条件

通过分析，将菊叶薯蓣自然发酵的最适条件为发酵时间为48h，发酵温度为45℃，发酵料液比为1:4。在最佳条件下，通过自然发酵，薯蓣皂素的水解得率提高到40.0mg/g，产率达到理论值的86.6％，相较于直接水解得率提高了10％。

对比例

一、薯蓣皂素的酸水解的方法

取菊叶薯蓣冻干粉与50mL反应釜中，按照1:6的料液比加入硫酸溶液，120℃下加热，水解反应完成后，冷却至室温，然后用NaOH中和、过滤、干燥得到水解物。将水解物用索氏提取器，石油醚(60～90)，在90℃水浴中回流提取，回收溶剂后的提取物用甲醇溶解定容，用HPLC测定薯蓣皂素的含量。

二、硫酸浓度对薯蓣皂素的酸水解的影响

分别选用不同浓度的硫酸(0.6mol/L、0.8mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L和1.6mol/L)，按照1:6的料液比，在120℃下，对菊叶薯蓣进行水解，测定随时间变化的薯蓣皂素得率，用HPLC测定薯蓣皂素的含量。

结果如图4，通过比较可以发现皂苷的水解速率随着硫酸浓度的增加而增加，而且水解速率的变化在整个过水解过程中是逐渐加快的。其中1.6mol/L在0-1h薯蓣皂素的生成速率达到3.0mg/g.h，它浓度的硫酸条件下薯蓣皂素基本未有生成；在水解2h时，可以明显薯蓣皂素浓度和硫酸浓度间的相关性，在1-2h间的薯蓣皂素生成速率分别为2.1mg/g.h，7.6mg/g.h，8.0mg/g.h，11.3mg/g.h和20.9mg/g.h，其说明薯蓣皂素的生成速率是随硫酸浓度的增加而提高的；在之后的2-3h间，薯蓣皂素生成速率分别10mg/g.h，16mg/g.h，24mg/g.h，22mg/g.h和12mg/g.h，其中最高浓度硫酸的反应速率降低，并且低于硫酸浓度为1.0mol/L的反应体系，此时说明在硫酸浓度为1.6mol/L的反应体系中薯蓣皂素的水解已经完成。

而硫酸浓度为1.0mol/L和1.2mol/L的水解条件下，薯蓣皂素的得率在4h时达到最高值，其中最高薯蓣皂素得率为36.4mg/g。而硫酸浓度为0.6mol/L和0.8mol/L的反应体系中，薯蓣皂素的得率在6h时达到最高值，薯蓣皂素的最高得率与高浓度硫酸体系的接近。因此，考虑时间和酸用量，菊叶薯蓣水解的最佳条件为：料液比为1:6，硫酸浓度为1.0mol/L，水解温度为120℃，水解时间为4h。薯蓣皂素的最高水解得率为36.4mg/L，其薯蓣产率率为78.8％。

Claims (8)

1.一种菊叶薯蓣经自然发酵提高皂素得率的方法，其特征在于，菊叶薯蓣经自然发酵后再进行酸水解；酸水解反应完成后，冷却至室温，然后中和至pH中性、过滤、干燥得到水解物；水解物用石油醚索氏提取薯蓣皂素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自然发酵为：菊叶薯蓣加入水，恒温培养进行自然发酵；菊叶薯蓣加入水，恒温培养进行自然发酵；其中，菊叶薯蓣与水的料液比为1：2～5，发酵时间为44～52h，发酵温度为40～50℃。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述自然发酵，菊叶薯蓣与水的料液比为1：4。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述自然发酵，发酵时间为48h。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述自然发酵，发酵温度为45℃。

6.根据权利要求3到5任一所述的方法，其特征在于，酸水解的条件为：料液比为1：4～6，硫酸浓度为0.8～1.4mol/L，水解温度为105～130℃，水解时间为2～6h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，酸水解的条件为：料液比为1:6，硫酸浓度为1.0mol/L，水解温度为120℃，水解时间为4h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，菊叶薯蓣采用薯蓣冻干粉。

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