CN115645495B

CN115645495B - 一种具有消炎作用的茭白壳提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN115645495B
Application number: CN202210800550.6A
Authority: CN
Inventors: 郜海燕; 陈杭君; 吴伟杰; 房祥军; 穆宏磊; 牛犇; 刘瑞玲; 韩延超
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-07-06
Filing date: 2022-07-06
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2042-07-06
Also published as: CN115645495A

Abstract

本申请提供了一种具有消炎作用的茭白壳提取物及其制备方法。本申请具有消炎作用的茭白壳提取物的制备方法为：将茭白壳常温贮藏6日使活性成分积累，烘干粉碎、过筛，制备成茭白壳粉末备用，将茭白壳加入到乙醇溶液中，加热搅拌浸提，再超声辅助提取，过滤后，制得茭白壳乙醇提取液，将乙醇提取液以有机溶剂液液萃取，洗涤之后真空冷冻干燥，即得茭白壳粗黄酮，将所得茭白壳粗黄酮提取物以硅胶柱色谱层析分离纯化，得到一种茭白壳小麦黄素及其衍生物提取物，经鉴定该提取物具有良好的抗氧化、抗炎作用，具有实际推广应用价值。

Description

一种具有消炎作用的茭白壳提取物及其制备方法

技术领域

本申请属于食品领域、环保领域以及抗感染药物领域。具体地，本申请提供了一种具有消炎作用的茭白壳提取物及其制备方法。

背景技术

茭白(Zizanialatifolia)为禾本科菰属多年生水生宿根草本植物，广泛分布于长江中下游各省份，是我国仅次于莲藕的第二大水生蔬菜。

采收户在采收茭白时通常会去除上部的叶片和下部的部分叶鞘，其中下部位剥离的茭白叶鞘为废料茭白壳；目前对茭白壳可行的利用方式仅有肥料或者饲料有限的几种；实践中一般将其遗弃在田间、路旁、河道，任其自然腐烂或者将其焚烧。初步估计，我国每年浪费的茭白壳鲜质量在500万吨以上。废弃茭白壳造成严重的生态环境污染，严重影响茭白产业的健康发展。

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种发病机制尚未明确的慢性非特异性炎症性肠病，病情易反复，治疗难度大，近年来在我国的发病率呈显著上升趋势，常见于青壮年人群。目前市场上治疗溃疡性结肠炎的药物多为合成药物，如5-氨基水杨酸、皮质类固醇、硫嘌呤类、生物制剂等，虽然该类药物能暂时缓解患者溃疡性结肠炎的症状，但会引起各种不良反应和毒副作用。随着民众对健康生活的需求日益增长，治疗溃疡性结肠炎产品逐渐趋向更高效、毒副作用低的天然物质，以便为消费者提供效果好、安全性高的产品。

发明内容

针对上述问题，本申请提供了一种具有消炎作用的茭白壳提取物及其制备方法；解决以往茭白采收之后茭白壳堆积腐烂造成的资源浪费和环境污染问题的同时，也为溃疡性结肠炎的治疗提供一种效果好、毒副作用低的治疗组分，具有良好的开发应用前景。

一方面，本申请提供了一种具有消炎作用的茭白壳提取物，所述提取物通过包括以下步骤的制备方法获得：

(1)原料预处理：将茭白壳常温贮藏；优选储存4-8日；(2)粗黄酮提取：将茭白壳加入到乙醇或甲醇溶液中浸提；以有机溶剂液液萃取，得茭白壳粗黄酮；

(3)硅胶柱色谱层析：将所得茭白壳粗黄酮提取物以硅胶柱色谱层析分离纯化。

该提取物优选具有如图3A、B所示的NMR图谱以及表2所示的成分。

另一方面，本申请提供了茭白壳提取物的制备方法，所述方法包括：

(1)原料预处理：将茭白壳常温贮藏；

(2)粗黄酮提取：将茭白壳加入到乙醇或甲醇溶液中浸提；以有机溶剂液液萃取，得茭白壳粗黄酮；

进一步地，步骤(1)中茭白壳常温贮藏4-8日，优选6日。

进一步地，步骤(3)中浸提的料液比为20-30倍。

进一步地，步骤(3)中使用60-70％的乙醇溶液浸提；

进一步地，步骤(3)中使用1：40m/v的乙酸乙酯分两次萃取；

进一步地，制备方法为：

(1)原料预处理：取贮藏6日的茭白壳于60℃恒温干燥至恒重，粉碎，过50目筛，得茭白壳粉末备用；

(2)粗黄酮提取：取茭步骤(1)所得的白壳粉末，加入30倍料液比的70％乙醇溶液，80℃加热搅拌浸提2.5小时；加热浸提搅拌结束后，再30℃，250w超声辅助搅拌浸提40min；过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇；所得水溶液使用1：40m/v的乙酸乙酯分两次萃取，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物；

(3)硅胶柱色谱层析：取粗黄酮提取物与硅胶搅拌，进行硅胶柱色谱层析，干法上样，样品：硅胶＝1：1.5混合搅拌得样品层，样品层：硅胶柱＝1：30-40上样，以v/v 100:0至0：100三氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，根据TLC薄层层析检测的结果合并相似洗脱液，再次进行硅胶柱色谱分离，再次以v/v 50:1至5：1三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，合并目标洗脱液，真空冷冻干燥保存。

另一方面，本申请提供了上述茭白壳提取物在制备治疗炎症性疾病和抗氧化的药物中的应用。

进一步地，所述炎症性疾病为溃疡性结肠炎。

进一步地，所述药物缓可以解结肠缩短；降低IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平；降低结肠组织MPO活性；增强结肠组织SOD活性。

本申请中所述的茭白壳是指茭白采收过程中剥离的茭白叶鞘。

本发明制备得到的茭白壳粗黄酮，以硅胶柱色谱层析分离纯化，得到一种茭白壳小麦黄素及其衍生物提取物，经鉴定该提取物具有良好的抗氧化、抗炎作用，具有实际推广应用价值。一方面，本申请提供了解决以往茭白采收之后茭白壳堆积腐烂造成的资源浪费和环境污染问题；另一方面，为治疗溃疡性结肠炎等疾病炎性疾病提供了一种效果好、毒副作用低的治疗组分；具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为茭白壳常温贮藏小麦黄素含量变化；

图2为实施例1-6茭白壳小麦黄素的提取率；

图3为实施例5茭白壳小麦黄素提取物MRM代谢物检测多峰图(A：负离子模式； B：正离子模式)；

图4为实施例5提取物对小鼠结肠长度的影响；

图5为实施例5提取物对小鼠血清炎症因子水平的影响；

图6为实施例5提取物对小鼠结肠MPO活性的影响；

图7为实施例5提取物对小鼠结肠SOD活性的影响。

具体实施方式

实施例1

具有消炎作用的茭白壳提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

1)原料预处理：取贮藏6日的茭白壳于40℃恒温干燥至恒重，粉碎，过40目筛，得茭白壳粉末备用；

2)粗黄酮提取：取茭白壳粉末，加入20倍料液比的60％甲醇溶液，70℃加热搅拌浸提2小时，加热浸提搅拌结束后，超声(30℃，200w)辅助搅拌浸提20min，过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇，所得水溶液以样品粉末：乙酸乙酯(1：20，m/v) 萃取两次，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物，测定小麦黄素提取率；

3)硅胶柱色谱层析：取粗黄酮提取物与硅胶搅拌，进行硅胶柱色谱层析，干法上样，样品：硅胶＝1：1混合搅拌得样品层，样品层：硅胶柱＝1：30上样，以三氯甲烷-甲醇(v/v 100:0→0：100)进行梯度洗脱，根据TLC薄层层析检测的结果合并相似洗脱液，再次进行硅胶柱色谱分离，再次以三氯甲烷-甲醇(v/v 50:1→5：1)梯度洗脱，合并目标洗脱液，真空冷冻干燥保存备用，评价其体外抗氧化活性。

实施例2

1)原料预处理：取贮藏6日的茭白壳于50℃恒温干燥至恒重，粉碎，过60目筛，得茭白壳粉末备用；

2)粗黄酮提取：取茭白壳粉末，加入30倍料液比的70％甲醇溶液，80℃加热搅拌浸提2.5小时，加热浸提搅拌结束后，再超声(30℃，250w)辅助搅拌浸提40min，过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇，所得水溶液以乙酸乙酯(1：40，m/v)分两次萃取，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物，测定小麦黄素提取率；

3)硅胶柱色谱层析：取粗黄酮提取物与硅胶搅拌，进行硅胶柱色谱层析，干法上样，样品：硅胶＝1：1.5混合搅拌得样品层，样品层：硅胶柱＝1：30-40上样，以三氯甲烷-甲醇(v/v 100:0→0：100)进行梯度洗脱，根据TLC薄层层析检测的结果合并相似洗脱液，再次进行硅胶柱色谱分离，再次以三氯甲烷-甲醇(v/v 50:1→5：1)梯度洗脱，合并目标洗脱液，真空冷冻干燥保存备用，评价其体外抗氧化活性。

实施例3

1)原料预处理：取贮藏6日的茭白壳于50℃恒温干燥至恒重，粉碎，过80目筛，得茭白壳粉末备用；

2)粗黄酮提取：取茭白壳粉末，加入40倍料液比的80％甲醇溶液，90℃加热搅拌浸提3小时，加热浸提搅拌结束后，超声(30℃，300w)辅助搅拌浸提60min，过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇，所得水溶液以乙酸乙酯(1：40，m/v)分两次萃取，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物，测定小麦黄素提取率；

3)硅胶柱色谱层析：取粗黄酮提取物与硅胶搅拌，进行硅胶柱色谱层析，干法上样，样品：硅胶＝1：2混合搅拌得样品层，样品层：硅胶柱＝1：40上样，以三氯甲烷-甲醇(v/v 100:0→0：100)进行梯度洗脱，根据TLC薄层层析检测的结果合并相似洗脱液，再次进行硅胶柱色谱分离，再次以三氯甲烷-甲醇(v/v 50:1→5：1)梯度洗脱，合并目标洗脱液，真空冷冻干燥保存备用，评价其体外抗氧化活性。

实施例4

2)粗黄酮提取：取茭白壳粉末，加入20倍料液比的60％乙醇溶液，70℃加热搅拌浸提2小时，加热浸提搅拌结束后，超声(30℃，200w)辅助搅拌浸提20min，过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇，所得水溶液以乙酸乙酯(1：40，m/v)分两次萃取，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物，测定小麦黄素提取率；

实施例5

1)原料预处理：取贮藏6日的茭白壳于60℃恒温干燥至恒重，粉碎，过50目筛，得茭白壳粉末备用；

2)粗黄酮提取：取茭白壳粉末，加入30倍料液比的70％乙醇溶液，80℃加热搅拌浸提2.5小时，加热浸提搅拌结束后，再超声(30℃，250w)辅助搅拌浸提40min，过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇，所得水溶液以乙酸乙酯(1：40，m/v)分两次萃取，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物，测定小麦黄素提取率；

实施例6

1)原料预处理：取贮藏6日的茭白壳于80℃恒温干燥至恒重，粉碎，过50目筛，得茭白壳粉末备用；

2)粗黄酮提取：取茭白壳粉末，加入40倍料液比的80％乙醇溶液，90℃加热搅拌浸提3小时，加热浸提搅拌结束后，超声(30℃，300w)辅助搅拌浸提60min，过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇，所得水溶液以乙酸乙酯(1：40，m/v)分两次萃取，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物，测定小麦黄素提取率；

试验例

试验例1茭白壳常温贮藏(25℃)小麦黄素含量变化

将茭白壳于25℃贮藏，每2日取样测定小麦黄素含量。称取烘干后的样品粉末10g，按照料液比1：30(m/v)加入体积分数为70％的乙醇溶液，加入搅拌子，在恒温加热磁力搅拌器于70℃条件下搅拌浸提2h，过滤，所得滤液于40℃旋蒸去除乙醇，以料液比1： 15(m/v)用乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，于40℃旋转蒸发至膏状，用甲醇充分溶解混匀并定容至10mL，过0.22μm滤膜，采用高效液相色谱法测定小麦黄素含量。色谱条件：C18反相色谱柱(3.9mm×300mm，5μm)；流动相：甲醇：0.1％磷酸水＝55：45；流速：1mL/min；检测波长：350nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

茭白壳常温贮藏小麦黄素含量变化如图1，茭白壳在25℃贮藏12d内小麦黄素含量呈现出先上升后逐渐下降的趋势，其中在6d小麦黄素含量最高，达到125.78mg/kg。

试验例2提取率测定

为验证各实施例的方法对小麦黄素的提取效果，在试验例1中液相色谱条件下测定各实施例中小麦黄素的得率，结果如图2所示：

图2为实施例1-6中步骤1-2所得粗黄酮提取物的茭白壳小麦黄素提取率，由图可知，相对于其余实施例，实施例4工艺下茭白壳提取率最高为138.89mg/kg。

试验例3体外抗氧化活性实验

将实施例1-6制得的茭白壳提取物进行体外抗氧化活性实验，测试结果见表，实验方法如下：

(1)羟自由基清除能力测定：

1mL提取物溶液中加入1mL 9mmol/L FeSO₄、1mL 9mmol/L水杨酸、1mL 2.4mmol/LH₂O₂，混匀，37℃反应30min，测量510nm下吸光值

其中：A₀为空白组的吸光值

A₁为样品组的吸光值

A₂为对照组的吸光值

(2)DPPH自由基清除能力测定

将2mL提取物溶液，与2mL DPPH溶液(0.1mol/L)混匀，对照组加入等量无水乙醇，空白组加入等量蒸馏水，混匀后25℃反应20min，测定各溶液517nm处吸光度值。

其中：A₀为空白组吸光度值；

A₁为样品组吸光度值；

A₂为对照组吸光度值

(3)超氧阴离子自由基清除能力测定

将1mL提取物溶液与2.5mL Tris-Hcl溶液混匀，25℃水浴20min，再加入1mL 邻苯三酚25℃水浴反应5min，最后加入0.1mL浓度为10mmol/L盐酸溶液，对照组加入等量蒸馏水代替邻苯三酚溶液，空白组加入等量蒸馏水代替样品提取液，混匀后25℃ 反应20min，测定各溶液517nm处吸光度值。

其中：A₀为空白组吸光度值；

A₁为样品组吸光度值；

A₂为对照组吸光度值

体外抗氧化活性测定结果见表1：

表1为实施例1-6所得茭白壳小麦黄素提取物的体外抗氧化活性测定结果。由表1可知，浓度为1mg/mL的茭白壳小麦黄素提取物对羟自由基表现出良好的清除能力，而对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率则相对较低，综合评价在实施例5的制备工艺条件下所制得的提取物外抗氧化活性作用最强，对羟自由基、DPPH自由基和·O₂ ^-的清除率分别为79.16％、66.91％、60.52％。

表1实施例1-6所得小麦黄素提取物体外抗氧化活性评价

试验例4组成成分分析

实施例5中的得到的茭白壳小麦黄素提取物经过UPLC/MS/MS系统检验，共检测到了 10种化合物，其中9种为黄酮类化合物，1种为生物碱(结果如图3和表2所示)。10种化合物经过鉴定分别为小麦黄素-4’-O-丁香醇醚、柚皮素、3-氯苯胺、小麦黄素、高车前素、香叶木素、小麦黄素-4’-O-(愈创木酰甘油)醚、小麦黄素-7-O-(2”-丙二酰) 鼠李糖苷、沙可林B、沙可林A，相对含量分别为7.00％、0.05％、5.20％、7.86％、0.93％、 2.28％、26.18％、0.69％、27.49％、22.31％，其中小麦黄素-4’-O-丁香醇醚、小麦黄素、小麦黄素-4’-O-(愈创木酰甘油)醚、小麦黄素-7-O-(2”-丙二酰)鼠李糖苷、沙可林B、沙可林A这6种化合物为小麦黄素及其衍生物，共占提取物相对含量约为91.53％。

表2实施例5所得茭白壳小麦黄素提取物成分分析

试验例5动物试验

对实施例5所得茭白壳小麦黄素提取物(Zlst)进行动物试验。实验方法：六周龄的雄性Balb/C小鼠适应性饲养一周后，随机分组，每组10只。造模结束后处死解剖小鼠，测量小鼠结肠长度，收集血清炎症因子水平，收集结肠组织并测定MPO和SOD活性。分组和造模处理情况如下：

正常组(NC组)：两周均正常饮食，灌胃0.2mL无菌水

模型组(MC组)：第一周正常饮食，第二周饮用水为3.5％葡聚糖硫酸钠溶液，灌胃0.2mL无菌水

阳性对照组(PC组)：第一周正常饮食，第二周饮用水为3.5％葡聚糖硫酸钠溶液，灌胃0.2mL美莎拉嗪溶液(200mg/(Kg·d))

Zlst-L组：第一周正常饮食，第二周饮用水为3.5％葡聚糖硫酸钠溶液，灌胃0.2mL茭白壳小麦黄素提取液(100mg/(Kg·d))

Zlst-M组：第一周正常饮食，第二周饮用水为3.5％葡聚糖硫酸钠溶液，灌胃0.2mL茭白壳小麦黄素提取液(200mg/(Kg·d))

Zlst-H组：第一周正常饮食，第二周饮用水为3.5％葡聚糖硫酸钠溶液，灌胃0.2mL茭白壳小麦黄素提取液(300mg/(Kg·d))

实验结果如下：

图4为各组小鼠结肠长度图。溃疡性结肠炎会导致小鼠结肠缩短，由图可知，Zlst-L、 Zlst-M、Zlst-H组小鼠的结肠长度大于MC组小鼠的结肠长度，说明茭白壳小麦黄素提取物能够缓解小鼠结肠缩短的现象，且Zlst-L、Zlst-M、Zlst-H组小鼠结肠长度逐渐增加，表明提高茭白壳小麦黄素提取物溶液浓度能够提高抗炎能力，增强对小鼠溃疡性结肠炎的预防能力。

图5为各组小鼠血清炎症因子水平图。IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α等促炎症因子分泌水平异常升高会促使小鼠结肠炎性损伤加剧，由图可知，Zlst-L、Zlst-M、Zlst-H组小鼠的促炎症因子水平低于MC组小鼠，说明茭白壳小麦黄素提取物能够缓解小鼠结肠炎症程度，降低促炎症因子水平，且Zlst-L、Zlst-M、Zlst-H组小鼠血清促炎症因子水平逐渐降低，表明提高茭白壳小麦黄素提取物溶液浓度能够提高抗炎能力，缓解DSS诱导的小鼠的炎症反应，促进修复小鼠结肠粘膜。

图6为各组小鼠结肠组织MPO活性。MPO活性可以反应中性粒细胞浸润程度和炎症水平，炎症程度越强，MPO活性越高。由图可知，Zlst-L、Zlst-M、Zlst-H组小鼠的MPO 活性低于MC组小鼠，说明茭白壳小麦黄素提取物能够缓解小鼠结肠炎症程度，降低MPO 活性，且Zlst-L、Zlst-M、Zlst-H组小鼠结肠MPO活性逐渐降低，表明茭白壳小麦黄素提取物能有效抑制溃疡性结肠炎小鼠MPO活性，缓解小鼠的炎症反应。

图7为各组小鼠结肠组织SOD活性。SOD活性降低导致对自由基的清除能力下降，加速结肠组织损伤。由图可知，Zlst-L、Zlst-M、Zlst-H组小鼠的SOD活性高于MC组小鼠，且Zlst-L、Zlst-M、Zlst-H组小鼠结肠SOD活性逐渐升高，说明茭白壳小麦黄素提取物能有助于维持小鼠结肠组织中SOD活性，缓解由于自由基积累造成的结肠组织损伤和炎症症状。

显然，本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims

1.一种具有消炎作用的茭白壳提取物，其特征在于，所述提取物通过以下制备方法获得：

（1）原料预处理：取贮藏6日的茭白壳于60℃恒温干燥至恒重，粉碎，过50目筛，得茭白壳粉末备用；

（2）粗黄酮提取：取步骤（1）所得的白壳粉末，加入30倍料液比的70%乙醇溶液，80℃加热搅拌浸提2.5小时；加热浸提搅拌结束后，再30℃，250 w超声辅助搅拌浸提40 min；过滤取滤液，滤液于45℃旋转蒸发回收乙醇；所得水溶液以样品粉末：乙酸乙酯1：20，m/v萃取两次，合并萃取液，萃取液45℃蒸发浓缩并以去离子水洗涤3次以上后得到茭白壳粗黄酮提取物；

（3）硅胶柱色谱层析：取粗黄酮提取物与硅胶搅拌，进行硅胶柱色谱层析，干法上样，样品：硅胶=1：1.5混合搅拌得样品层，样品层：硅胶柱=1：30-40上样，以v/v 100:0至0：100三氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，根据TLC薄层层析检测结果合并洗脱液，再次进行硅胶柱色谱分离，再次以v/v 50:1至5：1三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，合并洗脱液，真空冷冻干燥保存。

2.根据权利要求1所述的茭白壳提取物，其中所述的茭白壳是指茭白采收过程中剥离的茭白叶鞘。

3.根据权利要求1所述的茭白壳提取物，所述茭白壳提取物包括如下成分：

分子式鉴定相对含量/% C26H24O10 小麦黄素-4'-O-丁香醇醚 7.00±0.04 C15H12O5 柚皮素 0.05±0.01 C6H6ClN 3-氯苯胺 5.20±0.09 C17H14O7 小麦黄素 7.86±0.09 C16H12O6 高车前素 0.93±0.04 C16H12O6 香叶木素 2.28±0.06 C27H26O11 小麦黄素-4'-O-（愈创木酰甘油）醚 26.18±0.18 C26H26O14 小麦黄素-7-O-（2''-丙二酰）鼠李糖苷 0.69±0.01 C27H26O11 沙可林 B 27.49±0.23 C27H26O11 沙可林 A 22.31±0.23

。

4.根据权利要求1所述的茭白壳提取物在制备治疗炎症性疾病或抗氧化的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述炎症性疾病为溃疡性结肠炎。

6.根据权利要求5所述的应用，其中所述药物缓解结肠缩短；降低IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平；降低结肠组织MPO活性；增强结肠组织SOD活性。