CN115779001A

CN115779001A - 一种地不容提取生物碱的方法

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Publication number: CN115779001A
Application number: CN202211545395.4A
Authority: CN
Inventors: 李旻玥; 沈晓静; 毛自朝; 林春; 刘正杰; 李兴玉
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2023-03-14

Abstract

本发明公开了一种地不容提取生物碱的方法，包括以下步骤：原料清洗、切片、阴干、粉碎；和稀酸混合后充分搅拌，浸泡后加热提取、过滤，收集滤液；调节滤液pH值至碱性，冷藏静置后离心，收集沉淀，用水冲洗至中性；有机溶剂萃取，减压回收有机溶剂至浸膏，得萃取物；用大孔吸附树脂吸附，过滤，收集大孔吸附树脂装柱，然后洗脱，收集洗脱液并浓缩，低温干燥，即得。本发明生物碱的提取方法总生物碱提取物得率在3％～6％之间，提取率高，纯度高，易于规模化生产；所用试剂对提取容器耐受性好，对环境友好；大孔吸附树脂对生物碱的吸附能力强，洗脱方便，产品活性较高，能够有效抑制病毒复制和病菌分裂，具有抗炎、抗肿瘤和神经保护作用。

Description

一种地不容提取生物碱的方法

技术领域

本发明属于生物碱提取技术领域，具体涉及一种地不容提取生物碱的方法。

背景技术

地不容，中药名。为防己科植物地不容(Stephania epigaea

H.S.Lo))。具有涌吐痰食，截疟，解疮毒之功效。常用于疟疾，食积腹痛，痈肿疔毒。

地不容，俗名山乌龟、地胆、金不换，是防己科(Menispermaceae)千金藤属(Stephania)植物，雌雄异株植物，主要分布于云南的西南部及东南部，作为传统民族药，药典就有地不容植物具清热、消炎、阵痛、解毒的功效地不容，草质、落叶藤本，全株无毛；块根硕大，通常扁球状，暗灰褐色。嫩枝稍肉质，紫红色，有白霜，干时现条纹。叶干时膜质，扁圆形，很少近圆形，长3-5cm，宽5-6.5cm，极少达长7.5cm，宽9cm，顶端圆或偶有骤尖，基部通常圆，下面稍粉白；掌状脉向上的3条，向下的5-6条，纤细；叶柄长通常4-6cm，有时达11cm，盾状着生于叶片近基部约1-2cm处。【中国植物志.第三十卷.(第一分册)[M].北京：科学出版社，1996.40】

研究表明，千金藤属地不容类植物的抑制病原菌的活性成分主要是这类植物所含的次生代谢产物——生物碱。地不容块根中含丰富的生物碱，如千金藤素、轮环藤宁碱、L-箭毒碱、异紫堇定碱等生物碱为药材的主要有效成分，主要积累于硕大块根中。需要改用适合于提取精制这类生物碱的专属方法所得到的提取物才具有更好的抑制病原菌的效果。

申请号为200810025776.3的专利文献提到一种金不换(广西地不容(Stephaniakwangsiensis)、小花地不容(Stephaniamicrantha)或桂南地不容(Stephaniakuinanensis)的干燥块根总生物碱的制备方法：取药材粗粉，加入乙醇渗漉或回流，减压回收乙醇后的到的稠膏用酸溶，过滤，滤液过大孔树脂柱或强酸性阳离子交换树脂，洗脱液减压回收溶剂，浓缩，干燥，即得。申请号为200710301389.3的专利文献公开了一种金不换(Stephania sp.)戒毒作用有效成分的提取方法：金不换块根粉碎，50～90％酸性乙醇溶液回流提取，提取液在温度为60～80℃条件下减压浓缩的稠膏，稠膏在相同条件下减压干燥得干浸膏粉，然后以氯仿醋酸乙酯对干浸膏粉回流提取，合并提取液并减压回收至干即得。申请号为200810119399.X的专利文献公开了山乌龟(Stephania delavayiDiels)提取物的新用途，其中涉及的提取物制备方法如下：以水和/或有机溶剂如甲醇乙醇石油醚氯仿等在温度为60～100℃条件下回流提取。

上述制备方法均涉及到乙醇回流提取，而地不容中的生物碱活性成分易受光照和温度的影响，加热回流过程可能造成其损失，导致药效活性的降低。

因此，为了解决上述问题，本文提出一种地不容提取生物碱的方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明设计了一种地不容提取生物碱的方法，该方法能够有效提高地不容生物碱的提取率，减少了提取过程中的损耗，且能够极大程度保留产物的生物活性。

为了达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：将地不容原材料清洗，切片后阴干或40～50℃低温烘干，然后粉碎成粉末；

Step2：地不容粉末和酸性水溶液按照1:5～10的质量比混合后充分搅拌，在40～50℃下浸泡24～48h，于50～60℃加热提取3～5次，每次1～2h，过滤，收集滤液备用；

Step3：调节滤液的pH值至12～14，于0～4℃冷藏静置12～24h，离心，收集沉淀，用水冲洗至洗出液呈中性；

Step4：将Step3中产物加入有机溶剂反复萃取，减压回收有机溶剂至浸膏，得到有机溶剂萃取物；

Step5：加入大孔吸附树脂吸附24～48h，过滤，收集大孔吸附树脂装柱，然后依次用水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液洗脱，收集70％乙醇洗脱液；

Step6：将Step5所得70％乙醇洗脱液浓缩，低温干燥，即得地不容生物碱。

进一步的，包括以下步骤：

Step1：将地不容原材料清洗，切片后阴干或40～50℃低温烘干，然后粉碎成粉末，过100目筛网；

Step2：地不容粉末和酸性水溶液按照1:5的质量比混合后充分搅拌，在40～50℃下浸泡48h，于50～60℃加热提取4次，每次2h，过滤，收集滤液备用；

Step3：调节滤液的pH值至12，于0～4℃冷藏静置24h，离心，收集沉淀，用水冲洗至洗出液呈中性；

Step5：加入大孔吸附树脂吸附48h，过滤，收集大孔吸附树脂装柱，然后依次用水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液洗脱，收集70％乙醇洗脱液；

进一步的，所述Step1中地不容粉末过50～100目筛网。

进一步的，所述Step2中的酸性水溶液的pH值为4～6；所述的酸性水溶液为盐酸、硫酸、磷酸中的一种。

进一步的，所述Step4中有机溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、75％的乙醇溶液中的一种或多种。

进一步的，所述Step5中，大孔吸附树脂用量按每克地不容粉末计，为0.02～0.04g；水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液的用量按每克地不容粉末计，为1～2ml；洗脱速度按每克大孔吸附树脂计，为0.2～0.4ml/min。

进一步的，所述的大孔吸附树脂为D101、AB-8、S-8、D140、D141、HPD系列、D1300、X-5、Sp825、D312、D201、NKA9大孔吸附树脂中的任意一种。

本发明的有益效果是：

本发明原料资源丰富，易于获取；活性成分生物碱的提取方法操作简单，总生物碱提取物得率在3％～6％之间，提取率高，纯度高，易于规模化工业化生产；本发明所用酸碱均为相对的弱的酸碱，对提取容器耐受性好，对环境友好；所选用的大孔吸附树脂对生物碱的吸附能力强，洗脱容易、方便，洗脱率高，产品活性相对较高，能够有效抑制病毒复制和病菌分裂，具有抗炎、抗肿瘤和神经保护作用，有利于宝贵的天然资源的综合利用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1生物碱的TLC检测结果示意图；

图2是千金藤素的HPLC检测分析谱图

图3是轮环藤宁碱的HPLC检测分析谱图

图4是实施例1生物碱的HPLC检测分析谱图；

图5是实施例1生物碱抗FIPV病毒活性的间接免疫荧光测定结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

Step1：称取地不容块根清洗，切片后阴干或40～50℃低温烘干，然后粉碎成粉末，过100目筛网；

Step2：地不容粉末和pH为4的稀盐酸按照1:5的质量比混合后充分搅拌，在40～50℃下浸泡48h，于50～60℃加热提取4次，每次2h，过滤，收集滤液备用；

Step4：将Step3中产物加入乙酸乙酯反复萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物；

称取100g地不容粉末，通过上述方法得到产物生物碱5.193g。

实施例2

根据上述提取方法，设计以下对比实验：

实验结果如下：

实施例3

成分测定

1、总生物碱含量测定

精密称取千金藤素对照品约2mg，置100ml棕色容量瓶中，用枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液2、3、4、5、6、7ml置分液漏斗中，各加入溴甲酚绿2ml，枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph＝4)分别为6、5、4、3、2、1ml，氯仿10ml，充分振摇后，静置1h，取氯仿层于412nm处测定吸光度值。以千金藤素对照品溶液的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

精密称取实施例1中产物5mg，置50ml棕色容量瓶中，用枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝4)溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取1ml置分液漏斗中，加入溴甲酚绿2ml，枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph＝4)7ml，氯仿10ml，充分振摇后，静置1h，取氯仿层于412nm处测定吸光度值，依线性方程计算即得。

2、千金藤素和轮环藤宁薄层色谱法(TLC)检测分析

薄层层析用硅胶板为GF254(50mm×200mm)，涂板薄层厚度为0.2-0.25mm，110℃活化1h，展开剂为：苯-氯仿-甲醇-氨水(85-5-10-2)，在波长为254nm或365nm的紫外光下观察，用碘化铋钾试液显示观察。测量各斑点移动距离，计算比移值R_f。千金藤素的R_f为0.42；轮环藤宁的R_f为0.24。

3、千金藤素和轮环藤宁高效液相色谱法(HPLC)检测分析

色谱条件：安捷伦1200高效液相色谱仪；色谱柱：XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.1％三乙胺，流速：1mL·min^-1；柱温30℃；检测波长281nm；进样量：10μl。

线性关系：分别精密吸取千金藤素对照品溶液(浓度为0.0961mg·mL^-1)3，5，10，15，20，25，30μl，轮环藤宁碱对照品溶液(浓度为0.0326mg·mL^-1)3，5，10，15，20，25μl，在上述色谱条件下依次进样，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。

精密称取地不容总碱提取物约25mg，置50ml量瓶中，加入甲醇超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。以10μl进样，测定相应峰面积，计算含量。

本发明地不容生物碱中总碱的重量百分含量为70％～80％，千金藤素的重量百分含量为40～50％，轮环藤宁碱的重量百分含量为20～30％。

实施例4

地不容生物碱对病毒活性间接免疫荧光检测

试验方法：

(1)将生长状态良好的猫肾细胞(CRFK)在温度为37℃，CO₂比例为5％的条件下进行培养，以5×10³细胞/孔的密度接种在96孔板上，继续培养24h。

(2)培养24h后，每孔接种0.01MOI的FIPV病毒，加入相应化合物稀释，将实施例1中所得生物碱配制浓度分别为50μM、10μM、5μM对细胞进行处理，同时设置未加入药物的细胞对照，放入培养箱继续培养。

(3)待病毒对照组细胞出现70％病变的情况，弃掉孔中培养基，用PBS清洗后，使用4％多聚甲醛进行固定。

(4)对每孔加入100μL 5％的BSA进行封闭，在4℃水平下，封闭过夜。

(5)PBS清洗3遍后，加入一抗；继续使用PBS清洗3遍，加入二抗。

(6)培养12h后，在FIPV对照出现70％病变情况下，将24孔板转移至超低温(-80℃)冰箱冻融一次；

(7)弃掉二抗后，使用荧光显微镜观察病毒侵染结果，并拍照保存。

试验结果：

结果见图5，可以看出随着地不容生物碱浓度增加，病毒抑制效果逐渐增强。在地不容生物碱浓度为50μM时，抑制效果最明显，观察不到明显荧光。随着药物浓度降低，荧光越明显，说明FIPV增多，在5μM时，能观察到较多的CRFK细胞感染FIPV后出现的荧光。

实施例5

对实施例1生物碱做以下检测：

TLC检测分析谱图；HPLC检测分析谱图。参阅图1～4。

图1：实施例1生物碱的TLC检测结果示意图。A为千金藤素；B为轮环藤宁碱；C为实施例1生物碱

图2：千金藤素的HPLC检测分析谱图

图3：轮环藤宁碱的HPLC检测分析谱图

图4：实施例1生物碱的HPLC检测分析谱图

图5：实施例1生物碱抗FIPV病毒活性的间接免疫荧光测定结果。

Claims

1.一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于：所述Step1中地不容粉末过50～100目筛网。

4.根据权利要求1所述的一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于：所述Step2中的酸性水溶液的pH值为4～6；所述的酸性水溶液为盐酸、硫酸、磷酸中的一种。

5.根据权利要求1所述的一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于：所述Step4中有机溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、75％的乙醇溶液中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于：所述Step5中，大孔吸附树脂用量按每克地不容粉末计，为0.02～0.04g；水、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、70％乙醇水溶液的用量按每克地不容粉末计，为1～2ml；洗脱速度按每克大孔吸附树脂计，为0.2～0.4ml/min。

7.根据权利要求1或6所述的一种地不容提取生物碱的方法，其特征在于：所述的大孔吸附树酯为D101、AB-8、S-8、D140、D141、HPD系列、D1300、X-5、Sp825、D312、D201、NKA9大孔吸附树酯中的任意一种。