CN110302312B - 一种环草石斛生物碱有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环草石斛生物碱有效部位及其制备方法和应用。所述环草石斛生物碱有效部位含有生物碱石斛宁。本发明提供了一种全新组成的环草石斛生物碱有效部位，该有效部位明确了有效成分，有利于药物的质量控制以及用药安全。动物体内活性研究表明，本发明所述的环草石斛生物碱有效部位可显著降低db/db糖尿病小鼠的血糖，改善Ⅱ型糖尿病小鼠的高血脂状态，具有开发成治疗Ⅱ型糖尿病的辅助药物或保健品的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域，更具体地，涉及一种环草石斛生物碱有效部位及其制备方法和应用。
背景技术
中药治疗糖尿病在我国具有几千年的悠久历史，有较西医毒性较小的优点。石斛在中医临床上常用于治疗热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软等症。有报道石斛与多味中药共煎煮，对降低II型糖尿病患者的血糖、血脂、减轻胰岛素抵抗有确切的疗效。
环草石斛（Dendrobium loddigesii）也叫小环钗石斛、美花石斛、粉花石斛，主要分布于贵州、广西、云南和广东等省，自2000年起被中国药典收载，是中医临床上广泛应用的石斛药材的代表。有研究显示，石斛生物总碱能降低糖尿病大鼠血糖的作用。
另外，中药有效部位是指从中药中提取的一类或几类化学成分的混合体，其含量达到总提取物的50%以上，而且这一类或几类已知化学成分要被认为是有效成分。中药有效部位新药由于既能体现中药多成分、多靶点、多途径发挥药效的特点，又能使药物有效成分更加富集，药理作用和临床疗效增强，以及利于质量控制水平提高等优势，近年来成为中药、天然药新药开发的重要方向之一。严格地说有效部位也是一种提取物，是一种由主要有效成分清楚、有效部位化学类型明确、含量占主导地位和功能上具药效作用的物质集团组成的提取物，“有效性”是其基本特征之一。然而，目前在有效部位“有效性”的筛选和确定方面做的工作不足。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种环草石斛生物碱有效部位及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种环草石斛生物碱有效部位。
本发明的第二个目的是提供一种所述环草石斛生物碱有效部位的制备方法。
本发明的第三个目的是以上所述环草石斛生物碱有效部位，或所述石斛宁在制备治疗糖尿病和/或高血脂症的辅助治疗药物或保健品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种环草石斛生物碱有效部位，含有生物碱石斛宁。
石斛宁的结构式如下所示：
式中字母g所标注的质子为本发明在应用定量核磁共振技术进行含量测定时选用的靶质子。
优选地，生物碱石斛宁含量占该有效部位总质量的30%以上。
更优选地，生物碱石斛宁含量占该有效部位总质量的30～99%。
另外，以上所述环草石斛生物碱有效部位的制备方法，包含如下步骤：
S1. 将环草石斛用亲水性有机溶剂-水的混合溶液作为提取液，进行提取，浓缩干燥后得到环草石斛提取物；
S2. 将S1所得的环草石斛提取物，去除脂溶性成份，浓缩干燥后得到粗环草石斛生物碱有效部位。
S3. 将S2所得粗环草石斛生物碱有效部位溶解、再经除糖，洗脱，收集含石斛宁纯净斑点的馏分，得到石斛宁富集的环草石斛生物碱有效部位。
优选地，步骤S1中，所述亲水性有机溶剂为甲醇、乙醇等。
优选地，步骤S1中，以体积计，亲水性有机溶剂-水的混合溶液中亲水性有机溶剂占70%～80%。
更优选地，步骤S1中，以体积计，亲水性有机溶剂-水的混合溶液中亲水性有机溶剂占80%。
优选地，步骤S1中，提取液体积与环草石斛原料的质量比，以mL/g计为8～10：1
更优选地，步骤S1中，提取液体积与环草石斛原料的质量比，以mL/g计为8：1
优选地，步骤S1中，提取方式为室温冷浸，用超声波辅助提取，提取次数为2～3次。
更优选地，步骤S1中，用超声波辅助提取，80 min/d，放置48h。
更优选地，步骤S1中，提取次数为3次。
优选地，步骤S2中，加甲醇/或水溶解，上固相萃取柱去除脂溶性成份，用水洗脱。
优选地，步骤S2中，所述固相萃取柱固定相是C-18反相硅胶、非极性大孔吸附树脂，或非极性小孔吸附树脂之一。
更优选地，所述固相萃取柱固定相为非极性大孔吸附树脂柱或C-18反相硅胶柱。
优选地，步骤S2中，固相萃取柱固定相的床体积与步骤S1所得环草石斛提取物的质量比，以mL/g计为1：0.4。
优选地，步骤S2中，洗脱所用的水的用量为5～6倍床体积。
更优选地，步骤S2中，洗脱所用的水的用量为6倍床体积。
优选地，步骤S2中获得的粗环草石斛生物碱有效部位再加甲醇溶解、再经Sephadex LH-20柱除糖，甲醇洗脱，收集含石斛宁纯净斑点的馏分，进行石斛宁纯化。
优选的，以上所述环草石斛生物碱有效部位的制备方法，包含如下步骤：
S1. 将环草石斛用80%甲醇/乙醇水溶液室温冷浸，料液比为8：1，超声波辅助提取，80 min/d，放置48h，过滤，将滤液浓缩，得环草石斛提取物；重复提取3次；
S2. 将S1所得的环草石斛提取物，加适量甲醇/或水溶解、上C-18反相硅胶柱/非极性大孔吸附树脂柱固相萃取，固相萃取柱固定相的床体积与步骤S1所得环草石斛提取物的质量比，以mL/g计为1：0.4，上样完毕，用6倍床体积的水洗脱，除脂溶性部位，收集水洗脱液，浓缩干燥后即得粗环草石斛生物碱有效部位；
S3. 将S2所得的粗环草石斛生物碱有效部位再加甲醇溶解、再经Sephadex LH-20柱除糖，甲醇洗脱，收集含石斛宁纯净斑点的馏分，进行石斛宁纯化。
最优选的，以上所述环草石斛生物碱有效部位的制备方法，包含如下步骤：
S1. 将环草石斛用80%乙醇水溶液室温冷浸，料液比为8：1，超声波辅助提取，80min/d，放置48h，过滤，将滤液浓缩，得环草石斛提取物；重复提取3次；
S2. 将S1所得的环草石斛提取物，加适量水溶解、上非极性大孔树脂吸附树脂柱固相萃取，固相萃取柱固定相的床体积与步骤S1所得环草石斛提取物的质量比，以mL/g计为1：0.4，上样完毕，用6倍床体积的水洗脱，除脂溶性部位，收集水洗脱液，浓缩干燥后即得粗环草石斛生物碱有效部位；
S3. 将S2所得的粗环草石斛生物碱有效部位再加甲醇溶解、再经Sephadex LH-20柱除糖，甲醇洗脱，收集含石斛宁纯净斑点的馏分，进行石斛宁纯化。
另外，由以上方法制备得到的环草石斛生物碱有效部位，也应在本发明的保护范围之内。
经过实验结果表明，本发明上述的环草石斛生物碱有效部位有较强的降血糖、降血脂作用，因此，以上所述环草石斛生物碱有效部位，或所述石斛宁在制备治疗糖尿病和/或高血脂症等疾病的辅助治疗药物或保健品中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。
优选地，所述高血脂症包括Ⅱ型糖尿病并高脂血症。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明提供了一种全新组成的环草石斛生物碱有效部位，该有效部位明确了有效成分，有利于药物的质量控制以及用药安全。
（2）动物体内活性研究表明，本发明所述的环草石斛生物碱有效部位可显著降低db/db糖尿病小鼠的血糖，改善Ⅱ型糖尿病小鼠的高血脂状态。具有开发成治疗Ⅱ型糖尿病的辅助药物或保健品的应用前景。
具体实施方式
下面结合说明书和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 环草石斛生物碱有效部位的制备
S1. 将1kg环草石斛用80%甲醇水溶液室温冷浸，料液比为8：1，超声波辅助提取，80 min/d，放置48h，过滤，将滤液浓缩，得环草石斛提取物；重复提取3次。
S2. 将S1所得的环草石斛提取物，加适量甲醇溶解、上C-18反相硅胶柱固相萃取，环草石斛提取物干浸膏重量与C-18反相硅胶柱固定相床体积比为0.4kg ：1L，上样完毕，用6倍床体积的水洗脱，除去脂溶性部位，收集水洗脱液，浓缩干燥后即得粗环草石斛生物碱有效部位。
S3. 将S2所得粗环草石斛生物碱有效部位，加适量甲醇溶解、上Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱除糖，收集含纯净石斛宁斑点的馏分，浓缩干燥后即得石斛宁富集的环草石斛生物碱有效部位。
实施例2 环草石斛生物碱有效部位的制备
S1. 将1kg环草石斛用80%乙醇水溶液室温冷浸，料液比为10：1，超声波辅助提取，80 min/d，放置48h，过滤，将滤液浓缩，得环草石斛提取物；重复提取3次。
S2. 将S1所得的环草石斛提取物，加适量水溶解、上非极性大孔吸附树脂柱固相萃取，环草石斛提取物的干浸膏重量与大孔吸附树脂柱固定相床体积比为0.4kg ：1L，上样完毕，用6倍床体积的水洗脱，分离脂溶性部位，收集水洗脱液，浓缩干燥后即得粗环草石斛生物碱有效部位。
S3. 将S2所得粗环草石斛生物碱有效部位，加适量甲醇溶解、上Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱除糖，收集含纯净石斛宁斑点的馏分，浓缩干燥后即得石斛宁富集的环草石斛生物碱有效部位。
实施例3 环草石斛生物碱有效部位的石斛宁含量测定方法
环草石斛生物碱有效部位的石斛宁含量分析采用氢核磁共振定量分析技术。
1、具体方法
具体采用500MHz核磁共振仪，实验参数设置为：脉冲序列 zg30，谱宽 SW=14 ppm，中心频率 O1P=6 ppm，采样时间 AQ=3 s，采样点数 TD=41976，等待时间 D1=2 s，扫描次数NS=48，变换点数 SI=65536，定量峰选取石斛宁结构中的 g位 CH 质子峰。以水杨酸分子中芳环上质子为外标，－ERETIC2 法定量。
样品操作，准确称取干至恒重的环草石斛生物碱有效部位浸膏10mg，加入氘代甲醇，定溶至1mL，密闭容器，涡流溶解样品，离心沉降不溶固体，取上清液600μL入核磁管（5mm），立即进行核磁共振氢谱分析。平行3次操作。标准样品水杨酸进行同样操作。用ERETIC2 法测定水杨酸及环草石斛生物碱有效部位石斛宁含量。
2、结果
经过检测，实施例1和实施例2制得的环草石斛生物碱有效部位石斛宁含量分别占该有效部位总质量的35.6%和36.6%。本发明制备的环草石斛生物碱有效部位石斛宁含量可达35～40%。
而且，核磁共振氢谱显示，在制得的环草石斛生物碱有效部位中所含的生物碱只有石斛宁一种。
实施例4 环草石斛生物碱有效部位抗糖尿病和降脂作用
1、实验原理
db/db小鼠是典型的单基因突变导致II型糖尿病的动物模型（BKS.Cg-Dock7m +/+Leprdb/Nju），该系小鼠由4号常染色体瘦素受体( LEPR) 的Janus 蛋白酪氨酸激酶( JAK)基因位点发生突变衍生而来。db/db小鼠具肥胖、高血糖、高度胰岛素抵抗的自发性II型糖尿病特性，在C57BLKS背景下，能够观察到很多特征，比如血糖不受控制的增高，产生胰岛素的beta细胞缺失，外源胰岛素无法控制血糖浓度且糖异生作用酶活性升高。在C57BLKS-Leprdb纯合子中可以观察到外周神经病变和心肌病变，伤愈速度减慢，代谢增加等，是常用的研究II型糖尿病药物及机制的动物模型。
2、实验方法
db/db小鼠，5周龄，适应性饲养一周后，随机分为2组：模型组、给药组，每组8 只动物；另取C57小鼠8只作为正常对照组。给药组每天给予一定量的环草石斛生物碱有效部位水溶液，计量为石斛宁15mg /kg（实施例1-2制备），灌胃给药。模型组及正常对照组每天给予相应量的水，保持灌胃方式。给药时间9: 00～10: 00 am，每周给药7天，连续给药8周，每7天检测小鼠血糖值1次。实验期间小鼠自由进食、饮水。
血糖测试方法：采用试纸法。血糖仪型号：ACCU-CHEKPerforma。血糖试纸型号：ACCU-CHEKPerforma。
血脂测试方法：在给药第8周，取各组小鼠血清，采用试剂盒的方法分析小鼠血清总胆固醇及甘油三脂含量。所用试剂盒为南京建成总胆固醇（TC）测定试剂盒（单试剂GPO-PAP法）、甘油三酯（TG）测定试剂盒（单试剂GPO-PAP法）。
3、结果
小鼠每周血糖检测结果见表1，血清总胆固醇、甘油三脂测试结果见表2。
表1 环草石斛生物碱有效部位db/db小鼠体内降血糖实验：
注：*为给药组与模型组对比有显著性差异，P<0.05。
表2 环草石斛生物碱有效部位db/db小鼠体内降脂实验：
| 模型组 | 给药组 | 正常组 | |
| 总胆固醇（mmol/L) | 6.66 ± 0.75 | 5.17 ± 1.7* | 3.5 1 ± 0.62 |
| 甘油三酯（mmol/L） | 2.28 ± 0.40 | 1.76 ± 0.30* | 1.06 ± 0.35 |
注：*为给药组与模型组对比有显著性差异，P<0.05
根据表1的结果可以看出，给药组在给予石斛宁6周后的空腹血糖值与模型组相比，显著降低。同样的，根据表2的结果可以看出，给药组在给予石斛宁8周后的血清总胆固醇及甘油三脂含量与模型组相比，显著降低。
Claims (5)
1.一种具有降血糖和/或降血脂作用的环草石斛生物碱有效部位，其特征在于，生物碱石斛宁含量占该有效部位总质量的30%以上，由包含如下步骤的方法制备得到：
S1. 将环草石斛用亲水性有机溶剂-水的混合溶液作为提取液，进行提取，浓缩干燥后得到环草石斛提取物；
S2. 将S1所得的环草石斛提取物，使用C-18反相硅胶柱或非极性大孔吸附树脂柱去除脂溶性成份，浓缩干燥后得到粗环草石斛生物碱有效部位；
S3. 将S2所得粗环草石斛生物碱有效部位，再加甲醇溶解、经Sephadex LH-20柱除糖，甲醇洗脱，收集含石斛宁纯净斑点的馏分，进行石斛宁纯化，得到石斛宁富集的环草石斛生物碱有效部位。
2.根据权利要求1所述环草石斛生物碱有效部位，其特征在于，步骤S1中，以体积计，亲水性有机溶剂-水混合溶液中亲水性有机溶剂为甲醇/乙醇，含量占70%～80%：提取液体积与环草石斛原料的质量比，以mL/g计为8～10:1。
3.根据权利要求1所述环草石斛生物碱有效部位，其特征在于，步骤S2中，加甲醇或水溶解，使用C-18反相硅胶柱或非极性大孔吸附树脂柱去除脂溶性成份，用水洗脱。
4.根据权利要求1所述环草石斛生物碱有效部位，其特征在于，步骤S2中，C-18反相硅胶柱或非极性大孔吸附树脂柱的固定相的床体积与步骤S1所得环草石斛提取物的质量比，以mL/g计为1:0.4。
5.权利要求1～4任一所述环草石斛生物碱有效部位在制备治疗糖尿病和/或高血脂症的药物中的应用。
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-
2018
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| 环草石斛化学成分研究;李春燕等;《中山大学学报（自然科学版）》;20130531;第52卷(第3期);第73-76页，第73页右栏倒数第1-3行以及第74页左栏第一段、最后一段和右栏第1段、第2段倒数第1-5行以及第75页右栏第2段第1-7行和图1 * |
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