CN101195646A - 一种二苯乙烯苷提取物的制备方法 - Google Patents
一种二苯乙烯苷提取物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新的二苯乙烯苷的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)何首乌加乙醇，加热回流，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，得浓缩液或浸膏；(2)向浓缩液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液用乙酸乙酯萃取；(3)将萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。本发明提取方法所制备的提取物中，二苯乙烯苷的含量大于55％。本发明方法具有收率高、产品质量好、步骤简捷等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从植物中提取有效成分的方法，尤其涉及一种从何首乌中提取二苯乙烯苷的方法，属于中药领域。
背景技术
何首乌，为寥科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根。根据其炮制方法不同又有生首乌与制首乌之分。生首乌味苦、涩、性平，具有润肠、解毒、截疟之功效，用于肠燥便秘，痈疽瘰疬等症。制首乌味苦、甘、涩、性温，具有补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发之效，主要用于肝肾精血亏虚、头昏目眩、须发早白、腰膝酸软及遗精等症，历代《本草》有记载。成分主要有羟基蒽醌类化合物和糖苷类化合物，如二苯乙烯苷等，还有一些酰胺类化合物、色原酮类化合物以及卵磷脂等，糖苷类化合物含量最多的是二苯乙烯苷类化合物。何首乌有抗衰老、神经保护、抗炎免疫、促进生长发育等作用。
本发明人多年来以研究治疗神经退行性病变为主要研究方向，特别是从祖国传统中医中药中筛选治疗老年痴呆的新药，经过对大量中药的筛选，发现何首乌有较好的作用。进一步分析研究，发现了四羟基二苯乙烯苷(TSG)提取物在β-淀粉样蛋白(Aβ)致神经细胞损伤模型上具有明显的神经保护作用；在体外试验中TSG可明显抑制β-分泌酶的活性；在Aβ前体蛋白APP转基因小鼠、Aβ脑室注射模型、胆碱能神经元损伤大鼠模型、D-半乳糖小鼠模型和慢性脑缺血大鼠模型等拟痴呆动物模型上，TSG可明显提高学习记忆功能，减少脑内淀粉样斑块和Aβ的形成，降低β-分泌酶和γ-分泌酶含量，增高脑组织M受体亲和力，增强胆碱乙烯转移酶(ChAT)活性，抑制脂质过氧化和细胞浆内钙超载，提高总抗氧化能力，增加谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性，增强海马神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)和NGF的受体TrkA的表达。
现有二苯乙烯苷提取物的制备方法技术，采用水提取或者乙醇提取，浓缩，用硅胶柱层析，得率低，时间长，成本高，用本发明可以克服以上缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的二苯乙烯苷(二苯乙烯甙，全名为2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙)提取物的方法，该方法所制备的二苯乙烯苷提取物中，二苯乙烯苷的含量大于55％。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
一种二苯乙烯苷的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)何首乌加乙醇，加热回流，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，得浓缩液或浸膏；
(2)向浓缩液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液；
(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。
为了提取到更高含量的二苯乙烯苷，一种优选的二苯乙烯苷制备方法，包括以下步骤：
(1)将何首乌加6-12倍重量的40-95％乙醇，加热回流提取1-5次，每次1-4小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓缩至无醇味，得浓缩液；
(2)向浓缩液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液；
(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。
一种较优选的二苯乙烯苷制备方法是：
(1)将何首乌加6-12倍重量的40-90％乙醇，加热回流提取1-5次，每次1-4小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓缩至无醇味，得浓缩液；
(2)将浓缩液加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液；
(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，60-90℃温度下减压干燥，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。
一种进一步优选的二苯乙烯苷制备方法是：
(1)将何首乌加8倍重量60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓缩至相对密度为1.248(34℃)的浸膏；
(2)向浸膏中加水，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；
(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，80℃温度下减压干燥，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。
一种更优选的二苯乙烯苷制备方法，包括以下步骤：
(1)将何首乌加8倍重量60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓缩至相对密度为1.248(34℃)的浸膏；
(2)向浸膏中加水，使水的体积为浸膏体积的4-6倍搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；
(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥(80℃)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。
一种最优选的二苯乙烯苷制备方法，包括以下步骤：
(1)将何首乌加8倍重量60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓缩至相对密度为1.248(34℃)的浸膏；
(2)向浸膏中加水，使水的体积为浸膏体积的4-6倍搅匀，静置6小时，滤过，滤液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；
(3)将合并后的萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥(80℃)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷。
本发明进行了一系列的正交试验，最终摸索到了一种从何首乌中提取高含量的二苯乙烯苷的方法，使提取到的二苯乙烯苷的含量超过55％，符合《药品注册管理办法》中药、天然药物5类新药的规定。本发明得率高，用时少，成本低。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应当指出，这些实施例仅仅是本发明的例证，不应理解为对本发明的限制。
说明：
1、本发明中所述的术语“二苯乙烯苷”与术语“2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷”二者等同。
2、2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)的含量测定方法
避光操作，采用高效液相法(参照《中华人民共和国药典》2000版一部附录VID)。
①仪器与试药
仪器：美国Agilent1100型高效液相色谱仪，联想数字处理中心
试药：2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷标准品(供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号0844-9802，)。乙腈为色谱纯(美国Fisher)，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
②色谱条件 色谱柱：YWG-C18(4.6mm×250mm，10μm)反相柱，流动相：乙腈∶水(25∶75)，检测波长：320nm，流速1.0ml/min，柱温25℃[2]。
③工作曲线制作：
精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品2.31mg，置10ml量瓶中，稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为0.231mg/ml的对照品溶液。每次分别吸取6、8、10、12、14μl注入液相色谱仪，按上述条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样量为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程为：Y＝3523.7X-104.31，r＝0.9999
2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在1.386～3.234μg范围内呈线性关系。
实施例1
取何首乌20g，加6倍重量的95％乙醇，加热回流提取1次，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.1g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55％，提取率3.55％。
实施例2
取何首乌20g，加12倍重量的40％乙醇，加热回流提取5次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.2g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55％，提取率3.6％。
实施例3
取何首乌20g，加8倍重量体积60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，加水，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥(60-90℃)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.25g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55％，提取率3.62％。
实施例4
取何首乌20g，加8倍量60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.248(34℃)的浸膏，加入水，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥(80℃)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.35g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55％，提取率3.675％。
实施例5
取何首乌20g，加8倍量60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.248(34℃)的浸膏， 加入水使水的体积为浸膏体积的4倍，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥(80℃)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.4g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55％，提取率3.7％。
实施例6
取何首乌20g，加8倍量60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度为1.248(34℃)的浸膏，加入水使水的体积为浸膏体积的6倍，搅匀，静置6小时，滤过，滤液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，减压干燥(80℃)，粉碎成细粉，得到二苯乙烯苷7.6g，经测定，二苯乙烯苷含量大于55％，提取率3.8％。
对比试验例1
何首乌块根中含有二苯乙烯类化合物，被认为是何首乌的主要成分之一，其中有2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等。2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷能溶于水和醇，本试验分别将生何首乌进行了水提和醇提，以考察二者的优劣。
具体方法如下：
①水煎法：称取生何首乌150g，加入4倍水煎煮3次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩至50ml，再加6倍量水搅匀，离心去沉淀，上清液用醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯用量同上清液体积，合并萃取液，减压回收，浓缩并减压干燥，得干浸膏备用。
②乙醇回流：称取生何首乌150g，以60％乙醇回流提取3次，每次2小时，加醇量为药材量的4倍。滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味，浓缩至50ml，再加6倍量水搅匀，离心去沉淀，上清液用醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯用量同上清液体积，合并萃取液，减压回收，浓缩并减压干燥，得干浸膏备用。
③供试品溶液的制备：精密称取一定量的上述各样品，置于10ml容量瓶中，加稀乙醇超声处理5分钟使溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤进样。
按前述2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含测方法，测定2个样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。
由表1可知，乙醇回流法所提取的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)的含量明显要高于水煎煮法。
表1 不同提取方法提取四羟基二苯乙烯苷(TSG)数据表
| 提取方法 | 出膏率(％) | TSG含量(g) |
| 乙醇回流 | 3.37 | 3.58 |
| 水煎煮 | 1.60 | 1.74 |
试验例1 本发明最佳提取工艺考察试验
1、何首乌的最佳提取条件考察试验
称取生何首乌50g药材，共9份，按表2的因素水平，表3的提取条件分别进行正交试验(其中提取时间固定为2小时)，提取后滤液合并，量取体积，从中取出1ml滤液至10ml容量瓶中，加入稀乙醇至刻度，摇匀。按上述方法测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。并对结果进行方差分析，结果见表4。
表2 因素水平表
注：以D因素为误差项
表3 提取正交实验表
| 序号 | A | B | C | D | TSG的提取量(g) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1.265 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 1.568 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 1.696 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1.570 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 1.526 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 1.394 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 1.364 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 1.053 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 1.319 |
| Ij | 4.529 | 4.199 | 3.712 | 4.11 | |
| IIj | 4.490 | 4.147 | 4.457 | 4.326 | |
| IIIj | 3.736 | 4.409 | 4.586 | 4.319 | CT＝18.077 |
| Ij2 | 20.512 | 17.632 | 13.779 | 16.892 | |
| IIj2 | 20.160 | 17.198 | 19.865 | 18.714 | |
| IIIj2 | 13.958 | 19.439 | 21.031 | 18.653 | |
| R | 0.793 | 0.262 | 0.874 | 0.216 | |
| SSj | 0.133 | 0.013 | 0.148 | 0.010 |
表4 正交试验方差分析表
*：F0.10(2，2)＝9.00 **：F0.05(2，2)＝19.00
方差分析结果表明以提取出2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的量为指标，因素A、C有差异但均无显著性差异，B因素无差异，因此从正交表中应选A1B3C3，C因素是提取次数，C2、C3相差2.8％，考虑到工业生产热能消耗问题，应选择A1B3C2。故本发明确定生何首乌的提取条件为用60％的乙醇，8倍量，共提取3次。
取50g生何首乌药材，分别用8倍量的50％、60％、70％乙醇热回流提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，并量取体积，从中精密量取1ml至10ml容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，按前述方法测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。并对结果进行分析。由表5可知，以60％乙醇提取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)的含量和转移率最高，故进一步证实了采用乙醇提取何首乌时，乙醇的浓度为60％时，提取效果最好。
表5 不同醇浓度提取四羟基二苯乙烯苷(TSG)数据表
| 醇浓度 | 转移率(％) | TSG含量(g) |
| 50％ | 75.32 | 1.424 |
| 60％ | 89.09 | 1.684 |
| 70％ | 82.19 | 1.553 |
2、加热回流的最佳提取时间的工艺考察试验
分别取50g生何首乌药材，每次用8倍量的60％乙醇加热回流提取3次，一份提取时间分别为2h、1h、1h，另一份提取时间分别为2h、2h、1h，滤过，合并滤液，并量取体积，从中精密量取1ml至10ml容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，按上述方法测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。并对结果进行分析，结果见表6.
由表6可知，每次提取2h提出的2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)的含量比前两次提取2h，第三次提取1h的高出6.59％，故最佳提取时间应为每次2h。
表6 不同提取时间提取四羟基二苯乙烯苷(TSG)数据表
| 试验号 | 转移率(％) | TSG含量(g) |
| 1(2.1.1) | 77.41 | 1.463 |
| 2(2.2.1) | 83.23 | 1.573 |
| 3(2.2.2) | 89.09 | 1.684 |
3、最佳纯化工艺考察试验
为了进一步提高有效成分的含量和纯度，需将生何首乌的醇提物水沉后离心去沉淀，上清液再用醋酸乙酯萃取。
取405g何首乌药材，按上述最佳提取方法提取，将提取液合并，回收乙醇，浓缩到相当于生药材1∶3(ml/g)，即135ml，平均分成9份，按表7的因素水平进行正交试验，萃取后分别合并萃取液，量取体积，从中精密量取1ml滤液至10ml容量瓶中，将滤液放在水浴中蒸干，用稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(TSG)的含量。并对结果进行方差分析，结果见表8、9。
表7 因素水平表
注：以D因素为误差项
表8 水沉萃取正交实验含量测定表
| 序号 | A | B | C | D | TSG含量(g) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.703 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 0.810 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 0.875 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 0.862 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 0.969 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 0.795 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 0.949 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 0.892 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 1.040 |
| Ij | 2.388 | 2.514 | 2.390 | 2.712 | |
| IIj | 2.626 | 2.671 | 2.712 | 2.554 | |
| IIIj | 2.881 | 2.710 | 2.793 | 2.629 | CT＝6.926 |
| Ij2 | 5.703 | 6.320 | 5.712 | 7.395 | |
| IIj2 | 6.896 | 7.134 | 7.355 | 6.523 | |
| IIIj2 | 8.300 | 7.344 | 7.801 | 6.912 | |
| R | 0.493 | 0.196 | 0.403 | 0.158 | |
| SSj | 0.0405 | 0.0072 | 0.0303 | 0.0042 |
表9 正交试验含量测定方差分析表
*：F0.10(2，2)＝9.00 **：F0.05(2，2)＝19.00
由表9可知，因素A＞C＞B，因素B、C无差异，因素A有差异，但无显著性差异，因此综合考虑后，最优选的纯化条件为：稠浸膏加4～6倍的水(v/v)稀释，离心，上清液用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯的用量每次不少于药液的1.5倍。
Claims (8)
1.一种二苯乙烯苷的制备方法，包括以下步骤：
(1)向何首乌中加入乙醇，加热回流，提取液滤过，滤液回收乙醇并浓缩至无醇味，得浓缩液或浸膏；
(2)向浓缩液或浸膏中加水，搅匀，静置，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取，萃取液备用；
(3)将萃取液回收乙酸乙酯并浓缩至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。
2.按照权利要求1的制备方法，其特征是：步骤(1)中将何首乌加6-12倍重量的40-95％乙醇，加热回流提取1-5次，每次1-4小时。
3.按照权利要求2的制备方法，其特征是：步骤(1)中将何首乌加8倍重量的60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时。
4.按照权利要求1的制备方法，其特征是：步骤(2)向浓缩液或浸膏中加水，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取2-4次。
5.按照权利要求1的制备方法，其特征是：步骤(1)中将何首乌加8倍重量60％乙醇，加热回流提取3次，每次提取2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓缩至34℃测定时相对密度为1.248的浸膏。
6.按照权利要求1的制备方法，其特征是：步骤(1)中将何首乌加8倍重量60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，将回流提取液合并后滤过，滤液回收乙醇后，浓缩至34℃测定时相对密度为1.248的浸膏；步骤(2)中向浸膏加水时，使水的体积为浸膏体积的4-6倍，搅匀，静置4-12小时，滤过，滤液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取2-4次。
7.按照权利要求1的制备方法，其特征是：步骤(3)中将稠膏于60-90℃温度下减压干燥。
8.按照权利要求7的制备方法，其特征是：将稠膏于80℃温度下减压干燥。
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